JPS61500002A - ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガ−スｐ＆ｗ株を用いるセルロ−ス性基質のグルコ−スへの転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ミクロビス号？う・ビスボラ・ルトガースＰ＆Ｗ株を発明の背景 この発明は、微生物ミクロビスポラ・ビスホラ。

酵素によりセルロース性基質を加水分解することによるセルロース性基質のグル コースへの酵素的糖化方法に関する。

セルロースは地球上に最も多く存在する有機化合物であると言われている。これ は、Ｂ　−（］、　−４）−グリコシド結合により連結されたＤ−グルコースの 反復するサブユニットから本質上族る。全加水分解はＤ−グルコースをもたらし 、そしてゾサノカライドセロビオースをもたらし、このものはＢ−Ｄ−グルコヒ ラノシルーＢ−（１−４）−Ｄ−グルコヒラ−ゼである。従って、セルロース（ ｄＢ−１，４，−グルカンでちる。

セルロースは光合成されたグルコースの主たる貯蔵形であり、そしてバイオマス に転換された太陽エネルギーの主要成分である。エネルギー及び食料供給の世界 的需要が増加するに従って、セルロースがその豊富さにおいてこれらの要求を充 足するための魅力的な原材料となる。セルロースのグルコースザブユニット、は 、一方ピおいてエネルギーの生産のための、そして他方において蛋白質の生産に おける使用のだめの種々の工程において使用することができる。

しかしながら、セルロース利用技術に対する大きな障害は、エネルギー人力、装 置的要求等の観点における合理的なコストの支出のもとにセルロースからの合理 的な収率においてグルコースを得るこトカ困難なことであった。化学的加水分解 は装置コストが高く、工程コストが高く、収率が低く、複雑な混合物が生成し、 そしてて主要生成物であるグルコースを主として生成する時点においてセルロー スの分解を停止することが不可能であるという欠点を有する。従って、セルロー スの酵素触媒糖化け、セルロースのグルコースへの高効率転換を達成することが できる、化学的分解に対する有望な代替法と見られる。

伝統的に、セルロース分解性微生物１は腐朽、よごれ、及び粘質物の生成を通し て有意な損失を生じさせ、・ぐルゾ、及び製紙工業に対する障害であるが、微生 物的酵素分解はまた、バイオマスのエタノール、化学飼料及び食料への制御され た転換において、工業的有利性に変えることができる。セルラーゼのごとキ酵素 を用いるセルロースのグルコースへの酵素的転換は、これが穏和な温度及び圧力 において進行し、循環可能な触媒をもたらし、そして化学的加水分解に伴う好丑 （〜くない副生物を環境に与え々い点において化学的分解に卓越する。しかし々 から、セルロースのごとき酵素の適当な量の生産は、合理的に純粋な状態ののセ ルラーゼ酵素の実質的な量を得るための適当な入手源を同定することに依存する 。

セルラーゼは実際に、結晶セルロースの分解において共働的に又は相乗的に作用 する複数の酵素の複合体である。これらの酵素はエンドグルカナーゼ、セロビオ ヒドロラーゼ、又はグルコヒドラーゼ、及びセロビアーゼ（Ｂ−グルコシダーゼ ）である。現在の考察によれば、セルロース基質は丑ずエンドグルカナーゼによ り加水分解されてオリゴマー中間体をもたらす。これらのオリゴマー中間体はグ ルコヒドロラーゼ又はセロビオヒドロラーゼのごときエキソ−切断グルカナーゼ により直接作用され、非還元末端からそれそ、ｔＬグルコース又はセロビオース を生成する。両タイフ０のグルカナ−七゛が残留オリゴマーを加水分解し続け、 そして最後にセロビアーゼが短鎖第１ノゴマー及びセロビオースを切断してグル コースをもたらす。最も効果的なナノ１ラーゼはエンド−切断成分及びエギソー （４す新成分の両者を含有し、そ−して両者を含有１゛るセルビースのみが結晶 セルロースの高度糖化転換をもたらすことができることが見出された。微生物に よる両タイプの酵素の同時的生産は・：［１対的に限定されるむ数少ない菌類の 属からのみ活収量が得られることが報告されている。

ゼ複合体の全酵素の最良の入手源であると当業界で考えられている。しかしなが ら、セルラーゼ源としてのＴ、レーゼイの有用性は、セルラーゼ゛の合成におけ るカタボライトレプレノションにより；−上昇した温度におけるセルラーゼの不 活性によシ；そして最も重要なことには、糖化中の最終生成物阻害により妨害さ れる（セルビオースはＴレ−ゼイにおいてエンド−グルカナーゼ及びセロビオヒ ドロラーゼの両者の強い最終生成物阻害剤であり、ゲルコーン、はＢ−グルコシ ダーゼの競争的阻害剤である）。

従って、酵素生成物が最終生成物阻害に対１２て削性であり、そ１８．て上Ｅし た温度に・・いてす−質的に損われない微生物セルラーゼ源のり離及び開発に勃 に工業的関心が寄せられ、そして従来技術を越える有意な進歩を構成するであろ う。

発明の要約 従って、この発明の目的は、最終生成物阻害に対して耐性を有するセルラーゼの 使用にょシグルコースを製造することができる好熱性微生物株を単離として培養 することである。この発明の他の目的は、このような微生物により生産されたセ ルラーゼの精製；該微生物のセルラーゼによるセルロース性基質の糖化の開始： 及びある条件下での微生物のセルラーゼ生産の速度の決定を含む。この発明の他 の目的は、種々の酵素濃度、基質濃度、基質組成、及び基質の前分解がグルコー ス生産効率に与える効果を決定することである。

これらの目的及び他の目的はグルコースへのセルロースの転換のための生物学的 方法に向けられるこの発明により達成される。この方法に従えば、セルロース性 基質を含有する水性培地にセルロース生産性微生物ミクロビスポラ・ビスポラ・ ルトガースＰ＆Ｗ株（以後Ｍ、　ｂ、　Ｒ，とする）又はそのセルラーゼ生産性 変異株が接種される。次にこの培地が、雑微生物の増殖が回避されそして比較的 高温において生育することができるＭ、　ｂ、　Ｒ，の能力が利用されるような 温度及びＰＨの適切な条件下に維持される。こうして生成されるセルロース性基 質の発酵は、基質の少なくとも幾らかがグルコースに転換されるまで行わ単離さ れたセルロース酵素複合体を用いて得われる。

こうすることによって微生物によるグルコース生成物の実質上すべての消費が回 避されるからである。

ここで、Ｍ、　ｂ、　Ｒ，又はその変異株の培養物が、所望の量のセルラーゼ複 合体を生産するのに十分々量において増殖する。複合体の最初の２つの酵素は、 培養プロスを直接濾過しそして集めることにより、そして残留する菌糸を洗浄す ることによシ、細胞分泌生成物として集められる。そして、分泌された酵素の量 が十分であると決定された後、細胞が溶解され、超音波処理され、又は他の方法 で破壊されて、膜結合性の第３の酵素（Ｂ−グルコシダーゼ）が放出すれる。細 胞構成成分の取り出し、複合体を形成するための酵素の再構成、及びセルラーゼ 複合体のセルロース基質への適用がグルコースをもたらすであろう。

Ｍ、ｂ、Ｒ，又はその変異株の培養物により生産される酵素によるセルロース性 基質の加水分解は、３５ｗ／ｗ％という高濃度のグルコースを含有する水性媒体 中でさえ達成され得ることが見出された。これに関して好ましい水性媒体は最終 的に５〜３５重量係の範囲のグルコースを含有するであろう。

好ましい加水分解条件は約り５℃〜約８５℃の温度、及び約５．５〜約７．５の ＰＨの使用を含む。特に好ましい発酵温度範囲は約り０℃〜約６０℃である。

グルコースの製造のための好ましい加水分解速度は、約２〜２４時間の期間にわ たる、グルコース及びセロビオースの組合わせへのセルロース基質の約８０チ以 上の転換である。特に好ましい比率の加水分解速度はグルコース及びセロビオー スの組合わせへの基質の約９０％以上の転換をもたらし、グルコースとセロビオ ースのモル率は少なくとも約２＝１、又は好ましくは少なくとも約５：ｌである 。生成物混合物の約９５重量％以上がグルコースであることが特に好ましい。

