CN102533571B

CN102533571B - 一种热带假丝酵母突变菌株及其应用

Info

Publication number: CN102533571B
Application number: CN 201110461646
Authority: CN
Inventors: 李荣杰
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2031-12-30
Also published as: CN102533571A

Abstract

本发明提供了一种假丝酵母突变菌株(Candida sp.)FYAT1104，其保藏编号为CGMCC No.4761。本发明提供的保藏的菌株，菌株性能稳定；利用该菌株发酵得到的L-阿拉伯糖醇转化率高，培养瓶发酵转化率可达到87.3％；发酵罐发酵转化率可即达到90.4％。

Description

一种热带假丝酵母突变菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别涉及一种假丝酵母突变菌株及其应用。

背景技术

L-阿拉伯糖醇是一种稀有的戊糖醇，分子式为C₅H₁₂O₅，分子量为152.15，味甜，白色结晶性粉末，易溶于水和90％沸乙醇，不能还原斐林氏试剂。糖醇是指糖(包括四碳糖、五碳糖、六碳糖或其聚合体)的还原性羰基经过加氢后生成的一类多元醇。由于加氢作用，其失去了还原性。多数糖醇在人体中的代谢第一步可以不经过胰岛素，所以可以用作糖尿病人、反应性低血糖及其其他胰岛素分泌失常的病人的营养甜味剂；由于大部分糖醇不容易被造成龋齿的口腔链球菌所利用，所以大量用于口腔保健，预防龋齿；大部分糖醇具有良好的口感与甜味，且热值很低，可以作为蔗糖替代品，以降低因蔗糖摄入过多而造成的肥胖症、心血管病等时下较为常见的各种“三高”病症的发生率。

越来越多的稀有糖醇已经被开发出来，更广泛的应用于食品医药等行业，发挥着越来越重要的作用。L-阿拉伯糖醇作为一种稀有的五碳糖醇，具有上述的优点且因为更难被微生物利用以及拥有类似于水溶性膳食纤维的效果，对脂肪的吸收有一定的抑制作用，因此其功效更佳，但由于L-阿拉伯糖醇目前较昂贵的价格限制了它的广泛使用。

目前，L-阿拉伯糖醇的生产主要以L-阿拉伯糖为原料，在高温高压的条件下催化加氢得到。众所周知，这种传统的化工生产方法，有着许多明显的缺点，该化学法需要高温、高压、易燃易爆的高压氢气以及对溶液纯度要求很高的镍催化剂、繁杂的分离和净化工艺，以及基本建设投资及操作费用高，并且污染严重。这就促使我们努力探索出了以L-阿拉伯糖为底物，利用特殊的菌种进行生物发酵，最后得到产物为L-阿拉伯糖醇。该生物转化法对环境较为友好，反应过程较为温和，是一种廉价的制备方法，将对今后L-阿拉伯糖醇的大规模工业化生产以及推动更广泛的市场应用起到重要的作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种假丝酵母突变菌株。

本发明的第二目的在于，提供该假丝酵母突变菌株的应用方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种假丝酵母突变菌株(Candida sp.)FYAT1104，保藏号为CGMCC No.4761，于2011年4月11日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101)。

进一步地，本发明提供了该假丝酵母突变菌株FYAT1104在制备L-阿拉伯糖醇中的应用。

更一步地，本发明提供了L-阿拉伯糖醇的发酵方法，所用发酵菌株为假丝酵母突变菌株FYAT1104，其保藏编号为CGMCCNo.4761。

上述方法具体包括试管斜面培养种子和培养瓶液体发酵。

所述试管斜面培养的培养基包括：酵母粉1～5g/L，蛋白胨1～5g/L，葡萄糖10～25g/L。

所述试管斜面培养的培养条件优选为：温度为28～32℃，pH值为3.5～5.5，培养是时间为14～20h。

所述培养瓶液体发酵的培养基配方包括：葡萄糖10～20g/L，L-阿拉伯糖50～100g/L，甘油10～20g/L，氮源5～40g/L。

其中，所述的氮源为玉米浆、酵母粉或蛋白胨中的一种或几种。

优选地，所述培养基的氮源为玉米浆，其含量为20～40g/L。

所述培养基的氮源为酵母粉，其含量为5～10g/L。

所述培养基的氮源为蛋白胨，其含量为10～20g/L。

所述培养瓶液体发酵的条件优选为：种子培养液与发酵培养液的体积比为10％，pH值为4.2～5.0，发酵温度为28～32℃，通气量为0.5～1vvm，发酵时间为2～4天。

