CN106755174B - 一种利用粘质沙雷氏菌ns-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法 - Google Patents
一种利用粘质沙雷氏菌ns-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106755174B CN106755174B CN201510813991.XA CN201510813991A CN106755174B CN 106755174 B CN106755174 B CN 106755174B CN 201510813991 A CN201510813991 A CN 201510813991A CN 106755174 B CN106755174 B CN 106755174B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipopolysaccharide
- serratia marcescens
- strain
- carrying
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 30
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 27
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 21
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 17
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 11
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 10
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 9
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 9
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 8
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 claims description 5
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 19
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 19
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 17
- 239000000049 pigment Substances 0.000 abstract description 14
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 abstract description 12
- 240000008397 Ganoderma lucidum Species 0.000 abstract description 9
- 235000001637 Ganoderma lucidum Nutrition 0.000 abstract description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 9
- HCOLPNRPCMFHOH-UHFFFAOYSA-N Prodigiosin Natural products CCCCCC1C=C(C=C/2N=C(C=C2OC)c3ccc[nH]3)N=C1C HCOLPNRPCMFHOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- KSSNXJHPEFVKHY-UHFFFAOYSA-N phenol;hydrate Chemical compound O.OC1=CC=CC=C1 KSSNXJHPEFVKHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- TWFGRJUTAULJPZ-USZBIXTISA-N prodigiosin Chemical compound N1=C(C)C(CCCCC)=C\C1=C/C1=NC(C=2[N]C=CC=2)=C[C]1OC TWFGRJUTAULJPZ-USZBIXTISA-N 0.000 abstract description 6
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 abstract description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 abstract description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 abstract description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 5