さらに、ミクロビスホラ・ビスポラ・ルトガースｐ＆ｗ又はそのセルラーゼ生産 性変異株から単離されたセルラーゼ−３酵素複合体もこの発明に含まれる。この 複合体はエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びＢ−グルコシダーゼを 含み、Ｂ−グルコシダーゼが公知のセルラーゼ酵素複合体に比べて増加した量で 存在する。この発明のセルラーゼ複合体のＢ−グルコシダーゼ活性は、３日月の 培養プロスの成熟全細胞から製造した無細胞超音波処理物１５ｍ１から誘導し、 そして基質としてｐ−ニトロフェニル久ルコシドを使用して測定した場合、０． １ユニ７　）　／　ｍ１以上である。この発明のセルラーゼ酵素複合体は最終生 成物阻害（グルコース）に対する実質的な耐性を示し、公知のセルラーゼ複合体 に比べてセロビオースに対して有意に多い量のグルコースを生成し、そして公知 のセルラーゼ複合体に比べて一層高い最適機能温度を有する。好ましい酵素複合 体は１０チグルコース溶液中で、グルコース不含溶液中でのその活性の約６５％ 以上の糖化活性を示すであろう。特に好ましい酵素複合体は２０係グルコース溶 液中で、グルコース不含溶液中でのその活性の約３０〜３５係以上の糖化活性を 示すであろう。

この発明はさらに、セルラーゼ生産性ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ ＆Ｗ及びそのセルラーゼ生産性変異株の単離された純化培養物を含む。

Ｍ、　ｂ、　Ｒ，及び変異株は、約５８℃の温度において最適に増殖するそれら の能力によシ；主としてグルコースを生成するそれらのセルロース分解活性によ り；それらのセルロース糖化能力の最終生成物阻害に対するそれらの実質的な耐 性により；２胞子形成（ｂｉｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ　）　、繊維状菌糸、及び 白色〜灰白色の外観を含むそれらの形態学的特徴によシ；そして硝酸塩を亜硝酸 塩に還元しないこと、澱粉を加水分解しないこと、並びにグルコース、ラムノー ス及びイノシトールを利用するがグリセリン及びアラビノ−冬を利用しないこと を含む生理学的及び生化学的性質により特徴付けられる。変異株は、こんどは、 Ｍ、　ｂ、　Ｌ　Ｑ、　Ｖ、の増強されたセルラーゼ生産性の特徴について選択 される。

図面の簡単な説明 の接近写真を示す。

第２図は幾つかの培地におけるＭ、　ｂ、　Ｒ，によるエンド−グルカナーゼの 生産の様子を示す。

第３図は幾つかの培地におけるＭ、　ｂ、　Ｒ，によるＢ−グルコシダーゼの生 産の様子を示す。

第４図はＭ、　ｂ、　Ｒ，によるエンド−グルカナーゼの生産に対するセルロー ス源の効果を示す。

第５図はＭ、　ｂ、　Ｒ，によるＢ−グルコシダーゼの生産に対するセルロース 源の効果を示す。

第６図はＭ、　ｂ、　Ｒ，によるＢ−グルコシダーゼの生産に対するセルロース 濃度の効果を示す。

第７図はＭ、　ｂ、　Ｒ，酵素複合体による細断された新聞紙の糖化により生成 される生成物及びそれらの相対量の）（Ｐ　ＬＣ追跡を示す。

第８図はＧＥ株ＹＸからのセルラーゼ酵素複合体による細断された新聞紙の糖化 によシ生成された生成物及びそれらの相対量のＨＰ　ＬＣ追跡を示す。

第・９図はＭ、　ｂ、　Ｒ，、ＹＸ株及びＴ、レーゼイのＢ−グルコシダーゼ活 性の比較最終生成物阻害を示す。

第１０図及び第１１図は、種々の条件下でのＭ、　ｂ、　Ｌのエンドーグルコナ ーゼの熱安定性を示す。

第１２図はＰ＆Ｗパルフ０を用いるＭ、　ｂ、　Ｌ酵素発酵からの糖化生成物の ＦＩＰＬＣ追跡を示す。

第１３図はＭ、　ｂ、　Ｒ，及びそのＱＶ変異株により生産されるセルラーゼ酵 素レベルの比較を示す。

第１４図は市廃棄物のＭ、ｂ、Ｒ，変異株ＱＶ発酵に対する前処理の効果を示す 。

第１５図はＭ、　ｂ、　Ｌによるセルラーゼの７１発酵槽生産の様子を示す。

ヒ性質、並びにセルロースのグルコースへの転換方法におけるその使用を検討す る。

機能的・ぐラメ−ター、工程変数及び比較試験を、微生物のユニークな性質の観 点から説明する。

４０株の好熱性放線菌を、４ケ国、すなわち米国、ニー−ソーランド、中国及び 西インド諸島の高温土壌又は他の分離源から単離した。干し草又は微結晶セルロ ース（セルロース源トして）ト共に土壌サンプルを、６０℃にてフラスコ中でイ ンキ−ベートし、そして「最適湿度に維持した。セルロース消化性放線菌の増殖 は、基質表面上の乾燥した粉状領域としてコロニーが肉眼で観察される程度に非 常に好調であった。次に、唯一の炭素源としてセルロース（１係アビセルＰＨ− １０５）を含有するタバターテルイ培地（第２表に示す）上にプレートした。汚 染細菌種の抑制を助けるために種々の濃度でノボビオシン及びクリスタルバイオ レットを加えた。プレートを、９０〜９５チの湿度レベルに維持されたホトツヤ ツク（Ｈｏｔｏ’ｐａｃｋ　）温度／湿度調節インキ−ベーター中でインキュベ ートした。６週間までの延長された期間にわたって脱水を伴わないでインキュベ ーシヨンを維持することが可能であった。

次に菌株を、基質として１％のアビセル（微結晶セルロース）を含有するハガー ダル／フェルハック／パイ（Ｈａｇｅｒｄａｌ　／Ｆｅｒｃｈａｋ　／Ｐｙｅ　 ）　（第１表に示す）のｔＬ体振とうフラスコ培養に接種した。もとの４０株の 内１１株のみが液体培養物中に増殖した。

この１１株の内、後でＭ、　ｂ、　Ｒ，と同定される菌株が、液体培養において 良好なセルロース分解活性を示す２つの放線菌株の内の１つであった。これらは 、１係セルロース懸濁物を７２時間以内に完全に消化することかできた。

第２・の菌株は、液体培養における増殖の不安定さのために最終的に拒絶された 。

菌株Ｍ、　ｂ、　Ｒ，はミクロビスポラ・ビスボラ種の１員であるが、この種の 他の構成員と異り、この菌株は顕著なセルロース分解活性及びこの活性の最終生 成物阻害に対する実質的な耐性を示す。Ｍ−１）、　Ｒ，はイリノイ、−２オリ アのＵ、　Ｓ、　Ｄ、　Ａ寄託機関に寄託された。これにＮＲＲＬＮｏ　１５５ ６８が付与された。

的試験が存在する。これらは： （１）固体培地〔ハガーダル／パイ培地（第１表）、及びタパタ／テルイ培地（ 第２表）〕上での増殖、 〈２）　液体培養における増殖、 （３）糖化効率、 （４）最後生成物阻害に対する耐性、 （５）生産された酵素の熱安定性、 （６）　連続される培養における菌株の安定性、及び幾つかの比較微生物の挙動 は次の通りである。

増殖の測定のため、セルロースを含むタパタ／テルイ塩から成る固体培地を使用 した。コロニーの周囲を透明にするセルロースの不連続領域の形成により示した 。これらの−次試験のため、１係のアビセルＰＨ−１０５をセルロース源として 使用したが、透明領域の出現のために３週間の増殖がしばしば必要であることが 見出された。多数のサンプルの増殖のスクリーニングのだめの第２の一層迅速な 系は、０．５チ酸膨潤セルロースを含むタパタ／テルイ塩の使用である。単に３ 〜７日の期間にＭ、　ｂ、　Ｒ，による卓越した透明領域の形成が得られた。こ の試験は、微生物が唯一の炭素源としてセルロースを消化しそしてその上に生育 し、そしてセルラーゼを分泌することを示す。第２培地中に増殖中のＭ、　ｂ、 　Ｒ，のコロニー、及び該コロニーの接近写真を第１図に示す。

