CN102399847A

CN102399847A - 利用高温芽孢杆菌制备脂肽类生物表面活性剂的方法

Info

Publication number: CN102399847A
Application number: CN201110215321XA
Authority: CN
Inventors: 蔡志强; 杨广花; 朱孝霖; 李亮; 何玉财; 赵希岳; 李尔炀
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Changzhou University
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2012-04-04

Abstract

本发明利用高温芽孢杆菌制备脂肽类生物表面活性剂的方法，属于高温芽孢杆菌的菌株生产脂肽类生物表面活性剂的方法及其在石油开采等方面的应用领域。利用高温芽孢杆菌LEY11（菌株已于2010年7月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.3767）进行微生物液体发酵产脂肽类生物表面活性剂，用TLC和红外光谱分析对所产表面活性剂进行分析，对所需的液体培养基进行碳源和氮源成份优化及发酵条件进行优化，并测试生物表面活性剂的乳化性能和模拟高温油藏条件下进行驱油物理模拟，粗提品和发酵液可以应用于生物采油剂、化妆品、食品、洗涤剂、药品、农药和环保等领域。

Description

利用高温芽孢杆菌制备脂肽类生物表面活性剂的方法

技术领域

本发明涉及一种能产生物表面活性剂的高温芽孢杆菌，属于高温芽孢杆菌的菌株生产脂肽类生物表面活性剂的方法及其在石油开采等方面的应用。

背景技术

生物表面活性剂是一种公认的多功能化学处理剂，它一方面具有化学合成表面活性剂的共性，另一方面又有稳定性好、抗盐性强、受温度影响小、能被生物降解、无毒等优点。生物表面活性剂已经在石油、食品、化妆品及药学等领域得到较广泛的应用，并且愈来僡受到人们的青睐。

微生物自身的有益活动如降解原油或代谢产物如生物表面活性剂、有机酸、醇等来提高原油流动性，而达到提高采收率的采油技术。目前，石油开采常规工艺技术采出的油量只占原始地质储量的1/3-1/2，而应用微生物产生的生物表面活性剂提高石油采收率的技术(MEOR)是一项具有良好发展前景的3次强化采油技术。1968年由Arima等人发现的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生产的一种脂肽类表面活性剂，自被发现以来，受到持续关注，许多发明者致力于提高其产量、活性和降低生产成本，如何提高脂肽类生物表面活性剂的高温稳定性，这需要选育优良的高温菌株，开发高附加值产品，这正是本发明要解决的技术问题。

本发明通过在油田和油井内采样，通过传统微生物学方法和现代分子生物学技术筛选平台，进行了微生物菌种的筛选、培养、鉴定等，最终得到产脂肽类生物表面活性剂的高温芽孢杆菌LEY₁₁。本发明采用油井内源微生物，是一种对环境友好的内源性高温微生物表面活性剂，无任何污染和毒副作用。

发明内容

本发明针对上述现有的不足，提供发酵周期短、工艺简单的利用一株高温芽孢杆菌的制备脂肽类生物表面活性剂的方法。

利用高温芽孢杆菌的制备脂肽类生物表面活性剂的方法，按照下述步骤进行：

（1）菌种发酵：将高温芽孢杆菌LEY₁₁进行发酵；接种量按体积比3～10% (v/v)；发酵温度为45℃~70℃，pH为6.5～8.0，转速50～200rpm,通气量2～8L/h，培养时间36～108h；

（2）分离提纯：发酵液经 8000~10000r/min离心10~20min去除菌体，上清液加入等体积的氯仿/甲醇(1~2/1~3,V/V)，萃取，取萃取液的下层液，50~70℃减压蒸干得生物表面活性剂粗品，氯仿再次洗涤50~70℃蒸干得较纯的生物表面活性剂产品。

[0007] 其中所述的高温芽孢杆菌LEY11，该菌株已于2010年7月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 3767，建议的分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.。

其中上述高温芽孢菌LEY₁₁采用液体培养基，在发酵罐发酵培养，产生脂肽类生物表面活剂，液体培养基含有碳源、氮源和无机盐，碳源选自3%的葡萄糖、花生油、液体石蜡、可溶性淀粉、糊精、乳糖、酵母抽提物和0.1%的萘和正十六烷；氮源选自氨基酸、黄豆饼粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵，无机盐主要是硫酸镁(MgSO₄)、硫酸锰(MnSO₄H₂O)、硫酸亚铁(FeSO₄7H₂O)、氯化钙(CaCl₂2H₂O)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，其中1000mL盐溶液中含有；MgSO₄ 19.5g；MnSO₄H₂O 5g；FeSO₄7H₂O 5g；CaCl₂2H₂O 0.3g。