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- -1 prodigiosin polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010019727 Hepatitis acute Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000029082 Pelvic Inflammatory Disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000035614 depigmentation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009920 food preservation Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种利用粘质沙雷氏菌NS‑17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，先菌种活化、种子培养、发酵培养、细胞收集、细胞破壁，再脂多糖提取。本发明从土壤中筛选得到的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens NS‑17)在30℃培养时产色素灵菌红素，在37℃培养时不产灵菌红素。本发明通过严格控制培养温度，使用简单培养基，32h培养后离心收集菌体，反复冻融法破壁后用酚水法提取多糖，乙醇沉淀后用梯度浓度乙醇和丙酮洗涤，随后真空冷冻干燥得到具有显著抑菌活性的脂多糖。本发明生产的灵杆菌多糖对多种微生物尤其是金黄色葡萄球菌有显著的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物制剂的技术领域，尤其是一种利用一株条件产色素的粘质沙雷氏菌NS-17生产具有抑菌活性脂多糖的生产工艺。
背景技术
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是革兰氏阴性细菌，可用于生产两种重要的生物活性物质：灵菌红素和灵杆菌多糖。灵菌红素是一种正处于临床试验阶段的新型抗肿瘤药物；而灵杆菌多糖是一种具有升高白细胞、提高机体特异性免疫、抑肿瘤、抗感染等生物活性的脂多糖，临床主要用于各种原因引起的白细胞减少症、乙型肝炎及急慢性盆腔炎等疾病的辅助治疗。
目前市场上的灵杆菌多糖产品均为注射用针剂，用于升高白细胞，提高机体免疫力，而没有专门用于抑菌的产品，鉴于灵杆菌多糖良好的生物安全性，开发具有显著抑菌效果的灵杆菌多糖对抗菌药物研发、食品防腐等领域具有重要意义。此外，目前用于灵杆菌多糖生产的粘质沙雷氏菌多不产色素（灵菌红素），以避免增加色素去除的工艺步骤，保持较高的收率，保障产品质量。但有研究表明，临床分离的菌株多不产色素，产色素菌株多从环境中分离得到，表明粘质沙雷氏菌的致病性与其是否产色素有一定的关联，使用产色素的粘质沙雷氏菌生产灵杆菌多糖具有较高的生物安全性，环境污染威胁较小，但存在生产工艺复杂，收率低，成本高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，是利用条件性产色素的粘质沙雷氏菌生产具有抑菌效果的灵杆菌多糖的方法，该灵杆菌多糖对多种微生物尤其是金黄色葡萄球菌有显著的抑制效果。
为了达成上述目的，本发明的技术方案如下：
一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其步骤是：
步骤1、菌种活化；取4℃保藏的斜面菌种粘质沙雷氏菌NS-17菌株接种于营养琼脂（牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂 15g/L；pH 7.0-7.2）斜面，37±0.5℃培养24h；
步骤2、种子培养；步骤1的37℃活化培养24h的斜面菌种接种至液体种子培养基（甘油 4g/L，蛋白胨 16g/L，NaCl 3g/L，KCl 4g/L；pH 7.0），接种前，种子培养基于40℃培养箱或水浴锅保温，接种时应尽量缩短操作时间，避免培养基冷却；使用250mL锥形瓶装液50mL或500mL锥形瓶装液100mL或1L锥形瓶装液200mL或3L锥形瓶装液600mL；接种后于37℃，200rpm下培养16h，得种子液；
步骤3、发酵培养；发酵罐中按罐容积的70%装液量装入发酵培养基（麦芽糖 6g/L，蛋白胨 12g/L，NaCl 1g/L，KCl 2g/L，pH 7.5），121℃蒸汽灭菌20min，冷却至37℃接种培养基体积的3%～6%的步骤2种子液，37℃培养，根据溶氧控制搅拌转速与通气量，初始通气量为0.5 V/V·min，5L或10L罐初始搅拌转速为200rpm，50L以上发酵罐带变速时初始搅拌速度为100rpm，随溶氧的降低交替加大通气量与搅拌转速，控制溶氧大于25%，最大通气量为1V/V·min，控制发酵液pH为7.5±0.5；
步骤4、细胞收集；发酵培养32h后迅速离心收集细胞，干冰非接触式迅速降温至5℃；
步骤5、细胞破壁；取降温后的菌泥按质量/体积比（W/V）1:3的比例加入蒸馏水，混合均匀后循环流过80℃/-20℃高低温管，5个循环后完成破壁；
步骤6、脂多糖提取；破壁后的菌液加入等体积的质量百分比浓度（W/W）为45%的苯酚水溶液，混合搅拌10min后再加入等体积的质量百分比浓度（W/W）为95%的苯酚水溶液，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相；70℃减压蒸馏浓缩后再次加入等体积的质量百分比浓度（W/W）为45%的苯酚水溶液，重复上述步骤，二次减压蒸馏浓缩液降温后，加入5倍浓缩体积的冰乙醇沉淀，6h后离心收集沉淀，先后用体积百分比浓度为（V/V）80%的乙醇、体积百分比浓度为（V/V）90%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤后真空冷冻干燥得到脂多糖。
本发明的关键在于：1. 全程严格控制温度，避免细胞在20-33℃之间的温度存活从而产生色素；2. 高低温管循环破壁；3. 本步骤的提取工艺。
采用上述方案后，本发明从土壤中筛选得到的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens NS-17)在30℃培养时产色素灵菌红素，在37℃培养时不产灵菌红素，得到的细胞不含色素。本发明通过严格控制培养温度，使用简单培养基，32h培养后离心收集菌体，反复冻融法破壁后用酚水法提取多糖，乙醇沉淀后用梯度浓度乙醇和丙酮洗涤，随后真空冷冻干燥得到具有显著抑菌活性的脂多糖。