１、５　ｇＮａＣＬ ３１１（ＮＨ４）２Ｓ０４ ９、１　、！ｉ’　Ｎａ２ＰＯ４ ０、９，９ＫＨ２ＰＯ４ ５０、０ｍ９　ＮａＥＤＴＡ ２００．０ｍ９Ｍｇ５０４・７Ｈ２゜ ８、０　ｍ９ＺｎＳＯ４−７Ｈ２０ ２０、０ｍｇ、　ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０１５、２ｍ９　ＭｎＳＯ４”Ｈ２Ｏ ２ｏ、　ＯｍｇＣａＣＬ２ １、０　ｍｇ　ピオチン＊ １、、０１ｎｇ　チアミノＨＣｔ １．０ｇ　酵母エキス １　０、０　ｇ　セルロース（７ビセルＰＨ−１０５）Ｈ２Ｏ１１になる量 ＊　ビタミンは濾過除菌し、そしてＮ、Ｂをオートクレーブ殺菌した後に加える 。ビタミン及び酵１０．０．９　セルロース（アビセルＰＨ−１０５）２．０． ９　Ｋ２ＨＰＯ４ ０、５、！ｉｌ　ＫＣｔ ｌ、０　ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ０，５ｇ　ＮａＣ１ １，０Ｆ　ＮＨ４Ｎｏ３ １・Ｏｇ　ゾロテアーゼベゾトン １、Ｏｇ　ＣａＣｔ２・２Ｈ２０ ０、５Ｆ　酵母エキス 単離プレート用： ａ、セルロースを０．２９／ｌに減らす。

ｂ、　ベゾトンを省略する。

ｃ　、ＣａＣｔ２を０．１Ｆｌ／ＩＪに減らす。

ｄ、寒天を加える一２０ｇ／１３ 増強されたセルラーゼ生産性を有する変異株の分離用： 単離プレート用と同様であるが、 ａ、７ビセルヲ０．５％酸膨潤セルロース、又はセロビオースで置き替よる。

ｂ、　カタボライトレゾレソサーとしてＱ、　５　ｗ　／　ｖ係の２−デオキシ グルコースを加える。

試験（２）液体培養における増殖 液体培養（例えば振とりフラスコ）における増殖は、商業的用途及び実験室的研 究両用の酵素の製造のために重要である。単離されたセルロース分解性放線菌の 幾つかは、液体培養において増殖ができないために拒絶された。

放線菌Ｍ、　ｂ、　Ｒ，は液体培養において急速に増殖し、そしてかなシのレベ ルの酵素を生産する。酵素の生産は培養条件に直接関連する。すなわち、例えば 、ハガーダル／パイの培地（第１表）は、夕・ぐタ／テルイ培地（第２表）を越 える増加した収量のエンド−グルカナーゼ及び−グルコシダーゼの両方をもたら す（この様子について魂それぞれ第２図及び第３図を参照のこと）。酵素の生産 、特にエンドグルカナーゼ及びＢ−グルコンダーゼの生産はさらに、セルロース 基質の性質（この様子については第４図及び第５図を参照のこと）、及び濃度（ この様子については第６図を参照のこと）の両者により影響される。酵素生産に 影響を与える他の因子は（ａ）　ｐＨ（Ｈ／Ｐ培地を使用する場合、ｐＨ６，６ ではなくむしろｐＨ７，２において酵素の生産が増加する）、（ｂ）窒素源（ア ンモニア窒素が硝酸塩窒素に比べて非常に高い酵素レベルをもたらす）、及び（ ｃ）温度（５５℃におけるよシロ０℃においてわずかに高い酵素レベルが達成さ れ、そして増殖及び酵素生産のいずれも４３℃において貧弱である）。最後に、 培地にガラクトースのごときある種の栄養素を添加することによって酵素生産が 増進されるという徴候がある。ＰＶｅ培地において推奨されるビタミンの補給（ チアミン及びビオチン）の必要がなく、そしてこのために培地が高価最終的には 、生産される酵素の実際的な価値は容易に入手できる基質に対する糖化効率によ って決定されるであろう。この立場からの実際的な目標は化学飼料として使用す るためのグルコース２０％のシロソブを製造することである。

細断された二。−−０３−クタイムズ紙を用いて、セルロース糖化の比較を行っ た（新聞紙の分析については第３表を参照のこと）。微生物Ｇ、　Ｅ、　ＹＸは ゼネラルエレクトリニノク社により発見された好熱性放線菌である。これに由来 する酵素標品はレイ（Ｌｅｈｉｇｈ　）大学から入手した。糖化生成物を分離す るために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　（分析の詳細は例の部に記 載する）を用いた。生成物理ルに比べて６倍多くのグルコースを生成することが 注目される。Ｇ、Ｅ、ＸＹ株の酵素はこの試１験においてほとんど支配的にセロ ビオースを生成する。

最近の実施期間において、ＹＸ酵素はわずかに２飴のグルコース及び１２係のセ ロビオースをもたらす。

このセロビオースはなおグルコースに転換されなければならず、他の分離源から の補充的Ｂ−グルコシダーゼの添加を必要とし、余分のコストがかかる。

）ＩＰＬＣによる検討はさらに、Ｍ、　ｂ、　Ｒ，はアビセルＰＨ１、０５上で 増殖した場合キシラナーゼを有すること′　を示す（ＹＸは有しない）。キシラ ンはバイオマスの主要な構成成分であるから、化学飼料として商業的関心がよせ られている。

１８係が達成された。これは酵素が９９係の効率で作用することを示すから優れ た結果である。

第　３　表 セルロース基質のおよその分粧値 灰分（５５０℃）　０４５ ＊　セルロースはアプデグラフ（Ｕｐｄｅｇｒａｆｆ　）Ｄ、Ｍ、、アナリティ カル・ビオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　３２：４２０ （１９６９）の方法による。

グルコース２０％のシロップの製造は必然的に２０％のグルコースの存在下でＢ −グルコシダーゼ酵素が作用しなければならないことを意味する。最較する。ト リコデルマのグルコシダーゼは１％未満の濃度によって全面的に阻害されること がただちに注目されよう。他方、Ｍ、　ｂ、　Ｒ，酵素はグルコース１０係のシ ロップ中でその活性の６５係を維持するが、これに対してＹＸは３７係に過ぎな い。Ｍ、　ｂ、　Ｒ，酵素は２０％のグルコース中でその活性の３４チを維持し 、そして３０チのシロップ中でも２１％の活性を維持する。顕著な価値が存在す る。

セルロースの酵素的加水分解は基本的には化学反応であるから、転換速度は糖化 が行われる温度に直接関連する。生物学的系にとっては高温である６０℃を用い た。連続反応のためにはこのような高温における酵素の安定性が重要である。Ｍ 、　ｂ、　Ｒ，エンドグルカナーゼは６０℃にて複数週間安定であり、そして８ ０℃において２０分間後にその活性の５５％を維持し、そしてこの温度において ９時間後にその活性の２３チを維持する。１００℃においてさえ１５分間後にそ の最初の活性の５０％よシ多くが維持される（第１０図及び第１１図を参照のこ と）。Ｂ−グルコシダーゼは、相当に熱感受性であるが、５５℃にて４８時間後 なお活性を有する。

幾つかの好熱性放線菌が有する主要な問題は連続培養の後生存性を喪失するその 傾向であった。明らかに、商業的目的のためには、反復培養の後に生存性及び酵 素生産能力の両方を保持する生物を手にすることが必須・である。最初の単離株 の幾つかはこの能力を欠くために拒絶された。

Ｍ、　ｂ、　Ｒ，は、１１チ月より長期間の連続培養の後に十分に安定な生物で あることが証明された。この生物はまた、液体窒素中、土壌中、及び寒天スラン ト上に容易に保存され得る。液体窒素中に１．５ケ月貯蔵した後のその生存性を 試、験した。生存能力の喪失は存在せず、そしてただちに増殖が起こった。６ケ 月以上の貯蔵の後にスラントから生物を再生することが可能であり、同様に土壌 からも可能であった。

最も急速な再生は液体窒素からであり、そしてこれがおそらく貯蔵方法として選 択されるであろう。

Ｍ、　ｂ、　Ｒ，株の性能は、これらの６つの規準によシ考察した場合、それが セルロースの転換のために非常に効果的であることを示す。この生物は安定であ り声固体培地及び液体培地の両方によく増殖し；そして熱安定性であり、最終生 成物阻害に対して耐性であり、そしてさらに広いＰＨ許容範囲を有する酵素系を 有する。この酵素系は糖化研究おいてその卓越性と能力を示した。

一般に、Ｍ、　ｂ、　Ｒ，による酵素被合体の生産及び活性は、該複合体の３つ の酵素のそれぞれの高速生産に１３−　りｋ　：７シダーゼが多量に生産される ことに依存することが見出された。

Ｍ、ｂ、Ｒ系酵素の特徴付は 並ビスポラルトガースＰ＆Ｗのセルラーゼ複合体は一般に、第３成分であるＢ− グルコシダーゼの最適比率を有するものとして特徴付けられる。このものは最初 の２成分のように分泌されるのではなくむしろ細胞結合酵素として存在する。