所述方法还包括发酵罐发酵，发酵条件优选为：通气量0.5vvm，温度培养30℃，pH值为4.2～5.0。

本发明还提供了由上述方法制备的L-阿拉伯糖醇。

本发明的积极效果在于：本发明提供的保藏的菌株，菌株性能稳定；利用该菌株发酵得到的L-阿拉伯糖醇转化率高，培养瓶发酵转化率可达到87.3％；发酵罐发酵转化率可即达到90.4％。

附图说明

图1为本发明葡萄糖标准品HPLC色谱图；

图2为本发明L-阿拉伯糖醇标准品HPLC色谱图；

图3为本发明L-阿拉伯糖标准品HPLC色谱图；

图4为本发明甘油标准品HPLC色谱图；

图5为本发明起始发酵醪HPLC色谱图；

图6为本发明摇瓶发酵56h时发酵醪HPLC色谱图；

图7为本发明5L发酵罐48h时发酵醪HPLC色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1菌种分离及鉴定

YPA液体培养基包括以下质量体积百分比的组分：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％L-阿拉伯糖；pH值为5.5；121℃灭菌20min。

YPA固体培养基包括以下质量体积百分比的组分：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％L-阿拉伯糖，1.5％琼脂粉；pH值为5.5；121℃灭菌20min。

从安徽丰原发酵技术工程研究有限公司的木糖母液中取1ml样品，于100ml YPA液体培养基中，30℃、220rpm摇瓶培养12h。取1ml培养物于1.5ml eppendorf管中，8000rpm常温离心5min，用无菌双蒸水洗涤数次后，再用无菌ddH₂O稀释到10^-2～10^-7倍，取每个稀释梯度0.15ml涂布于YPA固体培养基上，于30℃恒温培养2天后获得单菌落。选择菌落数在20个左右的平板，挑选较大的菌落若干株，保存于YPA固体培养基斜面上，并分别编号。通过镜检，确定大部分菌种为酵母。

菌种鉴定用18S rDNA基因序列分析技术进行分类鉴定。取10株酵母，提取DNA用18S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物直接测序，测序结果提交GenBank通过核酸序列比对，对微生物种属进行鉴定，鉴定结果表明，其中一株为假丝酵母属菌株。

实施例2菌株驯化、诱变、筛选

本实施例中所述菌株均在YPA液体培养基中进行培养，于摇床培养条件为：30℃，220rpm，2天。

1、菌株驯化

将摇瓶种子转接至高浓度L-阿拉伯糖的YPA培养基(L-阿拉伯糖浓度为15％)中，于摇床培养：30℃，220rpm，2天；而后，稀释至10^-4，涂布于高浓度L-阿拉伯糖的YPA固体培养基(L-阿拉伯糖浓度为200g/L)上，30℃生化培养箱静置培养2天；挑取生长较大的菌落，摇瓶种子，继续培养。重复此步骤，驯化10次后，挑选较大菌落，保存备用。

2、紫外诱变

取本实施例的步骤(1)中的驯化菌株一环，接种于100ml YPA液体培养基中，30℃、220rpm条件下摇瓶培养12h。取5ml培养液，用生理盐水洗涤3次(室温下8000rpm、离心4min)后，用2ml生理盐水制成悬浮液。将悬浮液置于带有磁力搅拌器的平皿上，使细胞可以均匀地吸收紫外光线。紫外诱变条件：20W紫外灯，距离25cm，照射时间4min(此时的致死率为69.3％)。