本发明的有益效果是：一、提供了一种具有显著抑菌活性的灵杆菌多糖的生产工艺，工艺流畅，切实可行，所得到的脂多糖具有广谱抗菌效果，尤其是对金黄色葡萄球菌具有显著抑制效果；二、去除了脱色素的步骤，通过严格控制培养温度，使条件产色素的菌株NS-17不产色素，简化了提取工艺，有利于降低生产成本。三、细胞破壁时使用高低温管循环破壁法，效果好、成本低、速度快。
附图说明
图1为Serratia marcescens NS-17破壁细胞抑菌圈，其中受试菌为金黄色葡萄球菌，平板中间固体为Serratia marcescens NS-17细胞破壁后的离心沉淀物；
图2为脂多糖水溶液抑菌效果，其中受试菌为金黄色葡萄球菌，1#牛津杯中为0.5mg/mL的脂多糖水溶液；2#牛津杯中为蒸馏水；3#牛津杯中为1mg/mL的脂多糖水溶液；4#牛津杯中为1mg/mL的糊精水溶液，其中糊精经二次苯酚水提取、醇沉、梯度乙醇与丙酮洗涤、真空冷冻干燥，以排除操作中污染物造成的干扰。
具体实施方式
本发明严格控制培养温度在37±0.5℃，Serratia marcescens NS-17经液体通气深层发酵后32h后快速离心收集细胞，通过高低温管循环破壁后利用酚水法提取脂多糖，所得到的脂多糖水溶液经减压蒸馏浓缩后用酚水法再次提纯，初步纯化后的脂多糖水溶液加入冰乙醇沉淀，沉淀用梯度浓度乙醇和丙酮洗涤后真空冷冻干燥得到脂多糖，所得的脂多糖具有广谱抗菌效果，尤其是对金黄色葡萄球菌具有显著抑制效果。
其中：培养过程中，包括斜面活化、种子培养与发酵过程中均严格控制培养温度在37±0.5℃，所得到的细胞不产色素，产品纯化操作简单易行。
离心收集的细胞通过高低温管循环破壁，使用原理为冻融法破壁，但和常规的冻融法不同，采用高低温管循环破壁法，处理量大，效果好，处理时间短，适合于除酶以外的生物活性产品的工业生产。
得到的脂多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、酿酒酵母和黑曲霉均具有抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著。
实施例一：5L发酵罐生产灵杆菌多糖。
取4℃保藏的斜面菌种接种于营养琼脂斜面，37℃培养24h后迅速接种至液体种子培养基，接种前，种子培养基于40℃培养箱保温。使用250mL锥形瓶装液50mL。接种后于37℃，200rpm下培养16h。经检测合格的种子液接种至5L发酵罐中，灭菌前发酵罐装液量为3.2L，121℃蒸汽灭菌20min，冷却至37℃接种100mL种子液，37℃培养，初始通气量为100L/h，初始搅拌转速为200rpm，随溶氧的降低交替加大通气量与搅拌转速，最大通气量为210L/h，最大搅拌速度为700rpm。控制发酵液pH为7.5±0.5。
发酵培养32h后，8000rpm离心10min，收集得到细胞约80g，容器中放入干冰，迅速降温，干冰不与细胞直接接触。降温后的菌泥加入240mL蒸馏水，混合均匀后循环流过80℃/-20℃高低温管，5个循环后完成破壁。
破壁后的菌液加入45%苯酚水溶液约320mL，混合搅拌10min后再加入95%苯酚水溶液640mL，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相。70℃减压蒸馏浓缩至60mL后再次加入45%苯酚水溶液60mL，混合搅拌10min后再加入95%苯酚水溶液120mL，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相，70℃减压蒸馏浓缩至50mL，冷却至室温后，加入4℃冰乙醇250mL于4℃冰箱沉淀，6h后离心收集沉淀，沉淀先后分别用80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇、丙酮各20mL洗涤后真空冷冻干燥，得到脂多糖0.107g。
实施例二：50L发酵罐生产灵杆菌多糖。
取低温保藏的斜面菌种接种于营养琼脂斜面，37℃培养24h后迅速接种至液体种子培养基，接种前，种子培养基于40℃培养箱保温。使用1L锥形瓶装液200mL。接种后于37℃，200rpm下培养16h。经检测合格的种子液接种至50L发酵罐中，灭菌前发酵罐装液量为33L，121℃蒸汽灭菌20min，冷却至37℃接种1.6L种子液，37℃培养，初始通气量为18L/min，初始搅拌转速为100rpm，随溶氧的降低交替加大通气量与搅拌转速，最大通气量为35L/min，最大搅拌速度为300rpm。控制发酵液pH为7.5±0.5。
发酵培养32h后，8000rpm离心10min，收集得到细胞约790g，容器中放入干冰，迅速降温，干冰不与细胞直接接触。降温后的菌泥加入2370mL蒸馏水，混合均匀后循环流过80℃/-20℃高低温管，5个循环后完成破壁。
破壁后的菌液加入45%苯酚水溶液约3160mL，混合搅拌10min后再加入95%苯酚水溶液6320mL，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相。70℃减压蒸馏浓缩至600mL后再次加入45%苯酚水溶液600mL，混合搅拌10min后再加入95%苯酚水溶液1200mL，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相，70℃减压蒸馏浓缩至500mL，冷却至室温后，加入4℃冰乙醇2.5L于4℃冰柜沉淀，6h后离心收集沉淀，沉淀先后分别用80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇、丙酮各100mL洗涤后真空冷冻干燥，得到脂多糖1.17g。
实施例三：抑菌实验。
选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母和白色念珠菌作为受试菌，考察Serratia marcescens NS-17所产的灵杆菌多糖对不同菌种的最低抑菌浓度（MIC），其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌使用市售MH肉汤培养基，pH7.2～7.4；黑曲霉、酿酒酵母和白色念珠菌使用市售液体沙氏培养基。受试菌斜面活化后刮取菌苔，分别用两种培养基稀释至约1×106CFU/mL，其中黑曲霉取孢子稀释。