特に、Ｍ、　ｂ、　Ｒ，のＢ−グルコシダーゼ酵素はセルラーゼの３成分の内で 最も重要である。橙ぜならその比率が糖化効率及びグルコースの最終的な生成に 影響を与えるからである。

従って、セルロース基質の効果的な糖化のためには、酵素複合体の種々の成分が 全複合体の活性が最適化されるような比率で存在すべきである。トリコデルマ及 びサーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　）（Ｐｅｎｎ　／Ｇ、 　Ｅ、株ｙｘ　）の両者のセルラーゼにおいてＢ−グルコシダーゼが限定酵素で あることが知られているため、Ｍ、　ｂ、　Ｒ，中のこの成分が検討され、そし て商業的トリコデルマ酵素、及びさらにサーモモノスポラと異シ、Ｍ、　ｂ、　 Ｒ，はセルラーゼ複合体中の他の酵素に比べてＢ−グルコシダーゼの供給が多い ことが見出された（糖化に及ぼすＭ、ｂ、Ｒ，グルコシダーゼ濃度の効果の詳細 については第４表を参照のこと）。

追加のＢ−グルコシダーゼがＱグルコースの生成を増加せしめるが、それはＭ、 　ｂ、　Ｒ，の糖化効率を上昇せしめないことが見出された。この効果は直線的 でないミクロビスポラ・ビスポラＲＰ＆Ｗのセルラーゼによるアビセルの糖化に 及ぼすＢ−グルコシダーゼレベルの効果（＋） （−Ｌ−ソトＡ＝ｌｆ）　１時間　３時間　６時間　２４時間　ｒｎｇ／ｍ１（ ２４時間） ０．００６　０．０７　０．２１　０．４１　１，３８　２，３００．０４　０ ．３１　０，７８　１．．２９　．３，７２　４，３００．１１（＊）　０．４ ２　０，９３　１．５２　４．２３　５，１００．２３　０．４６　０．９９　 １，５９　４，２６　５．７０（＊）　Ｎ、Ｂ、０．１１ユニット／　ｍｌが全 細胞懸濁液からのセルラーゼ濃度と同等である。この２倍のレベルは糖化効率を 有意に上昇せしめない。このレベルにおいて、グルコースは糖化生成物の８３係 を占める。

（＋）各反応混合物は１５ｒｎｌの培養土清液（−グルコシダーゼ不含）十特定 されたレベルを与えるために十分な濃縮されたーグルコシダーゼ（超音波処理さ れた細胞から）、及び全量を２５ｍ１にするＰＯ４緩衝液を含有した。各フラス コにアビセルＰＨＩＯＬ　０．２５ｇを加えてセ／ｌ／　ＣＩ　−ス濃度を１０ ｍ９／ｍ１Ｍ、ｂ、Ｒ，Ｂ−グルコシダーゼの存在位置さらに、ｒｖｉ、　ｂ、 　ＲにおけるＢ−ガラクトシダーゼ酵素の存在位置を検討した。トリコデルマ及 びサーモモノスポラにおけるように、Ｍ、　ｂ、　Ｒ，のＢ−グルコシダーゼ活 性は細胞に結合している。この酵素は、細胞の超音波破砕によって容易に放出さ れる。酵素の見かけ活性はこの方法によシイ５係増加する（第５表及び第６表を 参照のこと）。

超音波分画によるＢ−グルコシダーゼの放出測定された画分　Ｂ−グルコシダー ゼ活性洗浄細胞　０．１１ 超音波上清　０１２ 超音波破片　−０，０１ 細胞を５０ｍＭＰＯ４緩衝液（ｐＨ６，５）で２回洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁 し、そしてミクロ−チップによ９２分間超音波処理した（３０秒間超音波処理し １分間冷却・・５回反復）。Ｂ−グルコシダーゼはｐ−ＮＰＣ法により測定した 。

酵素標品　糖化効率 （グルコースダ／ｍ１７２４時間） 全細胞　２．９２ 超音波処理（無細胞）　４．２３ アビセルＰＨＩＯＩ、５５℃、ｐＨ６，５，ＰＯ４緩衝液。全細胞調製物は１５ ｍ１の培養ブロス、ｌＱｍ／！の緩衝液、１１．５　ｍｙ／ｍｌｌのアビセルを 含有する。超音波処理された調製物は１５ｍＡ！の無細胞超音波処理物、上記の 緩衝液及びアビセルを含有する。

Ｂ−グルコシダーゼの存在位置を、細胞外液を分離し、そして次に細胞を破壊し 、そして細胞壁画分と細胞液体画分に分画することによって決定した。

細胞外液中にはＢ−ガラクトシダーゼが見出されなかった。細胞の超音波破砕及 びそれに続く超遠心により、Ｂ−グルコシダーゼが可溶性のままでありそして細 胞壁又は細胞膜に密接に結合しないことが見られる。すなわち、これは細胞内性 か又はペリゾラズム性（細胞壁と膜との間に存在するか、又は弱く膜に結合して いる）である。

して主としてグルコースを生成する。この有用性を証明するため、゛シークス゛ ″（Ｃｅｔｕｓ　）パルチーＥ−７市空気分別廃棄物、°゛デートカランティー ”　（ＤａｄｅＣｏｕｎｔｙ　）市廃棄物、アビセルＰＨＩＯＩ（精製された微 結晶セルロース）−及びｐ＆ｗ、、ｐル：７°（結晶団セルロースが非常に少い ）を試、験した。これらの基質のセルロース分析を行い（第７表）、そしてＭ、 　ｂ、　Ｒ，によるこれらの糖化の比較を第８表に示す。糖化の条件は第８表に 示す。分析及び糖化の前にすべての基質を粉砕して細スクリーン（１，０ｍｍ孔 ）を通した。

第　７　表 セルロース性基質のセルロース含誉”）基　質　セルロース（支）） Ｐ＆Ｗパルプ　８５ シータス・パルチモア市廃棄物４５ デート廃棄物　４０ ＊　アプデ夛ラフ（Ｕｐｄｅｇｒａｆｆ　）法による。第３表を参照のこと。

第　８　表 基質　ＦＰアーセゝ　セルロース　グルコース　効率（Ｕ／ｍｌ）　（ｍｇ／ｍ ｌ）（ｍｖｆｎ４／２４ｈｒ）　転換（＠アビヒル１０１　０．１２　１１．５ 　２゜９２　２５．４Ｐ＆Ｗパルプ　０．１２　］、０．２　３．８５　３７． ７シータス・パルチ　０．１２　１０．８　２．０３　］、８．８モア市廃棄物 デート廃棄物　０．１．２　９．６　１．８５　１９．３糖化は粗酵素（全細胞 培養物）を用いて５５℃にてｐＨ６，５！Ｊン酸緩衝液中で行った。この調製物 は１５ｍ１の粗プロス、１０ｍ１のＰＯ４緩衝液及び十分な０．３．９ずつのア ビセル及びＰ＆Ｗパルプ、０．６ｇずつのデート及びシータス・パルチモア市材 料を含有した。

ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗ由来の粗微生物セルラーゼにより セルロース性基質ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆ＷＱ）実際的な価 値は、入手容易な基質に対するその糖化効率によシ決定されるであろう。Ｇ、Ｅ 、、ＹＸ及びトリコデルマ・レーゼイのルトが−スＣ−３０株に比べて、Ｍ、　 ｌ）、　Ｒ，酵素は高レベルのグルコースを生成するが、ＹＸ及びＣ−３０はほ とんど支配的にセロビオースを生成する。セロビオースは、追加のコストを伴っ て補充的Ｂ−グルコシダーゼを使用することにょシグルコースに転換されなけれ ばならないから、グルコースを直接生成するＭ、　ｂ、　Ｒ，の能力はこの生物 の大きな利点である。

Ｍ、　ｂ、　Ｒ，の糖化効率は、４８時間にグルコースに転換される利用可能な セルロースとして１６係以上であることが見出された。基質としてＰ＆Ｗ−９ル プを用いて、わずか２４時間での５２．３％の効率、及び生成した全還元糖の９ ５係がグルコースであることが達成された（この生成物混合物のＨＰＬＣ追跡に ついて第１２図を参照のこと）。

予想通’）、一層高レベルの酵素がグルコースノ一層の高収率をもたらす。第９ 表は、この効果の研究から得られたデータを要約する。

第　９　表 酵素濃度と糖化の関係 ＦＰ７−ゼ　全Ｒ８グルコース　グルコース　グルコ−スフｔごｉス＼４、．４ 　３６０　３１７　８８　７２．０　３１．７８．８　４８０　４５８　９５　 ５２．０　４５．８１３．２　６８０　５２３　．７７　３９．６　５２．３酸 緩衝液中での糖化。１．　］、　８　、！ｉ’バルン％ｅ　＝　１　ｇ（］、　 ％　）セルロース。

