CN101157903A - 一种β-甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种β－甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法。β－甘露聚糖酶的产生菌分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp.，其保藏登记号为：CGMCC No.2078。该菌株所产β－甘露聚糖酶粗酶液酶反应的最适pH为4.5－6.5左右，最适温度为65℃，具有较好的pH稳定性和热稳定性，在不同的pH条件下保温1h后，在pH4.0－6.0的范围内，酶活性均维持在80％以上。在65℃下处理15min，其剩余酶活还有70％以上。相比较而言，比已报道的β－甘露聚糖酶有较好的反应温度和pH。

Description

一种β-甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种β-甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法。

背景技术

β-甘露聚糖酶(β-mannanase)又称β-1，4-D-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan-mannanohydrolase，EC.3.2.1.78)，是一类能够水解含有β-1，4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖的内切酶，属于半纤维素酶类。并且是具有纤维素酶活性的广谱诱导酶，广泛存在于自然界中，包括植物，如某些豆类植物(长豆角、瓜儿豆等)发芽的种子中，以及天南星科植物魔芋萌发的球茎中；动物如海洋软体动物的肠道分泌液中都发现了β-甘露聚糖酶活性的存在。而微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源，如细菌中的芽孢杆菌、假单孢菌、弧菌，真菌中的曲霉、梭孢菌以及放线菌^[6]都有所报道。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活性高、成本低、提取方便以及比动植物更广的作用pH、温度范围和底物专一性的显著特点，已在工业化生产和理化研究中得到了广泛的应用。

β-甘露聚糖酶分解线状或分枝的甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖，生成甘露寡糖(Mannose Oligosaccharide MOS)。甘露寡糖等功能性低聚糖具有低甜度、低热量、稳定性好等特点，此外还可促进有益菌增殖、吸附病原菌、改善肠道微生态，提高机体免疫力，甘露寡糖已经作为一种新型的饲料添加剂用于动物的养殖。魔芋精粉中含有丰富的甘露聚糖，约占70～85％，是5个葡萄糖分子和8个甘露糖分子构成的聚合体。我国又是魔芋生产大国，这无疑是魔芋成为制备甘露寡糖最优良的原料，随着甘露寡糖在饲料业中的需求越来越大，如何高效的获得甘露寡糖日益受到科研工作者的关注，而甘露寡糖的制备与β-甘露聚糖酶的酶活及其作用条件有着密切的关系，因此，从自然界中筛选产酶较高的菌株和研究甘露寡糖的制备条件是关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-甘露聚糖酶的产生菌及其制备方法，以及用该菌生产β-甘露聚糖酶的方法。

本发明的技术方案为：β-甘露聚糖酶的产生菌分类命名为：芽孢杆菌(Bacillus sp)，其保藏登记号为：CGMCC No.2078，保藏日期为：2007年7月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

1、菌株的分离

采集魔芋种植地中的土样加入至富集培养基中，以魔芋精粉做为唯一碳源于37℃富集72小时；取土样上清液于试管中，按常规稀释梯度稀释后在筛选平板上进行平板涂布分离稀释，于恒温培养箱中37℃培养24小时；在分离平板中滴加浓度为1％的刚果红溶液适量，挑取有淡黄色透明圈者，划线分离纯化，37℃培养24小时，纯化2-3次；纯化后将其菌株接入液体发酵培养基摇瓶发酵，进一步初筛和复筛，最终分离筛选到分解利用魔芋精粉能力强、产β-甘露聚糖酶酶活高的菌株CD-6(自命名)。本菌株的16SrRNA基因见说明书的系列表。

该菌株接种到已灭菌的含魔芋精粉的液体发酵培养基中(含魔芋精粉发酵培养经灭菌后为粘稠状固体，未接种菌株的魔芋精粉的液体发酵培养基作为对照)，将它们同时置于37℃，200r/min条件下发酵24小时后，接种该菌株的发酵培养基魔芋精粉有粘稠状固体变成非粘稠状液体，这是由于该菌株产生的β-甘露聚糖酶将培养基中的甘露聚糖降解为甘露寡糖，使其粘性降低，而对照液体发酵培养基中不接种此菌，故魔芋精粉培养基仍是粘稠状固体。

分离筛选所用培养基为：

富集培养基：(g/L)魔芋精粉20，KH₂PO₄0.5，pH自然；

分离培养基：(g/L)魔芋精粉5.0，酵母膏2.0，蛋白胨10，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄·6H₂O0.12，琼脂20.0，pH自然；