3、制霉菌素筛选

(1)离心去上清(8000rpm、4min)后，加入YPA液体培养基培养12h，暗箱培养富集菌体。

(2)离心去上清(8000rpm、4min)后，用生理盐水(0.9％的NaCl)洗3次。加10ml不含任何碳源的YNB液体培养基，移入三角瓶中振荡培养过夜。

(3)在三角瓶中加入50％(W/V)的L-阿拉伯糖醇至总浓度为1％，培养12小时后，加入制霉菌素至终浓度为40U/mL，振荡培养4h。

(4)离心(8000rpm、4min)除上清，用生理盐水洗3次。用无菌水稀释至适当浓度后，涂布于选择性平板YATG(各成分质量体积比为：0.7％YNB、1％L-阿拉伯糖醇、0.01％葡萄糖、1.5％琼脂糖)上。

(5)将上述平板于30℃培养数日后观察，长出后不久停止生长且较小的菌落即是目的菌落。

(6)挑出(5)中目的菌落，按上述步骤重复筛选4次。

最终得到一株热带假丝酵母突变株FYAT1104，它能代谢L-阿拉伯糖，形成L-阿拉伯糖醇。此菌株保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.4761。另保藏菌株FYAT1104于甘油管和斜面试管中备用。

实施例3HPLC检测发酵液组份

1、发酵液样品处理：取10ml发酵液于离心管中，10000rpm室温离心5分钟去细胞及沉淀，取上清稀释至合适浓度，超声波除泡，过滤膜过滤除杂质后，做高效液相色谱测定各组份含量。

2、发酵液组份测定：采用高效液相色谱测量发酵液中各组份含量。色谱条件按以下条件，色谱仪：Agilent 1200 HPLC高效液相色谱；色谱柱：87H3型离子交换色谱柱；色谱柱温：60℃；流动相：4mmol/L H₂SO₄；流速：0.3mL/min；检测器：示差折光检测器；进样量：25μL/次。

3、外标测各组份含量：葡萄糖标准品高效液相色谱图见图1；L-阿拉伯糖醇标准品高效液相色谱图见图2；L-阿拉伯糖标准品高效液相色谱图见图3；甘油标准品高效液相色谱图见图4。

实施例4产L-阿拉伯糖醇摇瓶发酵实验1

1、种子培养

种子培养基配方：酵母粉1g/L，蛋白胨2g/L，葡萄糖10g/L，pH4.0。

种子培养：接种斜面试管菌株FYAT1104，保藏编号为CGMCCNo.4761，于种子培养基中，温度为30℃培养时间为20h，使OD_600nm在6。

2、发酵培养基

发酵培养基配方为：葡萄糖10g/L，L-阿拉伯糖50g/L，甘油10g/L，添加一定的氮源，pH4.2。相对应发酵培养基中添加的氮源及其组份分别为以下3种：玉米浆20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L。

3、发酵条件及结果

发酵采用摇瓶发酵方式。种子培养液与发酵培养液的体积比为10％，装液量50ml/250ml，通气量为0.5vvm，220rpm、30℃摇瓶发酵3天。

对应本实施例中发酵培养基配方中不同氮源的配方，发酵结果见表1(以L-阿拉伯糖转化率计，即单位L-阿拉伯糖转化为L-阿拉伯糖醇的百分比)，以3次结果的平均值计量。

表1不同氮源L-阿拉伯糖转化率

氮源种类	玉米浆20g/L	酵母粉5g/L	蛋白胨10g/L
				转化率/％	82.34	84.57	84.62

实施例5产L-阿拉伯糖醇摇瓶发酵实验2

1、种子培养

种子培养基配方：酵母粉5g/L，蛋白胨3g/L，葡萄糖25g/L，pH3.5。

种子培养：接种斜面试管菌株FYAT1104，保藏编号为CGMCCNo.4761，于种子培养基中，温度为32℃，培养时间为18h，使OD_600nm在7。

2、发酵培养基

发酵培养基配方为：葡萄糖10g/L，L-阿拉伯糖50g/L，甘油10g/L，添加一定的氮源，pH5.0。相对应发酵培养基中添加的氮源及其组份分别为以下3种：玉米浆40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。