（＊）Ｆ紙分群（Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐａｐｅｒ　−ａｓｅ　）　ｗ二７ト・・２０ ｍ１全培養物（０，２２１，Ｕ、７ｍ１）−４，４１，Ｕ。

（＊＊）クルコースへのセルロースの転換（支））トｔ、テ衣示した糖化効率 すなわち、酵素レベルを３倍にすることによって、２４時間にわたる全糖化は３ ］、７％から５２３％に増加することができる。しかしながら、酵素コーニノト 尚り生成するグルコースの量に顕著な減少が存在する。セルロースのグルコース への転換は追加の酵素の使用によって増加させることができるが、その増加は添 加された酵素の量に比例的ではなく、酵素を２倍にすることにより生成するグル コースはわずか４４．５％増加する。

糖化に及ぼる基質濃度の効果 利用可能六基質の量の増力口により生成するグルコースの量が増加する。第１０ 表はこの効果の研究から得られたデータを要約する。

第　１０　表 基質濃度と糖化の関係 セルロース　グルコース　転換率（＊）　グルコース　転換率（＊）ＯＬ冷Ａ） 　Ｃｒｖ／ｄｔｔ）　（％）　（り／ｄｚ）　ｉ％）５００　２３６　４７．２ 　３３３　６６．７１０００　３５０　３５．０　５５５　５５．５２０００　 ４４２　２２．１　５９０　２９．５ＦＰアーゼ活性（４０ｍｌの全培養物、　 ０．２０１．Ｕ、　／ｍｌ＝　８．Ｏ１，Ｕ、　）　、　５８℃、　ｐＨ６，５ 緩衝液。

（−）　セルロースのグルコースへの転換シ）として表示した糖化効率。

果は基質の量に比例的ではない。すなわち、２４時間において、基質を０．５係 から１％に倍化することによシグルコースの量はわずかに４８％増加する。

今度は基質を２係に倍化することによシグルコースの追加の増加は２６係に過ぎ ない。

糖化に及ぼす基質組成の効果 種々のセルロース源はその粒子サイズ及び結晶性の程度に関して異シ、そしてそ れ故にセルラーゼ酵素複合体による攻撃に対する耐性の程度に関して異る。Ｐ＆ Ｗパルプに加えて、「標準的」糖化基質として二−−ヨークタ、イムズ紙を用い ることが決定された。タイムズは多数の供給者からの新聞用紙を確保するから、 「標準」として特定の発行をすぐに考　。

えることはできない。ガーデンステートに一パーからの再生紙、及びカナダの製 造者、スプルースホールス及びアビチビ／チャンドラ−がらの２種類のバージン パルプを含むタイムズの未印刷新聞用紙の幾つかのサンプルを入手した。

これらの新聞用紙、並びにＮ、Ｙ、タイムズの印刷された新聞紙、Ｐ＆Ｗパルプ 及び他のセルロース源を糖化研究において比較し、顕著に異ることが見出された 。第１１表は、この研究から得られたデータを基質組成と糖化の関係 乾燥重量　セロロース　グルコースη／ａ１、　Ｐ　＆　Ｗ　ｚ９　ルゾ　１． １８　１．０　３９５２、ニーーヨークタイムズ　２，２３　１．０　１１５３ 、ガーデンステート　２．２３　１７２４、スジラスフォールス　２．２３　− 　１６３５、アビチく／チャンドラー　２．２３　１１９６、ワットマンＣＣ− ４１１，００１，０２１１７、ツルカフロック５Ｗ４０　１．００　１．０　２ ４２転換（＊）　グルコースψ／ｄ１　転換（＊）１、　３９．５　５１８　５ １．８ ２、　１１．５　１３０　１３．０ ３、　１７．２　２０８　２０．８ ４、　１６．３　１８１　１８．１ ５、　１１．９　１２１　１２．１ ６、　２１．１　３０２　３０．２ ７、　２４．２　３５１　３５．１ ８、　３４．２　４７３　４７．３ Ｍ、　ｂ、　Ｒ，、８，Ｏ，１，Ｕ、による基質の糖化。ＦＰアーゼ活性（４Ｑ 　ｍｌＪ全培養物、　０．０２１．Ｕ、／ｍｌ　＝　８．０　Ｉ’、Ｕ、　）　 。

５８℃、ｐＨ６，５リン酸緩衝液中。

（＊）　セルロースのグルコースへの転換（イ）で表示した糖化効率。

Ｐ＆Ｗ／ｆルプが最も容易に分解されるセルロース源のようであり、これにソル カ・フロック（５ｏｌｋａＦｌｏｅ　）　ＢＷ２００が続く。後者は２５％のク ラフトパルプと７５％の亜硫酸パルプから成る微細にボールミル処理された生成 物である。粉砕されておらずそして１００％の亜硫酸パルプから成るソルカ・フ ロック５Ｗ４０は一層分解が困難である。新聞用紙の内アビチピ／チャンドラ− （Ａｂｉ　ｔｉｂｉ　／　Ｃｈａｎｄｌｅｒ）は、スノルスフォールス（５ｐｒ ｕｃｅ　Ｆｓｌｌｓ　）　又ハ再生すしたガーデンステ＝　ト（Ｇａｒｄｅｎ　 ５ｔａｔｅ　）に比べて攻撃に対して一層耐性が強がった。印刷されたタイムズ の相対的に弱い糖化はインクの存在によるのかもしれず、又は使用された新聞用 紙（発明者にはわからない）により容易に説明されるのかもしれない。このもの はアピチピ／チャンドラ−のサンプルと同じ速度で攻撃されたからである。

ごとく公知の方法により造成することができる。これらの方法の内化学変異原が Ｍ、ｂ、Ｒ，のセルラーゼ複合体の効率を改良することができ、同時にこれは複 合体の第３成分の細胞結合に変化を生じさせないことが見出された。例えば、化 学変異原Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニソンはＭ、　ｂ、　Ｒ， に類似する活性を有する幾つかの変異株を生成する。これらは寒天スラント上で 、そしてさらに液体窒素のもとで貯蔵され得る。Ｑｌ、　Ｑ２、ＱＲ−Ｑ、、Ｗ と称するこれらの変異株の幾つかは第１２表中に特徴付けられてお９、そしてこ れらの酵素かもとのＭ、　ｂ、　Ｒ，株及びＰｅｎｎ／ＧＥ生物の両者と比べら れている。

変異株ＱＶはＵ、Ｓ、Ｄ、Ａ寄託機関に寄託されＮＲＲＬ１５５６９の番号が与 えられている。

これらの変異株の１つ、オリゾナルＱＶは特に野性型株を超える有利な改良を示 す（第１３図）。エンドグルカナーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性はわずかに増加する だけであるがＢ−グルコシダーゼ（ｐＮＰＧアーゼ）及び沖紙活性は増加する。

この変異株が幾つかの基質に対する糖化研究において試験され（第１３表）、そ して２４時間以内にセルロースのグルコースへの７３係までの転換効率をもたら し、これにはカドキセン抽出されだブードカランティー市廃棄物の７１係の転換 が含まれるであろう。

酵素収量（ＩＵ／ｍｌ） Ｑ（Ｍｂ、Ｒ，）＊　０．１７　５，１１　０．３０Ｑ、　０．２１　６，００ 　０．６７ Ｑ２　０．１５　４，１１　０．３１ ＱＲＯ，２１２，０００，１８ ＱＳ　Ｏ，１２２，８８０，２３ ＱＴ　Ｏ，２２４，８９０，３６ ＱＵ　Ｏ，１７４，６７０，３５ ＱＶ　Ｏ，２２５，３３０，３８ ＱＷ　Ｏ，１７５，０００，３３ ＹＸ（ＧＥ）（２）　０．０６　５．００　０．３４３４　符表昭６１−５００ ００２　（１１）（１）３日全細胞培養物。すべての測定□□□：６５℃、ｏ、 　０５　ｙｉ　リン酸力Ｊレシウム緩衝液ｐＨ６，５中で行う。ＣＭＣタイム７ ＬＯＰ紙ワットマン≠１の１×６ｏｎ　ス　ト　リ　ノ　フ０　。