双层平板筛选培养基：(g/L)上层：魔芋精粉2，下层：酵母膏1，蛋白胨10，pH自然；

发酵培养基(g/L)：魔芋精粉20.0，酵母粉5.0，NaNO₃5.0，MgSO₄·6H₂O 0.2，K₂HPO₄5.0，pH自然。

2、菌株的初步鉴定：

根据《常见细菌系统鉴定手册》以及《微生物学实验手册》对其进行形态特征、培养特征，生理生化测定等方面的初步鉴定。

菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有荚膜。能在20～60℃温度范围内生长，最适生长温度为37～50℃，生长pH是5～11，最适生长pH为7～8。能水解淀粉，能耐7％的NaCl生长，硝酸盐还原、过氧化氢酶测定、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、亚硝酸盐还原、明胶液化、甲基红实验、酪素水解结果为阳性，硫化氢实验、吲哚实验结果为阴性。该菌株经鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

3、菌株的发酵：

将种子培养液接入装有30ml魔芋精粉发酵培养基的250ml三角瓶中，置于迥转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200r/min，37℃发酵24小时。发酵液离心，取上清液，即为β-甘露聚糖酶，置于4℃保存。所用培养基为：

种子培养基(g/L)：氯化钠10，蛋白胨10，酵母膏5，琼脂20。

发酵培养基(g/L)：魔芋精粉20.0，酵母膏5.0，K₂HPO₄5g，MgCl₂·6H₂O0.2，NaNO₃5.0，pH5.5。

4、酶活测定方法(DNS法)和粗酶酶学性质：

1)DNS法测定酶活

取干净试管用蒸馏水洗两次，于20mL试管A，B中，分别加入质量分数为0.5％的角豆胶溶液(用0.05mol/L Na₂HPO₄·12H₂O-0.025mol/L柠檬酸缓冲液配制)0.9mL，不同温度预热5min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，立即摇匀，在此温度下准确反应10min，立即在A、B中各加入2.0mL DNS试剂，B管补加0.1mL适当稀释的酶液(该酶液经沸水浴保温10min)，沸水保温5min，冷却后各加入蒸馏水5mL，混匀。以B管为空白，在540nm处测定OD值。

酶活力定义：在本实验条件下，以每分钟水解底物产生1μmol相当于D-甘露糖的还原糖的酶量定义为一个β-甘露聚糖酶单位(U/ml)。

2)粗酶酶学性质

a、酶反应的最适温度与最适pH值

使β-甘露聚糖酶在pH5.0的缓冲液中，在不同温度下(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)进行酶促反应，测其酶活，所得结果如图1。结果表明其酶反应在温度为50-70℃范围内酶活性变化不大，最适温度为65℃。配制不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的柠檬酸缓冲液，底物角豆胶在不同的pH缓冲液中，60℃下进行酶促反应，测其酶活，所得结果如图2。结果表明在β-甘露聚糖酶的pH为4.5-6.5范围内，酶活性变化不大，最适pH为5.0。

b、β-甘露聚糖酶的pH稳定性试验

将不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的柠檬酸缓冲液配制的酶液分别置于60℃水浴中保温60min后，测其酶活，所得结果如图4。结果表明该β-甘露聚糖酶具有较好pH稳定性，在pH4.0-6.0范围内处理1h后酶活性均维持在的80％以上。

c、β-甘露聚糖酶的热稳定性试验

将酶液置于不同温度(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)的水浴中保温15min，所得结果如图5。在65℃下处理15min，其剩余酶活还有70％以上。

本发明筛选到产β-甘露聚糖酶的优良菌株，该菌株所产β-甘露聚糖酶粗酶液酶反应的最适pH为4.5-6.5左右，最适温度为65℃，具有较好的pH稳定性和热稳定性，在不同的pH条件下保温1h后，在pH4.0-6.0的范围内，酶活性均维持在80％以上。在65℃下处理15min，其剩余酶活还有70％以上。相比较而言，比已报道的β-甘露聚糖酶有较好的反应温度和pH。

附图说明

图1是本发明的菌株电镜扫描图。

图2是本发明的酶反应的最适温度曲线图。

图3是本发明的酶反应的最适pH曲线图。

图4是本发明的pH对酶稳定性的影响曲线图。

图5是本发明的酶的热稳定性曲线图。

本发明的微生物保藏日期为2007年7月3日，保藏单位简称CGMCC，保藏编号：CGMCC No.2078。

具体实施方式

实施例1：

1、菌株的分离

采集魔芋种植地中的土样5g加入至100ml富集培养基中，以魔芋精粉做为唯一碳源，于37℃富集72小时；取土样上清液100μl于试管中，按常规稀释梯度(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)稀释后在双层平板筛选上进行平板涂布分离，于恒温培养箱中用筛选培养基37℃培养24小时；在分离平板中滴加浓度为1％的刚果红溶液10ml左右，挑取有淡黄色透明圈者，在分离培养基上划线分离纯化，37℃培养24小时，纯化2-3次；纯化后将其菌株接入液体发酵培养基摇瓶发酵，进一步初筛和复筛，最终分离筛选到产β-甘露聚糖酶酶活高的菌株CD-6。本菌株的16SrRNA基因见说明书的系列表。

