CN1260352C

CN1260352C - 自絮凝产氢细菌

Info

Publication number: CN1260352C
Application number: CN 200410043835
Authority: CN
Inventors: 邢德峰; 任南琪; 李秋波
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2006-06-21
Anticipated expiration: 2024-08-27
Also published as: CN1624109A

Abstract

自絮凝产氢细菌，它涉及一株自絮凝发酵产氢细菌新种。本发明的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1152。该菌株的16S rRNA基因序列GenBank注册号为AY675965，16S-23S rRNA间隔区序列注册号为AY556390。菌株YUAN-3为专性厌氧杆菌，代谢特征为乙醇发酵，最大比产氢速率为22.6mmolH₂/g drycell·h，单位体积产氢速率为1568.0mL/L培养液。在生物制氢反应器内能形成沉降性能很好的絮凝颗粒，并达到其最佳产氢和生长条件，无需载体或者填料可进行连续流产氢，大大提高了产氢速率、降低了运行成本。

Description

自絮凝产氢细菌

技术领域：

本发明涉及一株发酵产氢细菌，具体涉及一株自絮凝发酵产氢细菌新种哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanologenbacterium Harbin YUAN-3)。

背景技术：

生物制氢技术是解决能源危机和环境污染问题的重要手段之一，由于其具有双重功效和可持续性特点，日益受到世界各国的重视。提高产氢效率是生物制氢技术工业化亟待解决的难题。筛选出高效产氢细菌是加快实现生物制氢工业化的有效途径。为了获得高效产氢发酵细菌，国外研究者分离了大量的产氢发酵细菌，分离的产氢发酵菌株多数集中在梭菌属和肠杆菌属。Kumar等从树叶榨出物中分离到阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)IIT-BT08，该菌株在36℃，培养液pH值6.0条件下，最大产氢速率为29.63mmol H₂/g dry cell·h，是目前报道的产氢能力最高的细菌。产氢细菌的连续流发酵工艺是发酵法生物制氢技术实现工业化生产的关键环节之一。如Rachman等(1998)利用自絮凝细菌采用填充床式反应器(PBR)对产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)HU-101和AY-2进行了18d连续培养。Kumar等(2000)以椰子壳纤维固定阴沟肠杆菌(Enterobacter clocae)IIT-BT08进行了连续流培养。目前主要是采用固定化技术，不仅增加了运行成本，而且不易保持生物量。因此分离自絮凝细菌采取非固定化的产氢细菌更具有实际意义。由于制氢反应器的生长条件与静态培养不同，尤其是产酸发酵过程中反应系统的pH均较低，因此目前所分离的高效发酵细菌虽然具有较高的产氢能力，但是在反应器内往往不能达到其最佳产氢和生长条件，高效产氢细菌不能成为微生物群落中的优势种群，只能采取固定化方式，限制了其产氢效能，增加了运行成本。为了进一步提高系统的产氢能力，需要分离既高效产氢和强耐酸性，又能成为优势生长的自絮凝细菌，更具有现实意义和工程应用价值。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有自絮凝能力、高产氢能力和强耐酸能力的自絮凝产氢细菌，它有利于实际工程应用，具有很大的推广价值。本发明的自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国，北京，中关村，邮政编码：100080)保藏，命名为哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanologenbacterium HarbinYUAN-3)，保藏编号为CGMCC No.1152，保藏日期为2004年5月25日。本发明的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3是从连续流生物制氢反应器CSTR中取出一定量产氢发酵活性污泥，通过自主设计的培养基，采用改进的Hungate厌氧技术分离获得的，它是一株既有高效的产氢效率强絮凝能力又有耐酸特征的细菌。本发明的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的筛选方法如下：(一)采用细菌分离培养基对菌株进行产氢细菌的分离、纯化和筛选；(二)将筛选出的自絮凝产氢菌株重复分离、纯化，进行自絮凝高效产氢菌株的优选。本发明所得的菌株为细菌新种，所属分类学“属”为一新属，命名为产乙醇杆菌属(Ethanologenbacteriumssp.)，为首次命名的分类学新属。哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanologenbacterium Harbin YUAN-3)具有如下生物学特征：

一、形态特征：细菌为革兰氏阳性杆菌，有荚膜，无内生芽孢，专性厌养生长，细菌长短多变(宽0.4μm～0.5μm×长2μm～8μm)。透射电镜观测，发现菌体周生鞭毛，扫描电镜观测菌体有表面呈现凹凸不平。在固体培养基上生长时，为乳白色圆形菌落，表面光滑，边缘整齐。该菌株在液体培养基振荡培养时具有很强的自絮凝效果，可形成大的絮体颗粒。

二、生理生化特征：菌株YUAN-3的生长以OD₆₀₀的吸光度值表示，通过细菌对数时期单位内数量的增长计算生长代时为4.0h。可以利用柠檬酸生长，牛乳石蕊试验、M.R.、V.P.、明胶试验均为阳性，硝酸盐试验和H₂S试验均呈阴性。以糖蜜和葡萄糖为底物，最适发酵产氢和自絮凝温度为36℃，最适生长pH为4.5，最适产氢pH为4.0。菌株YUAN-3在以葡萄糖为碳源时主要发酵产物为乙醇、乙酸、H₂、CO₂和少量的乳酸，乙醇和乙酸的百分含量占挥发酸和醇总量的90％以上，乙醇含量不低于挥发酸和醇总量的45％。菌株YUAN-3的最大比产氢速率为22.6mmolH₂/g drycell·h，最大累积产氢量为1568mL/L培养液。

三：菌株的分子生物学鉴定结果：菌株YUAN-3的16S rRNA基因序列在GenBank的注册号为AY675965，与其最相近种属纤维素梭菌(ClostridiumCellulosi)的相似性为94％，为一新属细菌。16S-23S rRNA间隔区序列注册号为AY556390，序列比对结果显示保守区域仅为tRNA^Ala和tRNA^Ile序列，变异区域与其它种属细菌16S-23S rRNA间隔区序列没有同源性区域。

四：工程应用特性：本发明的自絮凝产氢细菌菌株YUAN-3可以利用大豆、玉米、土豆及糖蜜废水和啤酒废水等碳水化合物产氢。由于其具有自絮凝特性，因此不用添加填料或者载体，投加到连续流搅拌槽式反应器和生物膨胀床反应器后能够连续流产氢。容积负荷60～70kgCOD/(m³·d)时，产氢数率平均为6～10L/(L反应器·d)。按照本发明的方法筛选出的细菌不仅具有较高的产氢能力，在反应器内能形成良好的絮体颗粒，保持很大的生物量，达到其最佳产氢和生长条件，使其成为微生物群落中的优势种群。由于具有较强的自絮凝能力，因此发酵时不需要载体，降低了运行成本，具有现实意义和工程应用价值。

附图说明：

图1为本发明的自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3自絮凝效果图，图2为自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的扫描电镜图，图3是自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的透射电镜图。

具体实施方式：

具体实施方式一：本实施方式的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanologenbacterium Harbin YUAN-3)按照下述步骤进行选育：

一、菌株的分离、纯化和筛选：采用改良的细菌分离培养基进行产氢细菌的分离，其具体步骤如下：a、从连续流生物制氢反应器CSTR中取出1～2mL产氢发酵活性污泥，放入充满氮气的三角瓶中，加入数颗玻璃珠，在摇床上振荡1h，将污泥中菌胶团打碎，用无菌水稀释至10^-1～10^-11ml；b、将0.2～0.5ml菌株接种于10ml固体培养基中，制成滚管，培养7～10d；c、挑取单菌落转接入液体培养基中，观测是否有絮体颗粒产生，有絮体形成的即为自絮凝细菌；d、重复以上操作3～10次，直至絮凝状态良好，即絮凝颗粒直径为0.5～1.5cm，培养基完全澄清，絮体在打碎后仍能重新絮凝，用电镜确认是否为纯菌株；e、将分离纯化的絮凝发酵细菌转接于液体培养基中，在36℃、120r/min的条件下振荡培养3d，用1mL无菌注射器从其气相中取样，检测其气相成分中是否有氢气存在，如果有即为自絮凝产氢细菌。所述培养基(固体培养基)由下述成分组成：葡萄糖10～30g、胰蛋白胨2～6g、牛肉膏1～4g、酵母汁0.1～1.5g、NaCl 2～6g、K₂HPO₄ 0.5～3g、L-半胱氨酸0.1～1g、FeSO₄.7H₂O 0.1～0.5g、MgCl₂ 0.1～0.5g、微量元素5～20ml、维生素5～15ml、刃天青0.01～0.1％(w/v)。所述液体培养基由下述成分组成：葡萄糖10～30g、胰蛋白胨2～6g、牛肉膏1～4g、酵母汁0.1～1.5g、NaCl 2～6g、K₂HPO₄ 0.5～3g、L-半胱氨酸0.1～1g、FeSO₄.7H₂O 0.1～0.5g、MgCl₂ 0.1～0.5g、微量元素5～20ml、维生素5～15ml、刃天青0.01～0.1％(w/v)、琼脂1～2％(w/v)。所述培养基(固体培养基)优选由下述成分组成：葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、牛肉膏2g、酵母汁1g、NaCl 4g、K₂HPO₄ 1.5g、L-半胱氨酸0.5g、FeSO₄.7H₂O 0.1g、MgCl₂ 0.1g、微量元素10ml、维生素10ml、刃天青0.02％(w/v)。所述液体培养基优选由下述成分组成：葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、牛肉膏2g、酵母汁1g、NaCl 4g、K₂HPO₄ 1.5g、L-半胱氨酸0.5g、FeSO₄.7H₂O 0.1g、MgCl₂ 0.1g、微量元素10ml、维生素10ml、刃天青0.02％(w/v)、琼脂1～2％(w/v)。所述微量元素由下述成分组成：MnSO₄.7H₂O0.01～0.05g、ZnSO₄.7H₂O 0.05～0.1g、H₃BO₃ 0.01～0.05、N(CH₂COOH)₃ 4～5g、CaCl₂.2H₂O 0.01～0.05g、Na₂MoO₄ 0.01～0.05g、CoCl₂.6H₂O 0.1～0.5g、AlK(SO₄)₂ 0.01～0.05g，定容1000mL；所述维生素由下述成分组成：钴铵素0.01～0.05g、抗坏血酸0.01～0.05g、核黄素0.01～0.05g、柠檬酸0.01～0.05g、吡多醛0.03～0.1g、叶酸0.01～0.05g、对氨基苯甲酸0.01～0.05g、肌酸0.01～0.05g，定容1000mL。所述微量元素优选由下述成分组成：MnSO₄.7H₂O 0.01g、ZnSO₄.7H₂O 0.05g、H₃BO₃ 0.01、N(CH₂COOH)₃ 4.5g、CaCl₂.2H₂O 0.01g、Na₂MoO₄0.01g、CoCl₂.6H₂O 0.2g、AlK(SO₄)₂ 0.01g，定容1000mL；所述维生素优选由下述成分组成：钴铵素0.01g、抗坏血酸0.025g、核黄素0.025g、柠檬酸0.02g、吡多醛0.05g、叶酸0.01g、对氨基苯甲酸0.01g、肌酸0.025g，定容1000mL。

二、自絮凝高效产氢菌株的优选：将筛选出的自絮凝产氢菌株，重复分离、纯化操作，待其产气稳定后，测其产氢能力，并将产氢能力高的菌株，重复分离操作，取在固体培养基中产生气泡较大的细菌菌落进行纯化，反复上述步骤，直至滚管中细菌稳定产生大而多的气泡为止；富集后，再测其产氢能力，反复多次，直至优选出强自絮凝和产氢能力最高的菌株为止。

三、细菌的生理生化分析：细菌的生长用紫外分光光度计，在600nm处测定样品的吸光度值，作为菌浊。不同菌浊的细菌干重测定是将样品在5000r/min下离心，弃上清液，用无菌纯水洗细菌沉淀2次，80℃干燥12h，用精密电子天平称其重量。形态学鉴定参照文献方法(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2001.)。

四、菌株分类鉴定：提取细菌基因组DNA，用于16S rDNA扩增的PCR反应引物为通用引物：正向引物BSF8/20：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′；反向引物BSR1541/1522：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′，分别对应于大肠埃希氏菌(E.coli)16S rRNA的8～27和16S rRNA的1522～1541碱基。16S-23S rRNAITS的扩增引物为PSA1486/1505：5′-GGGGTGAAGTCGTAACAAGG-3′；PLA209/189：5′-GGTACITAGATGT TTCAGTTC-3′，分别对应于E.coli16S rRNA的1486～1505和23S rRNA的189～209碱基。所述PCR反应体系(50μL)如下：10×buffer(mg²⁺)5μL、2.5mmol/L dNTP 5μL、20pmol/L引物各1μL、ExTaq DNA酶0.25μL。所述PCR扩增条件如下：95℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 30S；72℃ 1min，30个循环；72℃ 8min，用pMD18-T载体克隆，进行序列测定。

五、产氢细菌发酵产物和最佳发酵产氢条件分析：发酵产物的分析挥发酸和醇类测定，使用GC122型气相色谱仪，取1mL培养液，离心5000r/min，取上清液进样，柱长2m，担体GDX103，60～80目，氢火焰检测器，氮气作载气，流速60mL/min，氢气流速为50mL/min，空气流速为490mL/min，汽化室210℃，柱和检测室190℃。氢气和二氧化碳测定，使用SC-II型气相色谱仪，柱长2m，担体为TDS-01，60～80目，热导池检测器，氮气作载气，流速为70mL/min，柱和检测室150℃。通过静态试验优化发酵工艺，确定影响发酵工艺的最适底物、最佳生长和产氢温度、pH值。本实施方式筛选出的菌株YUAN-3具有如下特征：

一、形态特征：细菌为革兰氏阳性杆菌，有荚膜，无内生芽孢，专性厌养生长，细菌长短多变(宽0.4μm～0.5μm×长2μm～8μm)。透射电镜观测，发现菌体周生鞭毛，扫描电镜观测菌体有表面呈现凹凸不平。在固体培养基上生长时，为乳白色圆形菌落，表面光滑，边缘整齐。该菌株在液体培养基振荡培养时具有很强的自絮凝效果，可形成大的絮体颗粒，直径0.5～1.5cm，培养基完全澄清，絮体颗粒在打碎后仍然能够重新絮凝(见图1～图3)。

二、生理生化特征：菌株YUAN-3的生长以OD₆₀₀的吸光度值表示，通过细菌对数时期单位内数量的增长计算生长代时为4.0h。可以利用柠檬酸生长，牛乳石蕊试验、M.R.、V.P.、明胶试验均为阳性，硝酸盐试验和H₂S试验均呈阴性。以糖蜜和葡萄糖为底物，最适发酵产氢和自絮凝温度为36℃，最适生长pH为4.5，最适产氢pH为4.0。菌株YUAN-3在以葡萄糖为碳源时主要发酵产物为乙醇、乙酸、H₂、CO₂和少量的乳酸，乙醇和乙酸的百分含量占挥发酸和醇总量的90％以上，乙醇含量不低于挥发酸和醇总量的45％。该菌株的发酵气体主要为氢气和二氧化碳，氢气百分含量45％～55％，最大比产氢速率为22.6mmolH₂/g drycell·h，最大累积产氢量为1568mL/L培养液。

三、菌株的分子生物学鉴定结果：菌株YUAN-3的16S rRNA基因序列在GenBank的注册号为AY675965，与其最相近种属纤维素梭菌(ClostridiumCellulosi)的相似性为94％，为一新属细菌。16S-23S rRNA间隔区序列注册号为AY556390，序列比对结果显示保守区域仅为tRNA^Ala和tRNA^Ile序列，变异区域与其它种属细菌16S-23S rRNA间隔区序列没有同源性区域。

序列表

一、自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanologenbacterium HarbinYUAN-3)的16S rRNA序列(GenBank注册号为AY675965)：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGCGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGTCCTTCGGGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGCAACCTGGCCTTCAGAGGGGGATAACGTCTGGAAACGGACGCTAATACCGCATGACATGGCGGAGTCGCATGGCTCTGCCATCAAAGGAGTAATCCGCTGAGGGATGGGCTCGCGTCCGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGCCCGCGATCGGTAGCCGGACTGAGAGGTTGGCCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGGATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAACCTCTGTCTTTGGGGACGAATCAATGACGGTACCCAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGTGTAAAGGGTGCGCAGGCGGGGCGGCAAGTTGGATGTGAAAACTCCGGGCTCAACCCGGAGCCTGCATTCAAAACTGTCGCTCTTGAGTGAAGTAGAGGCAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTGCTGGGCTTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTGCTAGGTGTGGGGGGTCTGACCCCTTCCGTGCCGGAGTTAACACAATAAGCAATCCACCTGGGGAGTACGGGTCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTGATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCACCGAATCCCCCAGAGATTGGGGAGTGCCCTTCGGGGAGCGGTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTGAATAGTTGCTACGAAAGAGCACTCTATTCAGACCGCCGTTGACAAAACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCATCAACAGAGGGAAGCAAGGCCGCGAGGTGGAGCGAACCCCTAAAAATGGTCTCAGCTCAGATTGCAGGCTGAAACCCGCCTGCATGAAGATGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGCCGGGGACACCCGAAGTCGGTTGGGTAACCGTAAGGAGCCCGCCGCCGAAGGTGGAATCGGTAATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTA

二、自絮凝产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanologenbacterium HarbinYUAN-3)的16S-23S rRNA间隔区序列(GenBank注册号为AY556390)

GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAGACTCGTTTCTTTAGAAACAGTGTCAGCGCAGGGATTTGTGGAAAGATGTTGTTTAATTTTGAGGGTCCGGGCGGACGCGGTTCGCTTTTAAGCCGCCGGCCATGCAGATCGGATTGGGAGCGAACAGCCCCGATGCAGGAAGCATGACGGCAGTTTGAAGACGGGCGGCGTCCCAAAGAACCTTCAAACGGTGGAAAAGAGAATAGGACGACCGATTCCCAGGCAAAGCGTGGGGTATAGCTTTCAGGCTGAGCAGTCCGAGAACAGGAGATTTTCCTGAACTTGCGCCGCGCAGCGGTGAACTTGCCGCTACGGTGAGTAGGGGGCGTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCACGCAGGGGGTCAGGAGTTCGATTCTCCTCATCTCCACCACGCCTGCGGCGGATATGACGCGCCAAGGCAGCCGAAAACGAAAATGCAAAGCCGCGAGGCCAAGCGTCGACGTTGAGGAAGCCAAAGCATGCATGCCGGTTGCAGGCAAACCAAATGGCCCGGGCGGGAACGGACGACCGAGATGCTCGGATTGCATGGGCTCATAGCTCAGGTGGTTAGAGCGTGCGCCTGATAAGCGCAAGGTCGGTGGTTCGAGTCCACTTGAGCCCACCAGCGGGCAGTGCCCGCACACAATTCGCGGGAAGTTTGTTCAAAGCAGAGGTCGGCCGCCGCGAAAGCGAGACGGATCGAAGCAAGAACAGATGGATCGCAAAACCGCTTGCAAAAGAGGTAAGATTTCAGGCTGAGCAGCCGCGTAAGCAACGACTTTCCTGAACTTGCCTCCGCCGCAGGCGGGGGGACCTTGAAAACTGAATAATGTTCTAATCTGCAATTTTTTTAATGAACGAAGCGAGTAGCGGCGGAAGTTTCAGGTTGAGCAGCTGTGTAAGCAGTGGGCTTGCTTGAACATACGTCTTGCGAAGCAAGTTCGTTGGGTAAATTCCGATTGACACATAAGGTCAAGCTACAAAGAGCGCAAGGGGAATGCCTTGGCACCAGGAGCCGATGAAGGACGCAGCGATCTGCGAAAAGCCACGGGGAGTCGAAAGCAGGCATTGATCCGTGGATATCCGAATGGGGCAACCCGGCGGAGCCATACTCCGTCAGCGTGCAGTGAATCCATAGCTGCACGTGGGGAACCGCCTGAACTGAAACATCTAAGTACC

Claims

1、自絮凝产氢细菌，命名为哈尔滨产乙醇杆菌(EthanologenbacteriumHarbin YUAN-3)，保藏编号为CGMCC No.1152。