CN104357363B - 假单胞菌株及其制备复合型表面活性剂的方法 - Google Patents

假单胞菌株及其制备复合型表面活性剂的方法 Download PDF

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Abstract

假单胞菌株及其制备复合型表面活性剂的方法，涉及一种微生物菌株及其制备活性剂的方法，菌株名称：假单胞菌（Pseudomonas sp.），2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC NO M）；保藏编号：CCTCC NO:M 2013570；本发明公开了一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）CCTCC NO:M2013570及其应用。本发明的菌株能在利用多种碳源进行发酵的过程中产生复合表面活性剂，即糖脂和含氨基酸类脂，该菌株及其发酵液和表面活性剂提取物在污水处理、土壤重金属污染治理、果蔬等食品抑菌防腐、洗涤日化等方面有良好的应用前景。使其可以发挥不同种生物表面活性剂的协同效应，且可在多种条件下发挥作用。

Description

假单胞菌株及其制备复合型表面活性剂的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物菌株及其制备活性剂的方法，特别是涉及一种假单胞菌株及其制备复合型表面活性剂的方法。
背景技术
生物表面活性剂是微生物在代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物，除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等表面活性剂的一般作用外，还具有化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等优点，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种假单胞菌株及其制备复合型表面活性剂的方法，利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570及其发酵液、发酵提取物应用于环境保护、日化洗涤、食品抑菌保鲜、农药生产、乳化稳定等领域，并可将该菌株与其他菌株进行联合使用或将其发酵产物与其他化合物进行复配使用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
假单胞菌株，所述菌株名称：假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201），2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC NO M）；保藏编号：CCTCC NO: M 2013570；其包括假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570、假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570的休止细胞、假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCCNO: M2013570的发酵液及其发酵液提取物；假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCCNO: M2013570及其发酵液和发酵提取物适用于石油、原油污水的处理及海洋原油污染的处理，以及油污容器、管道、器械的处理；假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO:M2013570及其发酵液和发酵提取物适用于餐厨废弃油脂、地沟油、含食用油污水、土壤和油污容器、器械的处理；假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570及其发酵液和发酵提取物适用于水体、土壤等的重金属污染的治理；利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570及其发酵液和发酵提取物适用于果蔬、食品的抑菌、防腐、保鲜；利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570发酵液和发酵提取物适用于洗涤、日化用品生产或做配料、辅料；利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570及其发酵液和发酵提取物作为乳化剂；利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570及其发酵液和发酵提取物适用于农药生产。
假单胞菌株制备复合型表面活性剂的方法，所述方法包括以下过程：
将保藏的菌种常规方法活化，复合发酵菌剂，其中含有假单胞菌CCTCC NO: MM2013570，之后将其接入液体种子培养基在30-37 ℃，150 r/min条件下培养18-24h，制备液体种子；将制得的液体种子转接入一级发酵罐中，制得一级发酵菌种；将一级发酵菌种转接入二级发酵罐中（接种量5%），在通气量0.75vvm,，搅拌转数160r/min条件下制得二级发酵菌种；将二级发酵菌种再转接入三级发酵罐中（接种量5%），在通气量0.75-1.0vvm,，搅拌转数160r/min条件下发酵培养48-72小时，即制得表面活性剂发酵液；如需分离表面活性剂，将发酵液在4000 r/min离心30min去菌体后，再将上清液后pH调至2.0，于4 ℃下静置8-12h，过滤留沉淀，洗涤后将其真空干燥；表面活性剂粗品产量可达30gL；
按照上述方法发酵制得的发酵液超滤去菌体后，用2 N NaOH溶液调整发酵液的pH值至8.0，8000 r/min离心15 min后，收集上清液；然后用6N的盐酸调整上清液的pH值至2.0，低温沉淀8-12小时；在4℃，10000r/min条件下离心15min，得到的沉淀用去离子水洗涤3次后真空冷冻干燥，得到保藏菌株的表面活性剂粗品；
将表面活性剂粗品溶解于氯仿后过硅胶柱，上样量不超过柱体积的1%。柱层析条件：300目硅胶Zcx-11100/200，常规方法活化后装柱，平衡；250 mL的氯仿对硅胶柱进行淋洗以除去样品中的中性脂，然后依次用100 mL 10:1（v/v）、100 mL 2:1（v/v）、100 mL l:1（v/v）和100 mL l:2（v/v）的氯仿和甲醇的混合溶液对硅胶柱进行淋洗，淋洗液流速为2mL/min；采用苯酚-硫酸法和紫外分光光度法检测分离物。
所述的假单胞菌株制备复合型表面活性剂的方法，所述种子培养基：葡萄糖10 g，牛肉膏2 g，K2HPO41 g，NaH2PO41 g，MgSO40.05 g，CaCl20.05 g，定容至1 L，pH 7.2-7.4。
所述的假单胞菌株制备复合型表面活性剂的方法，所述发酵培养基配方1：葡萄糖20 g，NaNO3 2 g，Na2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO40.05-0.1 g，FeSO40.01 g，定容至1 L，pH 7.0-7.4。
所述的假单胞菌株制备复合型表面活性剂的方法，所述发酵培养基配方2：地沟油50 g，NaNO3 2 g ，KH2PO4 0.5 g，K2HPO40.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.05 g，FeSO40.03g/L，定容至1 L，pH7.0-7.5。
所述的假单胞菌株制备复合型表面活性剂的方法，所述发酵培养基配方3：原油10g，KH2PO4 0.5 g，Na2HPO41.4 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O0.1 g，CaCl2·2H2O0.02 g，MnSO4·H2O 0.03 g，定容至1 L，pH7.0-7.5。
本发明的优点与积极效果是：
本发明所使用的假单胞菌能同时合成两种糖脂和一种含氨基酸类脂，使其可以发挥不同种生物表面活性剂的协同效应，且可在多种条件下发挥作用。
本发明涉及菌株的另一优势是不同于有些表面活性剂产生菌虽然生长可利用的碳源谱较宽，但表面活性剂合成的碳源谱较窄，而本发明的假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570在葡萄糖、石油烃、废弃食用油脂以及复合碳源条件下，均能合成生物表面活性剂。此外，假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO:M2013570对水体原油污染物和废弃油脂的降解率超过99.5%，高于目前文献报道的其他菌株的降解率。该菌所产表面活性剂具有良好的表面活性，可将水的表面张力从71.14 mN/m降低至27.22 mN/m，CMC值为 0.005 g/L，优于已知的生物表面活性剂；其HLB值为12，可作为O/W型乳化剂，有望部分替代常规化学表面活性剂应用于生产实践。
附图说明
图1为本发明假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570所产生物表面活性剂组分1的红外光谱；
图2为本发明假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570所产生物表面活性剂组分2的红外光谱；
图3为本发明假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570所产生物表面活性剂组分3的红外光谱。
具体实施方式
下面结合附图所示实施例，对本发明作进一步详述。
实施例1：利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570的发酵液应用于需要处理的水体、土壤、管道器材，或与其他微生物或化合物同时使用。
将保藏的菌种常规方法活化，之后接入液体种子培养基中，在30-37 ℃，150 r/min条件下培养18-24h，制备液体种子，接种量为每250mL培养基接入一环，；将制得的液体种子转接入一级发酵罐中（接种量5%），在通气量0.75-1.0vvm,，搅拌转数160r/min条件下制得一级发酵菌种；将一级发酵菌种转接入二级发酵罐中（接种量5%），在通气量0.75-1.0vvm,，搅拌转数160r/min条件下制得二级发酵菌种；将二级发酵菌种再转接入三级发酵罐中（接种量5%），在通气量0.75-1.0vvm,，搅拌转数160r/min条件下发酵培养48-72小时，即制得表面活性剂发酵液。该发酵液可去菌体或不去菌体施用于原油、食用油脂污染的水体、土壤等处，或与其他微生物或化合物同时使用。在34 ℃条件下处理5 d，该菌株菌株LJ2对质量浓度为2 g/L的水体石油污染物的降解率高达99.5 %。
斜面培养基：葡萄糖16 g，蛋白胨8 g，酵母浸粉0.1 g，琼脂20 g，定容至1 L，pH值为7.0-7.4。
种子培养基：葡萄糖10 g，牛肉膏2 g，K2HPO42 g，NaH2PO42 g，MgSO40.5 g，CaCl20.05 g，定容至1 L，pH值为7.0-7.4。
发酵培养基配方1：葡萄糖20 g，NaNO3 2 g，Na2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO40.05-0.1 g，FeSO40.01 g，定容至1 L，pH 7.0-7.4。