（２）　ＹＸ（ＧＥ）　［同等増殖条件〕。

（＊）親株。

デート布廃棄物（Ｍ、　Ｒ，対照）　１．．５０　３０酸膨潤デ一ドカウンテイ ーＭ、Ｒ，１，７５３５デードカウンティ−Ｍ、　Ｒ，のカドキセン抽出　３． ５４　７１ワットマンＣＣ−４１］、、５７　３１酸膨潤ＣＣ−４１３，６２７ ３ 抽出され、そして膨潤されたポプラ（１）　３．５１　７０Ｐ＆Ｗ／９ルプ　２ ．８６　５７ 各反応混合物は１５ｍ１の全培養ブロス、１２５ｍ９のセルロースを与えるのに 十分々基質、及び全混合物を２５ｍ１にする０、０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，５ ゜最終ｚ５ｍｌ混合物は０．２２　ＩＵ　ＦＰアーゼ活性／　ｍｌＪ、及び０． ５％のセルロースを含有する。糖化はストン・ぐ−付５０ｍ１フラスコ中、振と う機上５８℃にて行った。２４時間目のグルコース濃度をＹ、Ｓ、１．グルコー スアナライザーモデル２７Ａを用いて測定した。

（１）　リグノセルロース構造の破壊（脱リグニン）のため、又は（２）セルロ ースの構造を結晶性でなくするために、セルロースを前処理することによって微 生物酵素によるセルロース性基質の分解を増強することができることが古くから 知られている。粉砕、酸膨潤（例２を参照のこと）、アルカリ膨潤、アルコール 脱リグニン、カドキセン抽出（例２を参照のこと）、照射、蒸気破裂等を含む多 くの処理法が幾分好結果を伴って用いられてきた。一般に、これらの方法のすべ てがこの発明に従ってグルコース収量を増加するために効果的である。３つの方 法を例示的方法として試験した。

（１）８５％リン酸を用いる酸膨潤 （２）ａ酢酸及び硝酸を用いる脱リグニン（３）　カドキセン抽出 ｆ−）’カランティー市廃棄物は４０％のセルロースを含むが、Ｍ、ｂ、Ｒ，の セルラーゼの作用に耐性であり２４時間でのグルコースへの転換効率が１９条に 過ぎないことが見出された。強化されたセルロース分解活性を有する変異株ＱＶ ｆｆｉ用いて、糖化け３０％に増加した。比較として、ブードカラ苧ティー廃棄 物のカドキセン抽出物は、Ｍ、ｂ、Ｒ，の変異株の酵素を用いて、２４時間にグ ルコースのセルロースヘノ７１係の転換をもたらした。第１４図はこの効果を発 酵のスケールアンプは実験的培養サンプルについて、しばしば手に負えない問題 を提起する。栄養及び必須ガスの移行欠如が大規模な実際的製造によってしばし ば増加され、発酵を維持することが困難である。しかしながら、これらの問題に もがかわらず、振とうフラスコから７１発酵槽へのＭ、ｂ、Ｒ，０）セルラーゼ 発酵の好結果を伴うスケールアンプが達成された。振とうフラスコ培養に匹敵す るセルロース分解活性を有し、そしてＭ、　ｂ　、　Ｒ，のフラスコ培養におい て通常見られるのより２倍近いｐＮＰＧアーゼ（−グルコシダーゼ）活性を有す る発酵プロスが製造された（第１４表）。この発酵の様子を第１５図に示す。

セルラーゼ成分の生産の大きな増加がさらに、大規模ＰＨ調節の実行、並びにセ ルロース濃度及び溶存酸素の操作から導びかれるであろう。

第　１４　表 る酵素生産の比較 振とうフラノｊ　Ｏ，１８０，８３２，０５発酵槽　０．３４　０．８０　１． ９６（＊）　全ブロス測定 （ト）上溝液測定 に説明するために次の例が与えられる。

Ｍ、ｂ、Ｒ，を用いるデート廃棄物の糖化０５００ｍｌ培養フロスを増殖せしめ た。液体窒素中に凍結されたＭ、ｂ、Ｒ，の胞子を徐々に周囲温度に加温し、次 に無菌技法を用いながらこれらを培地に入れ、そして５０℃にて３日間無菌空気 に暴露する。次に、培養物を糖化活性について試験し、そして増殖した株をその 形態学的及び生化学的性質について同定する。これらの性質には、２胞子形性、 繊維状生気菌糸、及び白色〜灰白色、並びに硝酸を亜硝酸に還元しないこと、澱 粉を加水分解しないこと、及びグルコース、ラムノース及びイノシトールを利用 するがまれる。培養物を必要なときまで冷蔵庫に貯蔵する。

ブードカランティーセルロース性廃棄物のサンプルを約２０〜１００メツシユＵ Ｓ篩系列の粒子サイズに粉砕し、そして−緒にして水中２重量％のスラリーを得 る。同時に、ハガーダル／パイ培地中に存；主するのと同じ濃度でＭｇ、　Ｚｎ 、　Ｆｅ、　Ｍｎ、　Ｃａ、　ＰＯ４及ラーゼ酵素複合体を得る。電解質バラン スを生理的レベルに調整するだめに塩を加え、増殖栄養として微結晶セルロース を加え、そしてＰＨを６４５に調整しそしてアンモニア源を与えるためにリン酸 アンモニウム／リン酸す）　ｌ）ラム緩衝液を加える。セルロース性基質を含有 する曇ったスラリーを無菌７１発酵フラスコに注入し、殺菌し、そして次に各フ ラスコに、Ｍ、ｂ、Ｒ，がら単離された、そしてＰ−ニトロフェニルグルコシド 測定にょシ測定した場合に約０１ユニツト／ｍｌのＢ−グルコシダーゼ活性を有 するセルラーゼ酵素複合体（３日月の全細胞培養ブロス懸濁液からのセルラーゼ 濃度と同等）約１００ｍｇを加える。

加水分解のため、セルラーゼ複合体を含有するフラスコを無菌綿栓で栓をし、温 水振機浴に入れ、そして５８℃にて２４時時間表うした。この期間中にフラスコ の内容物は透明になるが、しかしまた粘稠になる。次に振とうを停止し、フラス コの内容物を濾過し、そして固体残渣の重量を秤る。涙液をＨＰＬＣ法によシ分 析して複合体のタイプ及び存在する糖の比率を決定する。分離されたセルラーゼ 酵素と共にこの方法を用いて、典型的には５係のセルロース性基質が残り、そし て９０チ以上のセルロース性基質が実質上すべてグルコースに転換されるであろ う。

この発明のセルロース分解活性の評価のため及びセルロース性基質の特徴付けの だめの重要な道具は高速液体クロマトグラフィー系である。一般に、この発明に 適用可能女系はポンプ及び溶離液容器の標準的配置を用いる。この系の「心臓部 」は徹底的な調製法及び注意深い充填を必要とする樹脂カラムである。

糖の分析のためにＣａイオン型の陽イオン交換樹脂を用いることができる。しか しながら、このものは純粋な水溶液中の糖（セロビオース、グルコース等）の卓 越した分離をもたらすが、糖化混合物中に存在する緩衝液及び培養ブロス中の塩 及び外来性の物質が幾つかの糖の分離を妨害し、そしてセルロースのセロ−オリ ゴサツカライドの応答を全体的に不明瞭にする。

しかしながらＨイオン型の同じ樹脂の使用が卓越しだ結果をもたらすであろう。

Ｃａイオン交換樹脂については溶離剤として水の代りに希硫酸（１１当り濃Ｈ２ ＳＯ４を３〜５滴）を使用する。培地及び緩衝液からのリン酸塩の存在がなおセ ロビオースの分離を妨害する。しかしながら、塩化カドミウムによるリン酸塩の 沈澱によってこの妨害を除去することができる。塩及び他の汚染物の全複合体は ボイドボリウムにおいてカラムから溶出し、サツカライド成分の明瞭な様子を残 すであろう。

ムの調製 ■、　出発材料は５０ｇの″アミネノクス（Ａｍ１ｎｅｘ）５　Ｑ　ｗ　−Ｘ　 ４　’″陽イオン交換樹脂（ビオ−ラド・うがラドリーズからＮａイオン型とし て販売されている）。

２　樹脂を、特に濾過〔メトリセル（Ｍｅｔｒｉｃｅｌ　）０．２ミクロンフィ ルター〕した脱イオン水により５回洗浄する。各洗浄のために２１を使用する。

（樹脂を２１の傾斜したシリンダーに入れ、混合し、そして沈降せしめる一洗浄 液を吸引によシ除去する。

３　樹脂を２１の０．５　Ｎ　ＨＣｌ　（上記のような濾過した水及びシリンダ ーを使用）に懸濁する。沈降させ、そして吸引してＨＣｌを除去する。

４　段階≠３を、ＩＮ、２Ｎ、３Ｎ、４Ｎ、５Ｎ及び６ＮＨＣ／！、　（それぞ れ２１）を用いて反復する。

５、洗浄液がおよそ中性Ｐ■Ｉとなるまで段階＋２と同様にして洗浄する。

６　段階＋３と同様にして済過された０５％Ｃａ　Ｃｔ２２１中に懸濁し、そし て１係、２％、３チ、５係、７　％　ＣａＣＺ２に進む。

７、　樹脂を２１の１０％Ｃａ　ＣＩ！−２中に懸濁し、そして攪拌しながら（ マグネティノクスターラー）８０℃にて１時間加熱する。沈降せしめそして吸引 する。

８、段階≠２と同様にして、すべての゛微粒子″が除去されそして洗浄液が透明 になるまで２０〜４０回洗浄する（シリンダーの背後にフラノシーライトを置く のが有用である）。〔沈降は約６時間である。

終点に向けて２〜４時間で沈降する。〕９　樹脂を１２５ｍ１のサイドアームフ ラスコニ移し、栓をし、そして真空の使用又はアスピレータ−のもとで脱気する 。

１〇　−夜充填する（充填カラムを使用）−充填方法についてはＢを参照のこと 。

注：もしＣａイオン型ではなくＨ＋型が望ましい場合、段階＋５及び４Ｐ６を略 す。そうではなく樹脂を６ＮＨＣａ中で８０℃にて１時間加熱し、そして次に段 階≠３に移る。

１、　分析用カラム（６０ｃｍ　Ｘ　６　ｍｍ　）に溶離液（Ｃａイオンカラム については水、又はＨイオンカラムについては希Ｈ２Ｓ０４）を充たす。

２　充填カラム（６０ｔｙｎ　Ｘ　８　ｍｍ　）を分析用カラムの頂部に付ける 。

３　樹脂を可能な限り少量の水にスラリー化し、そして・ぐスツールピにノドを 用いて充填カラムに樹脂を満たす。泡を除去するためにカラムをたたく。

４　充填カラムに蓋をし、そして３０分間置く。

次に、加熱調節器のスイッチを入れて分析用カラムを８３℃に加熱する。

５、　０１ｍ１．７分において溶離液の流れを開始し、そしてこれを、最終の流 れが０．７〜０．８　ｍｌ　７分に達するまで（背圧は約８０〜１００　ＰＳＩ であるべきである）徐々に（すなわち、１５分間毎に０．１　ｍｌの増加）上昇 せしめる。この流速で一夜攪乱しないで充填する。（朝方の背圧は約１００〜１ ５０　ＰＳＩであるべきである。） ６、流れを段階的に減少せしめ（常に１５〜３０分間にわたって徐々に流れを開 始しそして停止する）そして停止する。

７　充填カラムを注意深く除去する（分析用カラムが渦だされているべきであり 、もしそうなっていなければカラムを吹き出し、そして開始する）。

８　分析用カラムに頂部充填物及びカラムが−ドを加え、そして溶離液に連結す る（すべての空気をラインから除去し、気泡がカラム中に入るべきでない）。

９、流れを開始し、運転流であるＯ１５　ｍｌ　７分に増加する。カラムを数時 間沈降せしめる。

１０　標準試行を行い、そしてグルコース及びセロビオースのパベースライン分 離″を評価スる。（各２　ｍ９７ｍ１　：　５０μｇのサンプルがループに入る 。サンプリングホルダーは０．８　ｍｌを要する。）注にカラムを完全に閉めな いのが最良である。

日の終シには流れを０．１〜０．２　ｍｌ７分に下げ、そしてヒーターのスイッ チは常に入れセルロースのカドキセン（＊）抽出〔メンズ・イン・カーボハイド レートケミストリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　）　Ｖｏｌ、　ｆＨ（Ｈ，ウオルフンン編）アカデミツクプレス 、から誘導〕。

１．１０ｉ１０１）カドキセン試薬を史ルロース性基質ヲ含有する（１〜５ｇの セルロース）５００ｍｇフラスコに加える。

２、　ロータリー振とう機上で一夜、周囲温度（この試験では２８℃を使用）に おいて振とうする。

３、　３００　ＯＲＰＭ／１０分間遠心分離する。

４、　カドキセン溶液を１０１００Ｏフラスコにデカントし、そしてフラスコに 水を満たす。セルロースが沈澱する。

５６　セルロースを沈降せしめ、そしてこれをＰＨが中性になるまで洗浄する（ 遠心分離がこの工程を迅速にする。

６、段階＋３からの遠心分離物（不溶性残渣）に１００ｍ１の新鮮なカドキセン 溶液を加え、そして段階２〜５を反復する。（すべてのセルロースが抽出される まで続ける）。

７、　最終生成物のセルロース含量をアノ０デグラフ法によシ決定する。

（＊）　カドキセンは３０％エチレンソアミン／７゜係Ｈ２０（ｗ／ｗ　）に酸 化カドミウムを加えて飽和にした溶液である。

注：最終溶液は約５係のカドニウムである。室温にて３０分間一定攪拌しながら ２５％過剰のＣｄＯを加える。沈澱を沈降せしめそしてカドキセン溶液をデカン トする。カドキセンは無色、そして無臭（そして毒性）である。

の調製 １．８００ｍ１の８５係リン酸を水浴中で１０℃に冷却する。

２．１００＆のセルロース性基質に２００ｍ１のアセトンを加する［ワットマン ＣＣ−４１（アルファーコドンセルロース）ヲ“伝統的″ウアルセスセルロース のために用いる〕。アビセルはパルプ状調製物を３、　一定攪拌しながらセルロ ースのアセトンスラリーをゆっくりと酸に注加する。

４、水浴中で２時間、混合物を一定攪拌する。

５、上記混合物に１１の氷水を添加することによりセルロースを沈澱せしめる。

６、　セルロースを沈降せしめ、そしてこれを水及びＮａ　２　ＣＯｓで洗浄し 、そして最後にＰＨが中性に々るまで■２０で洗浄する。

７、　粒材料のセルロース含量をアゾデクラフ法によシ決定する（第３表を参照 のこと）。（純粋なセルロース、例えばＣＣ−４１について乾燥重量を用いるこ とができる。） レイ（Ｉ、ｅｈｉｇｈ　）大学〕 １、脱ＩＪクニンーアンモニア／エタノール（５０：５０　ｖ／ｖ　）　１９． ０℃複数時間。

２、　膨潤−ＮａＯＨ／エタノール（５０：５０ｖ／ｖ）１６０℃３０分間。

−２０＋４０メツシユポプラ（液：木材比１０：１）アンモニア−３０％溶液（ 液：木材比１０：１）ＮａＯＨ−３０％溶液（液：木材比　］０：１）。

０係　セルロースのロス ６０係　ヘミセルロースのロス（１）　（ＷＡＳＦ　）７０％　リグニンのロス （す（過マンガン酸カリウム酸化） ６５％　ヘミセルロースのロス（１）累積０、４　ｇＮａＯＨ／　ｊｊ木材 脱リグニン　上記に同じ １］１潤　３０〜４０％セルロースのロス６０〜７０係ヘミセルロースのロス 累積的ロス ９５％　リグニンのロス ４、脱リグニンのみ、サーモモノスポラは２４時間に１５ｑ６の加水分解（ＤＮ Ｓ　）をもたらす。

５、脱リグニン＋膨潤 ０、２　ｆｉ　ＮａＯＨ／　ｇ木材：５０％加水分解２４時間中０．２５−０． ４）、　ＯＩＩＨ２ｏ、、ｉｐ木材　０．４１１　ＮａＯル４木材＝９０％加水 分解２４時間中０．２５　ｇＨ２０７ｇ木材。

６　セルラーゼ糖化３係固体及び１．　Ｕ、１．６　ｍｇセロビオース／１酵素 ・時、５５℃にて、２時間とトキーグルコシダーゼ添加。

（リ　ＴＡＰ、ＰＩ測測定　ｉｌｅ、弱酸感受性例　４゜ 化学変異源を用いるＭ、　ｂ、　Ｒ，の変異メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ ソグアニジン（ＮＴＧ）ｔ−用いるミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆ Ｗの変異は次のようにして行うことができる。