取实施例二中所得的灵杆菌多糖，分别用上述两种培养基配制3200μg/mL的溶液，用相应的培养基稀释至640、320、160、80、40、20、10μg/mL，以及1个空白对照。取受试菌稀释液1mL，分别加入1mL梯度浓度的灵杆菌多糖溶液，所得培养液中灵杆菌多糖浓度分别为320、160、80、40、20、10、5μg/mL。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在35℃培养20h；白色念珠菌和黑曲霉在35℃培养48h，酿酒酵母在35℃培养24h，均以100%抑制生长为判断标准，检测最低抑菌浓度，实验结果如表1所示。
表1 最低抑菌浓度实验结果
| 受试菌 | 大肠杆菌 | 金黄色葡萄球菌 | 枯草芽孢杆菌 | 白色念珠菌 | 酿酒酵母 | 黑曲霉 |
| MIC(μg/mL) | 80 | 40 | 80 | 80 | 160 | 320 |
Serratia marcescens NS-17所产的脂多糖对六种受试菌均表现出良好的抑菌效果，尤其是对金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用。
Claims (5)
1.一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其特征在于步骤是：
步骤1、菌种活化；取4℃保藏的斜面菌种粘质沙雷氏菌NS-17菌株接种于营养琼脂斜面，37±0.5℃培养24h；
步骤2、种子培养；步骤1的37℃活化培养24h的斜面菌种接种至液体种子培养基，接种前，种子培养基于40℃培养箱或水浴锅保温，接种后于37℃，200rpm下培养16h，得种子液；
步骤3、发酵培养；发酵罐中按罐容积的70%装液量装入发酵培养基，121℃蒸汽灭菌20min，冷却至37℃接种培养基体积的3%～6%的步骤2种子液，37℃培养，控制搅拌转速与通气量，使溶解氧不低于25%，控制发酵液pH为7.5±0.5；
步骤4、细胞收集；发酵培养32h后迅速离心收集细胞，干冰非接触式迅速降温至5±5℃；
步骤5、细胞破壁；取降温后的菌泥按质量/体积比W/V1:3的比例加入蒸馏水，混合均匀后循环流过80℃/-20℃高低温管，5个循环后完成破壁；
步骤6、脂多糖提取；破壁后的菌液加入等体积的质量百分比浓度W/W为45%的苯酚水溶液，混合搅拌10min后再加入等体积的质量百分比浓度W/W为95%的苯酚水溶液，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相；70℃减压蒸馏浓缩后再次加入等体积的质量百分比浓度W/W为45%的苯酚水溶液，重复上述步骤，二次减压蒸馏浓缩液降温后，加入5倍浓缩体积的冰乙醇沉淀，6h后离心收集沉淀，先后用体积百分比浓度为V/V80%的乙醇、体积百分比浓度为V/V90%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤后真空冷冻干燥得到脂多糖。
2.根据权利要求1所述的一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其特征在于：步骤1的营养琼脂为牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂 15g/L，pH 7.0-7.2。
3.根据权利要求1所述的一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其特征在于：步骤2的液体种子培养基为甘油 4g/L，蛋白胨 16g/L，NaCl 3g/L，KCl 4g/L，pH 7.0。
4.根据权利要求1所述的一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其特征在于：步骤3的发酵培养基为麦芽糖 6g/L，蛋白胨 12g/L，NaCl 1g/L，KCl 2g/L，pH 7.5。
5.根据权利要求1所述的一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其特征在于：步骤3根据溶氧控制搅拌转速与通气量的方法是：初始通气量为0.5 V/V·min，5L或10L罐初始搅拌转速为200rpm，50L以上发酵罐带变速时初始搅拌速度为100rpm，随溶氧的降低交替加大通气量与搅拌转速，控制溶氧大于25%，最大通气量为 1V/V·min，控制发酵液pH为7.5±0.5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510813991.XA CN106755174B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种利用粘质沙雷氏菌ns-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510813991.XA CN106755174B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种利用粘质沙雷氏菌ns-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106755174A CN106755174A (zh) | 2017-05-31 |
| CN106755174B true CN106755174B (zh) | 2020-02-21 |
Family