该菌株接种到已灭菌的含魔芋精粉的液体发酵培养基中，将它们同时置于37℃，200r/min条件下发酵24小时后，接种该菌株的发酵培养基魔芋精粉有粘稠状固体变成非粘稠状液体。

分离筛选所用培养基为：

富集培养基：(g/l)魔芋精粉20，KH₂PO₄ 0.5，pH自然；

分离培养基：(g/L)魔芋精粉5.0，酵母膏2.0，蛋白胨10，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄·6H₂O0.12，琼脂20.0，pH自然；

筛选培养基：(g/L)上层：魔芋精粉2，下层：酵母膏1，蛋白胨10，pH自然；

发酵培养基(g/L)：魔芋精粉20.0，酵母粉5.0，NaNO₃5.0，MgSO₄·6H₂O 0.2，K₂HPO₄5.0，pH自然。

2、菌株的初步鉴定：

根据《常见细菌系统鉴定手册》以及《微生物学实验手册》对其进行形态特征、培养特征，生理生化测定等方面的初步鉴定。

菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有荚膜。能在20～60℃温度范围内生长，最适生长温度为37～50℃，生长pH是5～11，最适生长pH为7～8。能水解淀粉，能耐7％的NaCl生长，硝酸盐还原、过氧化氢酶测定、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、亚硝酸盐还原、明胶液化、甲基红实验、酪素水解结果为阳性，硫化氢实验、吲哚实验结果为阴性。该菌株经鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

3、β-甘露聚糖酶制备

种子培养基(g/L)：氯化钠10，蛋白胨10，酵母膏5，琼脂20。

将种子培养液接入装有30ml魔芋精粉发酵培养基的250ml三角瓶中，置于迥转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200r/min，37℃发酵24小时，发酵液离心，取上清液，即β-甘露聚糖酶，置于4℃保存。

所用培养基为：

种子培养基(g/L)：氯化钠10，蛋白胨10，酵母膏5，琼脂20。

发酵培养基(g/L)：魔芋精粉20.0，酵母膏5.0，K₂HPO₄ 5g，MgCl₂·6H₂O 0.2，NaNO₃5.0，pH5.5。

16SrRNA基因系列表

＞strain CD6

TGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGT

GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG

ATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCC

GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGA

GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA

TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGT

AAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC

CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGG

AATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACC

GGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAG

CGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGA

CGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC

GATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC

CTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA

GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTA

GAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG

TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGG

CACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT

GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAG

GGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCA

ACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCC

GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC

TTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACA

Claims (4)

1.一种β-甘露聚糖酶的产生菌，其特征在于β-甘露聚糖酶的产生菌分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp.，其保藏登记号为：CGMCC No.2078。

2.根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶的产生菌，其特征在于该菌株的16SrRNA基因为：＞strainCD6

TGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGT

GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG

ATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCC

GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGA

GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA

TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGT

AAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC

CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGG

AATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACC

GGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAG

CGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGA

CGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC

GATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC

CTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA

GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTA

GAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG

TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGG

CACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT

GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAG

GGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCA

ACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCC

GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC

TTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACA

3.权利要求1所述的β-甘露聚糖酶的产生菌的制备方法，其特征在于按以下制备：采集魔芋种植地中的土样加入至富集培养基中，以魔芋精粉做为唯一碳源于37℃富集72小时；取土样上清液于试管中，按常规稀释梯度稀释后，在筛选平板上进行平板涂布分离，于恒温培养箱中37℃培养24小时；在分离平板中滴加浓度为1％的刚果红溶液适量，挑取有淡黄色透明圈者，划线分离纯化，37℃培养24小时，纯化2-3次；纯化后将其菌株接入液体发酵培养基摇瓶发酵，进一步初筛和复筛，最终分离筛选到β-甘露聚糖酶产生菌菌株。

4.用权利要求1所述的β-甘露聚糖酶的产生菌制备β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于利用魔芋精粉发酵培养基，将种子培养液接入装有魔芋精粉的发酵培养基的三角瓶中，置于迥转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200r/min，37℃发酵24小时，发酵液离心，取上清液即为β-甘露聚糖酶。

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