１．１％セロビオース（セルロース不含）を含有千る５０ｍ１のＨ／Ｐ培地に５ 　ｍｌの培養物を接種：振とう機上５８℃にて培養する。

２、４８時間後５　ｍｌを新鮮な培地に移す。振とり機上で５８℃にて培養する 。

３、２４時間後５■のＮＴＧを培養物に加え、そして３０分間インキーベーショ ン啼続ケる（　Ｎ、Ｂ、Ｎ、Ｔ。

Ｇ、は殺菌し、ない−最終濃度−１００μｇ／ｍｌ）。

４、３０分間後、遠心分離により細胞を集める（　２０ＱＯｒｐｍ１５分間）。

５６　新鮮な培地で細胞を２回洗浄する。

６、新鮮な培地に再懸濁し、そして振とう機上で５８℃にて７時間インキ−ベー トする。

７、２０００ｒｐｍ１５分間遠心分離し、そしてほとんどの培養ブロスを廃棄す る。

８、残ったプロス中に細胞を再懸濁し、そしてプレートする。

Ｎ、Ｂ、　Ｎ、Ｔ、Ｇ、は変異原性であシそして発癌性である。

極度の注意をはらう必要がある。すべての廃棄物に濃ＮａＯＨを加えてオートク レーブ処理しＮ、　Ｔ、　Ｇ、を不活性化する。

浄書（内容に変更なし） 時間（時） 時間（時） ］循アビセルＰＨ−］−０２ 時間（日） 時間（日） 時間（時） ８０℃におけるミクロビスポラ ＦＩＧ、イず　ば―ざツ？二″′）ｘシ需−（全細胞）　（超音波処理）　（全 細胞）手続補正書く方式） 昭和６０年１０月２タ日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 ■　事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８４１０１３４３ ２　発明の名称 ミクロビスポラ・ヒスポラ・ルトカースＰ＆Ｗ株を用いるセルロース姓気質のク ルコースへの転換方法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　パーソンス　アンド　ウィツトモア。

インコーホレイティド ６　補正の対象 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （２）図面の翻訳文 （３）委任状 ７　補正の内容 （１，１明細書及び請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（３）別紙の通り ８　添付書類の目録 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（２）図面の翻訳文　１通 （３）委任状及び訳文　各１通 （４）　理　由　書　１通 国際調査報告 ＠発明　者　バートレイ、ティモジ−アメリカ合衆国。

−ビン　レーン オハイオ　４３５４５．ナポレオン、ジョリエット　７、ニューシャーシー　０ ８８５４ビス力タウエイ、７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．セルロース性基質の微生物的糖化方法であって： ａ．ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ ｂｉＳｐｏｒａＲｕｔｇｅｒｓＰ＆Ｗ）株及び変異株から選択されたセルラーゼ 生産性微生物培養物を水性栄養培地に接種して接種されたスラリーを生成せしめ ； ｂ．前記接種されたスラリーを、雑微生物の増殖を回避するために十分高温であ るが約８５℃より低い温度において、やや酸性〜やや塩基性のｐＨにおいて、そ して微生物の成熟培養物を生成するのに十分な時間にわたって発酵せしめ； ｃ．前記成熟培養物中の前記微生物の細胞膜を破壊して糖化酵素複合体を得； ｄ．前記糖化酵素複合体と前記セルロース性基質とを一緒にして水性混合物を形 成し；そして、ｅ．前記混合物を、雑微生物の増殖を回避するためには十分に高 温であるが約８５℃より低い濃度において、やや酸性〜やや塩基性のｐＨにおい て、そして前記セルロース性基質の少なくとも幾らかをグルコースに加水分解的 に転換するために十分な時間にわたって保持する； ことを含んで成る方法。 ２．次の微生物的分解のためにセルロース性基質を前処理する追加の段階をさら に含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 ３．未消化のセルロース性基質及び破砕された微生物培養物の実質的な部分を除 去して、主としてグルコースを含有する水性溶液を得るために媒体をろ過する追 加の段階を含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 ４．温度が約４５℃〜約８５℃である請求の範囲第１項記載の方法。 ５．ｐＨが約５．５〜約７．５である請求の範囲第１項記載の方法。 ６．８０％以上のセルロース性基質がグルコース及びセロビオースの組合わせに 転換される請求の範囲第１項記載の方法。 ７．消化されるセルロース性基質の実質上すべてがグルコースに転換されている 請求の範囲第１項記載の方法。 ８．セルロース性基質の酵素的糖化方法であって：ａ．前記セルロース性基質の 水性媒体を、ミクロヒスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗ株及びその変異株か ら選択されたセルラーゼ酵素複合体と一緒にして加水分解ブロスを生成せしめ； そして、ｂ．該加水分解ブロスを、雑微生物の増殖を回避するためには十分高い 温度であるが約８５℃より低い温度において、やや酸性〜やや塩基性のｐＨにお いて、そして前記セルロース性基質の少なくとも幾らかをグルコースに加水分解 的に転換するのに十分な時間にわたって保持する； ことを含んで成る方法。 ８．栄養培地中で微生物を増殖せしめ、複合体の分泌された成分を集め、そして 十分な分泌された成分を集めた後に微生物細胞を破壊し、そして複合体の細胞結 合成分を集めることによって酵素複合体を調製する請求の範囲第８項記載の方法 。 １０．温度が約４５℃〜約８５℃である請求の範囲第８項記載の方法。 １１．ｐＨが約５．５〜約７．５である請求の範囲第８項記載の方法。 １２．酵素複合体の濃度が、セルロース性基質の約８０％以上をグルコース及び セロビオースの組み合わせに転換するのに十分である請求の範囲第８項記載の方 法。 １３．加水分解されるセルロース性基質の実質上すべてがグルコースに転換され る請求の範囲第８項記載の方法。 １４．ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗを選択するためにミクロピ スホラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗを含有する微生物混合物をセルロース性基 質上で前培養する方法であって：ａ．前記混合物を湿潤セルロース性基質上に接 種し； ｂ．接種されたレジュームを胞子が形成されるまで約４５℃〜約８５℃の温度に 保持し；そして、ｃ．アンモニア性窒素源及び唯一の炭素源としてのセルロース 性基質を含有する増殖誘導培地にプレートする； ことを含んで成る方法。 １５．Ｍ．ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗを、Ｋ、Ｍｎ、Ｃａ、Ｆｅ及びＮａ鉱物 、リン酸緩衝液、並びにアンモニウム塩を含有する水性液体培地に移す追加の段 階を含んで成る請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．温度が約５８℃であり、時間が約２４時間であり、そしてｐＨが約６．５ である請求の範囲第１４項記載の方法。 １７．培養されそして実質上純化された形の微生物ミクロビスポラ・ビスポラ・ ルトガースＰ＆Ｗ及びそのセルラーゼ生産性変異株。 １８．セルロース性基質の微生物的糖化方法であって： ａ．水性栄養培地に、ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗ及びその変 異株から選択されたセルロース生産性微生物培養物を接種して接種されたスラリ ーを生成せしめ； ｂ．前記接種されたスラリーを約４５℃〜約８５℃の温度及び約５．５〜７．５ のｐＨにおいて発酵せしめて微生物の成熟培養物を生成せしめ；ｃ．前記成熟培 養物中の前記微生物の細胞膜を破砕することによって糖化酵素複合体を得；ｄ． 前記糖化酵素複合体と前記セルロース性基質とを一緒にして水性混合物生成せし め；そして、ｅ．前記水性混合物を約４５℃〜約８５℃の温度及び約５．５〜７ ．５のｐＨにおいて約２時間〜１０日間保持して、前記セルロース性基質の９０ ％以上を実質上すべてがグルコースである加水分解生成物に加水分解的に転換す る； ことを含んで成る方法。 １９．セルロース性基質の酵素的糖化方法であって：ａ．前記セルロース性基質 の水性媒体と、ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗ株及びその変異株 から選択されたセルラーゼ生産性微生物から単離されたセルラーゼ３酵素複合体 とを一緒にすることにより加水分解ブロスを生成せしめ；そして、ｂ．該加水分 解ブロスを約４５℃〜約８５℃の温度及び約５．５〜７．５のｐＨにおいて約２ 時間〜１０日間保持することにより前記セルロース性基質の約９０％以上を実質 上すべてグルコースである加水分解生成物に転換する； ことを含んで成る方法。 ２０．ｐ−ニトロフェニルグルコシド基質測定により測定した場合約０．１ユニ ット／ｍｌ以上のＢ−グルコジダーゼ活性レベルを有しそして３日目の全細胞培 養ブロスから調製された無細胞超音波処理生成物に由来し、その糖化活性のグル コース阻害に対して実質的な耐性及び約４５℃〜約８５℃の機能温度範囲を有す る、エンド−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びＢ−グルコシダーゼのセ ルラーゼ３酵素複合体。 ２１．微生物ミクロビスポラ・ビスポラ・ルトガースＰ＆Ｗ又はそのセルラーゼ 生産性変異株から単離される請求の範囲２０項記載の複合体。 ２２．前記微生物を栄養培地中に増殖せしめ、複合体の分泌された成分を集め、 そして十分な分泌された成分を集めた後、微生物細胞を破砕しそして複合体の細 胞結合成分を集めることにより単離された請求の範囲第２０項記載の補合体。