ID=58886176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510813991.XA Expired - Fee Related CN106755174B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 一种利用粘质沙雷氏菌ns-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106755174B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106983903B (zh) * | 2017-06-05 | 2020-05-22 | 厦门华厦学院 | 具有酸碱指示功能的湿性敷料及其制备方法 |
| CN109880772B (zh) * | 2019-03-29 | 2020-12-08 | 贵州医科大学 | 一种幽门螺杆菌菌株分离培养的方法 |
| CN114431290B (zh) * | 2022-01-13 | 2023-09-29 | 齐鲁工业大学(山东省科学院) | 一种灵菌红素食品复合保鲜剂的制备方法及其应用 |
| WO2024151817A1 (en) * | 2023-01-12 | 2024-07-18 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Serratia anticancer polysaccharide compositions and methods |
-
2015
- 2015-11-23 CN CN201510813991.XA patent/CN106755174B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 灵杆菌脂多糖的发酵、分离及抑菌活性研究;王娟;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20140315(第3期);A006-183 * |
| 神灵杆菌脂多糖制备工艺研究及质量研究;邹积宏;《黑龙江医药 》;20090515;第22卷(第3期);297-300 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106755174A (zh) | 2017-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107245457B (zh) | 一种铁皮石斛内生真菌菌株及其产生的胞外多糖以及该胞外多糖的提取方法与应用 | |
| CN106755174B (zh) | 一种利用粘质沙雷氏菌ns-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法 | |
| CN103898011B (zh) | 一种甲基营养菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法 | |
| CN109486733B (zh) | 一株具有溶藻能力的交替单胞菌及其对东海原甲藻的应用 | |
| CN104845896B (zh) | 生产威兰胶的菌株及方法 | |
| CN109897788B (zh) | 一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用 | |
| CN104087628A (zh) | 一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法 | |
| CN101993847B (zh) | 一种细菌纤维素菌株 | |
| CN104928220A (zh) | 一株海洋污泥来源的水莱茵海默氏菌菌株及其应用 | |
| CN102417896A (zh) | 一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 | |
| CN104745654B (zh) | 一种制备尼莫克汀的方法及其生产菌株 | |
| CN103865850B (zh) | 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 | |
| CN104004693B (zh) | 一种短小芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用 | |
| CN108823266B (zh) | 一种采用发酵的方法制备几丁质的方法 | |
| CN114752518B (zh) | 地衣芽孢杆菌xcl-09及其应用 | |
| CN105586293A (zh) | 一种新的乳酸利用梭菌及其用途 | |
| CN112094762B (zh) | 一株葡萄牙棒孢酵母菌株及其应用 | |
| CN113322192B (zh) | 一种黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN115725420A (zh) | 一株产黄酮类化合物的工业大麻内生真菌及其应用 | |
| CN116218683A (zh) | 一种高山被孢霉及其在三七生物防治以及促生中的应用 | |
| CN112143669B (zh) | 一株蓝菌藻及其培养方法和应用 | |
| CN104073453A (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用 | |
| CN104004692B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用 | |
| CN111321105B (zh) | 利用乙酰氨基葡萄糖提高酵母抑制果实病害效力的方法 | |
| CN113337403A (zh) | 一种球毛壳菌hjf 13菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200221 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |