CN101705200B - 一株产生物表面活性剂的铜绿假单胞杆菌 - Google Patents
一株产生物表面活性剂的铜绿假单胞杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株产生物表面活性剂的假单胞杆菌，该菌株名为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1，菌株已于2009年11月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.3448。本发明提供的铜绿假单胞杆菌可转化葡萄糖、甘油、废油脂等产生鼠李糖脂类生物表面活性剂；单位体积发酵液中鼠李糖脂类生物表面活性剂产率高，是一株极具研究开发价值的菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一株铜绿假单胞杆菌，尤其涉及一株可产生物表面活性剂的假单胞杆菌菌株，属于生物技术领域。
背景技术
生物表面活性剂是由微生物产生的一类具有表面活性物质。它具有增溶、高特异性、生物相容性、高生物降解能力、临界胶束浓度低和能显著降低界面张力等优点，尤其是其良好的生物相容性及对环境无毒害的特点，这是化学生物表面活性剂所不具备的。目前，市场上销售的表面活性剂的绝大部分是通过化学合成而生产的。但随着人们对环境问题的担忧，使用生物表面活性剂来替代化学合成的表面活性剂成为人们所努力的方向。
生物表面活性剂最大的潜在市场是用于环护方面，比如利用产表面活性剂的微生物生物去除烃类等碳氢化合物、有机物和重金属污染的土壤，以及用于原油回收和泄漏处理等。预计到2010年生物表面活性剂能够占到10％的表面活性剂市场份额。
除在环境保护方面的用途外，生物表面活性剂在食品、化妆品、药剂学和化学工业(生物表面活性剂可能具有传统表面活性剂所不具有的特性)等方面也具有广泛的用途。影响生物表面活性剂广泛使用的主因是生物表面活性剂的生产成本较高，其原因之一就是菌株表面活性剂的产率相对较低，因此，从自然环境中分离筛选性能优良菌株仍是生物表面活性剂研究领域重要的工作内容。
生物表面活性剂有糖脂类、脂肽类和脂蛋白、糖蛋白等多种。报道最多的是假单胞杆菌产生鼠李糖脂类表面活性剂。鼠李糖脂是微生物表面活性剂中重要的一个品种，产量高、具有较好的商业开发价值。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一株高产表面活性剂的假单胞杆菌。该菌株可转化葡萄糖、甘油、废油脂等产生鼠李糖脂类生物表面活性剂。
本发明所述高产生物表面活性剂的假单胞杆菌，其特征在于：该菌株名为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1，菌株已于2009年11月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.3448；其中所述生物表面活性剂经分析鉴定属于鼠李糖脂类生物表面活性剂。
上述铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448的菌学特征是：
菌株CGMCC N0.3448固体培养(细菌完全培养基)菌落圆形，扁平，边缘不整齐，表面有金属光泽，37℃培养24小时，菌落2-3mm。菌株CGMCC N0.3448为短杆菌，不形成芽胞，菌体形态直或稍弯、两端钝圆，大小0.5～0.8μm×1.5～3.0μm，有运动性，细菌完全培养基斜面37℃培养24小时产生蓝绿色水溶性色素，在血琼脂平板上(羊血)菌落周围形成透明溶血圈(见图1)。在肉汤中形成菌膜，肉汤微混浊，菌液上层呈绿色。
菌株CGMCC N0.3448生理生化特征是：革兰氏染色阴性，好氧，最适生长温度37℃，在45℃生长良好。菌株CGMCC N0.3448 45℃在细菌完全培养基能够生长，但不产色素，这在菌种鉴定手册及其他文献中没有描述；利用葡萄糖、果糖、柠檬酸盐，接触酶阳性；生理生化实验结果详见表1。
表1菌株CGMCC N0.3448的部分生理生化特征
注：“+”生长良好或呈阳性；“-”不生长或呈阴性。
上述用于菌体形态观察的液体培养基组成(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述用于菌体形态观察的固体培养基组成(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。
上述铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448是由长期被石油污染的土壤中以常规方法分离筛选得到。
即从长期被油脂污染的环境中用常规方法取样，将固体样品制成悬浮液接入富集培养基、液体样品直接接入富集培养基中，37℃摇瓶振荡培养，再将富集液稀释涂布到平板培养基，37℃恒温培养，待长出单菌落后移接斜面30℃恒温培养。再分别接种入原油液体培养基中，于37℃、180r/min摇瓶振荡培养，选择具有原油乳化效果的的菌株。
将选取的具有原油乳化的菌株再进行摇瓶发酵筛选。
将发酵液4000r/min离心10min，取上清液备用。取一直径9cm的培养皿，加30mL蒸馏水，在水面上滴加0.2mL液体石蜡，待形成油膜后，在油膜中央滴加0.1mL适当稀释的的发酵液上清液，形成稳定的排油圈后测量排油圈直径。
选择排油圈直径最大的菌株，获得SFRH-1菌株，该菌株已于2009年11月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.3448。
上述铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448在制备生物表面活性剂中的应用。
利用CGMCC NO.3448菌株发酵生产生物表面活性剂的方法如下：
摇瓶发酵：取35-40℃培养1-2天的新鲜斜面接种液体种子培养基，37℃培养12-28小时，接种摇瓶发酵培养基，35-40℃摇瓶发酵48-72小时。
或将37℃培养1-2天的新鲜斜面接种液体种子培养基35-40℃培养10-16小时，按1-5％的接种量接入到发酵罐中，35～40℃进行通风搅拌培养，40～70小时，结束发酵。
取1L发酵液，3000-5000r/min离心10min，收集上清液，用6mol/L HCl溶液调pH为1.8-2.2，置4℃冰箱静置过夜，然后液体再经6000-8000r/min离心10min，收集沉淀即为菌株CGMCC NO.3448所产表面活性剂粗品。
上述表面活性剂发酵的培养温度优选为37℃。
上述在液体种子培养基上培养时间优选为12-14小时。
上述在生物表面发酵培养时间优选为52-64小时。
上述表面活性剂提取过程中，发酵液pH值调整优选为2.0。
上述铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂性质的鉴定。
生物表面活性剂依据其化学组成和微生物来源可分为糖脂、脂肽和脂蛋白、磷脂和脂肪酸、聚合物和全细胞表面本身等五大类。其中，最常见的是糖脂和脂肽类，而糖脂中最常见的是鼠李糖脂。鼠李糖脂是一种阴离子生物表面活性剂。据文献报道铜绿假单胞菌产生的表面活性剂多为鼠李糖脂，本发明对菌株CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂性质进行了鉴定。
称取按上述方法制取的菌株CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂粗品2g，加水50mL分散溶解，再加入1.5mL浓盐酸，115℃水解20min，然后用NaOH溶液中和至中性，定容至100mL，得到样品水解液。用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法(张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社.1987.)测定水解液中的还原糖含量，发现水解样品中还原糖比未水解样品中有显著增加，说明菌株CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂中含有还原糖组分。
确定菌株CGMCC NO.3448产物中含有还原糖组分后，本发明又采用纸层析的方法(张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社.1987.)对产物水解液中的糖组分进行了分析鉴定。
展层剂：正丁醇∶吡啶∶水＝6∶4∶3(V/V/V)
显色剂：称取1.6g邻苯二甲酸加入到100mL水饱和的正丁醇溶液中，溶解后再加入0.9mL苯胺。
显色方法：展层结束后，取出滤纸自然晾干，将滤纸的一面用显色剂喷雾后，置105℃加热5min显色。
将10g/L葡萄糖、10g/L鼠李糖标准溶液及样品水解液各20μL点样，展层结束后，显色。纸层析结果(见图2)显示：样品水解液的有且只有1个层析斑点，该斑点位置与鼠李糖标准品的一致，Rf值相同，说明样品中所含糖组分为鼠李糖。
本发明对菌株CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂带电性能进行了检测。
采用文献(Hua Z Z.Basic，Characteristics of Biosurfactants produced with CandidaAntarctica[J].Detergent and Cosmetics，2000，23(1)：78-80.)提供的方法，对菌株CGMCCNO.3448所产生物表面活性剂的粗品的带电性能进行了检测。
取25mL试管，加入0.1g样菌株CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂粗制品，加入10mL亚甲基蓝水溶液(0.5g/L)和5mL氯仿，用力振荡数分钟，氯仿层变蓝色，证明菌株CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂是阴离子生物表面活性剂。本发明采用阳离子生物表面活性剂检测方法(溴酚蓝测定法：取一25mL试管，加入5mL样品，再加2-5滴溴酚蓝溶液，若样品-溴酚蓝混合液变成深蓝色则证明是阳离子生物表面活性剂)，样品未变色，证明菌株CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂不是阳离子生物表面活性剂。
以上检测表明：本发明的铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂为鼠李糖脂类表面活性剂。
本发明提供的铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448可转化葡萄糖、甘油、废油脂等产生鼠李糖脂类生物表面活性剂；单位体积发酵液中鼠李糖脂类生物表面活性剂产率可达15-20g/L，是一株极具研究开发价值的菌株。
本发明采用生物发酵的方法，以葡萄糖、甘油、废油脂等为原料利用CGMCCNO.3448菌株生产鼠李糖脂类生物表面活性剂，具有生产方法简单，条件温和，原料来源丰富，生产成本低等特点，极具开发应用前景。
附图说明
本发明提供的铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株SFRH-1，已于2009年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物所，邮编：100101，其保藏编号为CGMCC NO.3448。
图1示铜绿假单胞杆菌CGMCC NO.3448在血平板(济南市卫生科技交流服务中心提供)上的溶血圈。
图2示铜绿假单胞杆菌CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂水解产物纸层析图谱。图中“葡萄糖”斑点为标准葡萄糖，图中“样品”斑点为菌株CGMCC NO.3448产物水解样品，图中“鼠李糖”斑点为标准鼠李糖。
具体实施方式
实施例1产生物表面活性剂的铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株筛选。
从胜利油田长期被油脂污染的环境中用常规方法取样，将固体样品制成悬浮液接入富集培养基、液体样品直接接入富集培养基中，30℃摇瓶振荡培养5d，再将富集液稀释涂布到平板培养基，37℃恒温培养，待长出单菌落后移接斜面，37℃恒温培养24h。再分别接种入原油液体培养基中，于37℃、180r/min摇瓶振荡培养5d，选择具有原油乳化效果的的菌株。
将选取的具有原油乳化的菌株再进行摇瓶发酵筛选。
将发酵液4000r/min离心10min，取上清液备用。取一直径9cm的培养皿，加30mL蒸馏水，在水面上滴加0.2mL液体石蜡，待形成油膜后，在油膜中央滴加0.1mL适当稀释的的发酵液上清液，形成稳定的排油圈后测量排油圈直径。
选择排油圈直径最大的菌株获得SFRH-1菌株，该菌株已于2009年11月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.3448。
上述筛选用富集培养基组成为(g/L)：(NH4)2SO4 2.0，MgSO4 0.5，KH2P4 10.0，Na2HPO4 4.0，NaCl 2.0，酵母膏0.5，液体石蜡20.0，微量元素液5.0，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
其中，微量元素溶液组成为(g·L-1)：ZnSO4·7H2O 0.29，CaCl2·2H2O 0.24，CuSO4·5H2O0.25，MgSO4·7H2O 0.17。
上述筛选用平板培养基组成为(g·L-1)：葡萄糖20.0，(NH4)2SO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO4 4.0，pH7.0，琼脂20.0。
上述筛选用原油液体培养基组成为(g·L-1)：(NH4)2SO4 2.0，MgSO4 0.5，KH2PO410.0，Na2HPO4 4.0，NaCl 2.0，酵母膏0.5，原油20.0，微量元素液5.0，pH 7.0。
上述斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
实施例2铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448在制备生物表面活性剂中的应用
菌种选用铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448；
摇瓶发酵：取37℃培养1-2天的菌种斜面接种液体种子培养基，37℃培养20小时，接种摇瓶发酵培养基中，37℃摇瓶发酵64小时。
取1L发酵液，4000r/min离心10min，收集上清液，用6mol/L HCl溶液调pH为2，置4℃冰箱静置过夜，然后液体再经7000r/min离心10min，收集沉淀即为菌株CGMCCNO.3448所产表面活性剂粗品。
表面活性剂粗品用盐酸水解，水解液用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定水解液中的还原糖含量，显示菌株CGMCC NO.3448所产生物表面活性剂中含有还原糖组分。然后采用纸层析的方法(张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海：上海科学技术出版社.1987.)对产物水解液中的糖组分进行了分析鉴定。纸层析结果(见图2)显示：样品水解液的有且只有1个层析斑点，该斑点位置与鼠李糖标准品的一致，Rf值相同，提示样品中所含糖组分为鼠李糖。
上述斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述发酵用液体种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20.0，NH4NO3 2.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO4 4.0，MgSO4·7H2O 0.5，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
上述发酵用培养基组成(g·L-1)：葡萄糖20.0，(NH4)2SO4 2.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO44.0，MgSO4·7H2O 0.5，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例3铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448在制备生物表面活性剂中的应用
菌种选用铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448；
将37℃培养1-2天的菌种斜面接种液体种子培养基，37℃培养14小时，按体积比5％的接种量接入到发酵罐中，37℃进行通风搅拌培养60小时，结束发酵。
取1L发酵液，5000r/min离心10min，收集上清液，用6mol/L HCl溶液调pH为2.0，置4℃冰箱静置过夜，然后液体再经7000r/min离心10min，收集沉淀即为菌株CGMCCNO.3448所产表面活性剂粗品。
表面活性剂粗品用盐酸水解，水解液用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其中的鼠李糖含量，然后根据鼠李糖脂的平均分子量计算发酵液中的鼠李糖脂产率为15.5g/L。
上述斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述发酵用液体种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20.0，NH4NO3 2.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO4 4.0，MgSO4·7H2O 0.5，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
上述发酵用培养基组成(g·L-1)：葡萄糖20.0，(NH4)2SO42.5，KH2PO410.0，Na2HPO44.0，MgSO4·7H2O 0.5，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例4铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448在制备生物表面活性剂中的应用
菌种选用铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1 CGMCC NO.3448；
将37℃培养1-2天的菌种斜面接种液体种子培养基，40℃培养12小时，按体积比5％的接种量接入到发酵罐中，37℃进行通风搅拌培养66小时，结束发酵。
取1L发酵液，4500r/min离心10min，收集上清液，用6mol/L HCl溶液调pH为2.0，置4℃冰箱静置过夜，然后液体再经8000r/min离心10min，收集沉淀即为菌株CGMCCNO.3448所产鼠李糖脂类生物表面活性剂粗品。
取适量上述表面活性剂粗品用盐酸水解，水解液用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其中的鼠李糖含量，然后根据鼠李糖脂的平均分子量计算发酵液中的鼠李糖脂产率为19.0g/L。
上述斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述发酵用液体种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20.0，NH4NO3 2.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO4 4.0，MgSO4·7H2O 0.5，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
上述发酵用培养基组成(g.L-1)：甘油20.0，(NH4)2SO4 2.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO44.0，MgSO4·7H2O 0.5，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
实施例5铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1CGMCC NO.3448在制备生物表面活性剂中的应用
菌种选用铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1CGMCC NO.3448；
将37℃培养1-2天的菌种斜面接种液体种子培养基，37℃培养12小时，按体积比5％的接种量接入到发酵罐中，37℃进行通风搅拌培养72小时，结束发酵。
取1L发酵液，4500r/min离心10min，收集上清液，用6mol/L HCl溶液调pH为2.0，置4℃冰箱静置过夜，滤去表层油脂，然后清液再经8000r/min离心10min，收集沉淀即为菌株CGMCC NO.3448所产鼠李糖脂类生物表面活性剂粗品。
取适量上述表面活性剂粗品用盐酸水解，水解液用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其中的鼠李糖含量，然后根据鼠李糖脂的平均分子量计算发酵液中的鼠李糖脂产率为17.8g/L。
上述斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠3，琼脂20，调整pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述发酵用液体种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20.0，NH4NO3 2.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO4 4.0，MgSO4·7H2O 0.5，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
上述发酵用培养基组成(g·L-1)：豆油20.0，(NH4)2SO4 2.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO44.0，MgSO4·7H2O 0.5，调整pH7.0-7.2，自来水配制。
Claims (2)
1.一株产生物表面活性剂的假单胞杆菌，其特征在于：该菌株名为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)SFRH-1，菌株已于2009年11月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.3448。
2.如权利要求1所述的产生物表面活性剂的假单胞杆菌，其特征在于：所述生物表面活性剂是鼠李糖脂类生物表面活性剂。
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