其中所述的发酵培养基为花生油10~30mL、K₂HPO₄ 5.0~5.7g；KH₂PO₄ 1~1.7g；NH₄Cl 1.5~2.14g；盐溶液 3~10mL；诱导因子正十六烷或萘为0.5~0.8g；配置1000 mL，其中1000mL盐溶液中含有；MgSO₄ 19.5g；MnSO₄H₂O 5g；FeSO₄7H₂O 5g；CaCl₂2H₂O 0.3g。

优选液体培养基每1000mL中含有：花生油30mL（或可溶性淀粉30g或正十六烷1g）、K₂HPO₄ 5.7g；KH₂PO₄ 1.7g；NH₄Cl 2.14g；盐溶液 10mL，其中1000mL盐溶液中含有；MgSO₄ 19.5g；MnSO₄H₂O 5g；FeSO₄7H₂O 5g；CaCl₂2H₂O 0.3g。

该菌产生的生物表面活性剂在采油的应用，可应用本发明表面活性剂进行生物驱油，提高原油采收率。

与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1) 本发明的高温芽孢杆菌LEY11最高生长温度85℃，最适生长温度45~65℃；(2) 高温芽孢杆菌LEY11对重烃降解效果十分明显，产脂肽类表面活性剂具有显著的乳化作用，可提高油田的原油采收率，改善使用化学表面活性剂对环境和原油的污染，并且用于油类污染土壤的环境修复效果明显；(3) 本发明产脂肽类表面活性剂发酵温度高达80℃，最高产量可达18g/L，65℃能使发酵液表面张力降低至24.8mN/m，排油圈直径达8.5cm；(4) 发酵温度高，高温芽孢杆菌产生的表面活性剂热稳定性高，发酵过程中污染少，容易控制。

附图说明

图1 高温芽孢杆菌LEY₁₁产生的生物表面活性剂红外谱图；

图2 高温芽孢杆菌LEY₁₁产生的表面活性剂¹H-NMR；

图3 脂肽类生物表面活性剂TLC分析图（展层剂为氯仿/甲醇/水，65/15/20, V/V/V,显色剂为茚三酮显色剂，脂肽显红色）

具体实施方式

本发明所述的高温芽孢杆菌LEY₁₁，该菌株已于2010年7月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 3767，建议的分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.。

属于芽孢杆菌属，菌株LEY₁₁为革兰氏阴性，兼性好氧菌，杆状，个体大小，长为2.5～3.5μm，宽为0.6μm，在细菌培养基上形成乳白色菌落，菌落为圆形；个体为卵形，端生芽孢。高温芽孢杆菌生长温度范围：45℃~85℃；最适生长温度范围：45℃~65℃；最适生长pH为6.5~8.0。

实施例1 脂肽类生物表面活性剂制备

将高温芽孢杆菌LEY11分别接入到含十六烷或萘为诱导因子的液体培养基中进行发酵，得到脂肽类表面活性剂发酵液。

在发酵罐发酵培养，产生脂肽类生物表面活剂，液体培养基含有碳源、氮源和无机盐，即为花生油30mL、K₂HPO₄ 5.7g；KH₂PO₄ 1.7g；NH₄Cl 2.14g；盐溶液10mL；诱导因子正十六烷或萘为0.8g；配置1000 mL；其中盐溶液(1000mL)中含有；MgSO₄ 19.5g；MnSO₄H₂O 5g；FeSO₄7H₂O 5g；CaCl₂2H₂O 0.3g。

接种量3%，培养温度65℃，摇床转速120rpm培养96小时，然后测定发酵液的表面张力和排油圈，发酵液的表面张力直径分别为葡萄糖 42.84 mN/m、花生油20.71 mN/m、液体石蜡67.17 mN/m、可溶性淀粉23.56 mN/m、糊精40.36 mN/m；排油圈直径分别为葡萄糖0.6cm、花生油1.3cm、液体石蜡0.3cm、可溶性淀粉1.1cm、糊精0.7cm。

分离提纯：发酵液经 10000r/min离心20min去除菌体，上清液加入等体积的氯仿/甲醇(2/1,V/V)，萃取，取萃取液的下层液，60℃减压蒸干得生物表面活性剂粗品，氯仿再次洗涤70℃蒸干得较纯的生物表面活性剂产品。

脂肽水解：取上述一定量的脂肽产品，加入6mol/L的HCl，真空密封，100~110℃酸解，酸解结束后，用NaOH调节水解液的pH到5.5左右，定量移入10~50mL容易瓶中定容做氨基酸组成分析，该脂肽中含有谷氨酸(Glu)或谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)或天冬酰胺(Asn)，结氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)，其中谷氨酸含量为1.7~2.2×10^-5 mol/g。.