发酵培养基配方2：地沟油50 g/L，NaNO3 2 g ，KH2PO4 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.05 g，FeSO40.03g/L，定容至1 L，pH7.0-7.5。
发酵培养基配方3：原油10 g/L，KH2PO4 0.5 g，Na2HPO41.4 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O0.1 g，CaCl2·2H2O0.02 g，MnSO4·H2O 0.03 g，定容至1 L，pH7.0-7.5。
具体实施例2：利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570的液体菌种直接接种于需要处理的水体、土壤、管道器材，或与其他微生物或化合物同时使用。
将保藏的菌种常规方法活化，之后接入液体种子培养基中，在30-37 ℃，150 r/min条件下培养18-24h，制备液体种子，接种量为每250mL培养基接入一环；将制得的液体种子转接入一级发酵罐中（接种量5%），在通气量0.75-1.0vvm,，搅拌转数160r/min条件下制得一级发酵菌种；将一级发酵菌种转接入二级发酵罐中（接种量5%），在通气量0.75-1.0vvm,，搅拌转数160r/min条件下制得二级发酵菌种；将二级扩繁的液体种子液施用于原油、食用油脂污染的水体、土壤等处，或与其他微生物或化合物同时使用。在34 ℃条件下处理5 d，该菌株菌株LJ2对质量浓度为2 g/L的水体石油污染物的降解率高达99.5 %。
斜面培养基：葡萄糖16 g，蛋白胨8 g，酵母浸粉0.1 g，琼脂20 g，定容至1 L，pH值为7.0-7.4。
种子培养基：葡萄糖10 g，牛肉膏2 g，K2HPO42 g，NaH2PO42 g，MgSO40.5 g，CaCl20.05 g，定容至1 L，pH值为7.0-7.4。
具体实施例3：利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570的斜面菌种直接施用于需要处理的水体、土壤、管道器材，或与其他微生物或化合物同时使用。
将保藏的菌种按照常规方法活化，之后将菌苔洗入0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，加玻璃珠振荡分散。调整菌浓度至109-1010/mL后，将种子缓冲液施用于原油、食用油脂污染的水体、土壤等处，或与其他微生物或化合物同时使用。
斜面培养基：葡萄糖16 g，蛋白胨8 g，酵母浸粉0.1 g，琼脂20 g，定容至1 L，pH值为7.0-7.4。
具体实施例4：假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570所产生物表面活性剂的分离提取。
按照上述方法发酵制得的发酵液超滤去菌体后，用2 N NaOH溶液调整发酵液的pH值至8.0，8000 r/min离心15 min后，收集上清液；然后用6N的盐酸调整上清液的pH值至2.0，低温沉淀8-12小时；在4℃，10000r/min条件下离心15min，得到的沉淀用去离子水洗涤3次后真空冷冻干燥，得到保藏菌株的表面活性剂粗品。
将表面活性剂粗品溶解于氯仿后过硅胶柱，上样量不超过柱体积的1%。柱层析条件：300目硅胶Zcx-11100/200，常规方法活化后装柱，平衡；250 mL的氯仿对硅胶柱进行淋洗以除去样品中的中性脂，然后依次用100 mL 10:1（v/v）、100 mL 2:1（v/v）、100 mL l:1（v/v）和100 mL l:2（v/v）的氯仿和甲醇的混合溶液对硅胶柱进行淋洗，淋洗液流速为2mL/min；采用苯酚-硫酸法和紫外分光光度法检测分离物。
具体实施例5：假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570所产生物表面活性剂的表面性能。
上述方法提取的假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570所产生物表面活性剂可将水的表面张力从71.14 mN/m降低至27.22 mN/m，CMC值为 0.005 g/L，优于已知的生物表面活性剂；其HLB值为12，可作为O/W型乳化剂。
具体实施例6：假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570所产生物表面活性剂或该表面活性剂与其他防腐剂复配用于果蔬等食品抑菌防腐。
将假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570按照上述方法所产的表面活性剂粗品配制成0.1g/L的溶液（含拙霉多糖5g/L），喷洒在待保鲜的草莓等浆果表面或浸果，对引起果蔬腐烂的纯黄丝衣霉（Byssochlamys fulva）有一只作用。此外，还对果蔬表面沾染的大肠杆菌（E.coli）有抑制作用。上述溶液可加入其他防腐剂或抑菌物质。
具体实施例7：利用假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570的发酵液或发酵液提取物用于农药制造。
将假单胞菌（Pseudomonas sp.HDLJ201）CCTCC NO: M2013570所产生物表面活性剂按照常规农药配制方法调配乳浊液，适用于有机磷和有机氯农药。

Claims (1)

1.假单胞菌株，其特征在于，所述菌株名称：假单胞菌（Pseudomonas sp. ）HDLJ201，2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO: M 2013570。
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