表面活性剂经红外光谱分析， 3396.5cm^-1是由分子间氢键引起的N-H伸缩振荡，1650.8 cm^-1与1537.4 cm^-1为酰胺键吸收谱带，说明表面活性剂分子结构中有肽键；2961~2860 cm^-1和1470~1380 cm^-1的两处吸收是脂肪酸族的C-H伸缩振荡。

脂肽类化合物核磁图： ¹H NMR(CDCl₃) δ: 3.95(3H, s, -OCH₃), 4.01(3H, s, -OCH₃), 6.49(1H, d, J=22.5 Hz, 6-H), 7.06(1H, s, 3-H), 7.19(1H, m, 8-H), 7.22(1H, m, Ar-H), 7.40-7.45(7H, m, 3’,4’, 5’-H, Ar-H), 7.94(2H, d, J=21.5 Hz, 2’,6’-2H), 9.05(1H, s, NH)。

由图1～图3可得出该表面活性剂为脂肽类物质。

实施例2 脂肽类生物表面活性剂增油性能评价

利用实施例1得到的表面活性剂发酵液，实验室高温模拟油藏进行物模驱油试验，提高采收率8.1%，应用前景较好。

按一定比例配好不同料径的石英砂装填岩心，通入饱和油井产出水，测渗透率和孔隙度，并计算原油饱和度，注前段营养及实施例1发酵液，关闭物理驱油模型，75℃恒温培养10d、20d和30d，开启模型进行后续水驱测定原油采收率。培养10d、20d和30d，比空白岩心在静态放置10d、20d和30d后采收率分别提高了4.9%、6.2%和8.1%，说明高温菌LEY11在实验室模拟高温油藏的条件下可以生长并产生表面活性剂，能够乳化原油，增加原油流动性提高采收率。

Claims

1.利用高温芽孢杆菌的制备脂肽类生物表面活性剂的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）菌种发酵：将高温芽孢杆菌LEY₁₁进行发酵；接种量按体积比3～10%；发酵温度为45℃~70℃，pH为6.5～8.0，转速50～200rpm,通气量2～8L/h，培养时间36～108h；

2.根据权利要求1所述的利用高温芽孢杆菌的制备脂肽类生物表面活性剂的方法，其特征在于其中所述的高温芽孢杆菌LEY₁₁，该菌株已于2010年7月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 3767。

3.根据权利要求1所述的利用高温芽孢杆菌的制备脂肽类生物表面活性剂的方法，其特征在于其中上述高温芽孢菌LEY₁₁采用液体培养基，在发酵罐发酵培养，产生脂肽类生物表面活剂，液体培养基含有碳源、氮源和无机盐，碳源选自3%的葡萄糖、花生油、液体石蜡、可溶性淀粉、糊精、乳糖、酵母抽提物和0.1%的萘和正十六烷；氮源选自氨基酸、黄豆饼粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵，无机盐主要是硫酸镁(MgSO₄)、硫酸锰(MnSO₄·H₂O)、硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，其中1000mL盐溶液中含有；MgSO₄ 19.5g；MnSO₄·H₂O 5g；FeSO₄·7H₂O 5g；CaCl₂·2H₂O 0.3g。

4.根据权利要求2所述的利用高温芽孢杆菌的制备脂肽类生物表面活性剂的方法，其特征在于其中所述的发酵培养基为花生油10~30mL、K₂HPO₄ 5.0~5.7g；KH₂PO₄ 1~1.7g；NH₄Cl 1.5~2.14g；盐溶液 3~10mL；诱导因子正十六烷或萘为0.5~0.8g；配置1000 mL，其中1000mL盐溶液中含有；MgSO₄ 19.5g；MnSO₄·H₂O 5g；FeSO₄·7H₂O 5g；CaCl₂·2H₂O 0.3g。

5.根据权利要求4所述的利用高温芽孢杆菌的制备脂肽类生物表面活性剂的方法，其特征在于液体培养基每1000mL中含有：花生油30mL或可溶性淀粉30g或正十六烷1g、K₂HPO₄ 5.7g；KH₂PO₄ 1.7g；NH₄Cl 2.14g；盐溶液 10mL，其中1000mL盐溶液中含有；MgSO₄ 19.5g；MnSO₄·H₂O 5g；FeSO₄·7H₂O 5g；CaCl₂·2H₂O 0.3g。