3、发酵条件及结果

发酵采用摇瓶发酵方式。种子培养液与发酵培养液的体积比为10％，装液量50ml/250ml，通气量为0.8vvm，220rpm、28℃摇瓶发酵2天。

对应本实施例中发酵培养基配方中不同氮源的配方，发酵结果见表2(以L-阿拉伯糖转化率计，即单位L-阿拉伯糖转化为L-阿拉伯糖醇的百分比)，以3次结果的平均值计量。

表2不同氮源L-阿拉伯糖转化率

氮源种类	玉米浆40g/L	酵母粉10g/L	蛋白胨20g/L
				转化率/％	83.51	84	86.23

实施例6产L-阿拉伯糖醇摇瓶发酵实验3

1、种子培养

种子培养基配方：酵母粉3g/L，蛋白胨2g/L，葡萄糖20g/L，pH5.0。

种子培养：接种斜面试管菌株FYAT1104，保藏编号为CGMCCNo.4761，于种子培养基中，温度为28℃，培养时间为14h，使OD_600nm在5。

2、发酵培养基

发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L，L-阿拉伯糖100g/L，甘油20g/L，另添加一定的氮源，pH4.5。相对应发酵培养基中添加的氮源及其组份分别为以下3种：玉米浆20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L。

3、发酵条件及结果

发酵采用摇瓶发酵方式。种子培养液与发酵培养液的体积比为10％，装液量50ml/250ml，通气量为0.9vvm，220rpm、32℃摇瓶发酵4天。

按本实施例中2的培养基配方，添加不同氮源对应的发酵结果见表3(以L-阿拉伯糖转化率计，即单位L-阿拉伯糖转化为L-阿拉伯糖醇的百分比)，以3次结果的平均值计量。

表3不同氮源L-阿拉伯糖转化率

氮源种类	玉米浆20g/L	酵母粉5g/L	蛋白胨10g/L
				转化率/％	81.03	84.87	85.13

实施例7产L-阿拉伯糖醇摇瓶发酵实验4

1、种子培养

种子培养基配方：酵母粉1g/L，蛋白胨2g/L，葡萄糖10g/L，pH4.2。

种子培养：接种斜面试管菌株FYAT1104，保藏编号为CGMCCNo.4761，于种子培养基中，温度为30℃，培养时间为20h，使OD_600nm在6。

2、发酵培养基

发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L，L-阿拉伯糖100g/L，甘油20g/L，另添加一定的氮源，pH5.0。相对应发酵培养基中添加的氮源及其组份分别为以下3种：玉米浆40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。

3、发酵条件及结果

发酵采用摇瓶发酵方式。种子培养液与发酵培养液的体积比为10％，装液量50ml/250ml，通气量为1vvm，220rpm、30℃摇瓶发酵3天。

对应本实施例中发酵培养基配方中不同氮源的配方，发酵结果见表4(以L-阿拉伯糖转化率计，即单位L-阿拉伯糖转化为L-阿拉伯糖醇的百分比)，以3次结果的平均值计量。

表4不同氮源L-阿拉伯糖转化率

氮源种类	玉米浆40g/L	酵母粉10g/L	蛋白胨20g/L
				转化率/％	82.47	80.85	87.31

实施例8L-阿拉伯糖醇发酵试验

1、最优培养基摇瓶发酵产L-阿拉伯糖醇

种子培养基配方及种子培养同实施例四。

按实施例7中结果，用以下优化发酵培养基配方为例实验。

优化发酵培养基配方：葡萄糖20g/L，L-阿拉伯糖100g/L，甘油20g/L，另添加一定的氮源蛋白胨20g/L，pH5.0。原始发酵培养基中各组份HPLC色谱图见图5。

发酵条件：种子培养液与发酵培养液的体积比为10％，装液量50ml/250ml，220rpm、30℃摇瓶发酵3天。

结果显示：56h时，发酵醪中的L-阿拉伯糖全部耗完，L-阿拉伯糖醇大量积累，L-阿拉伯糖-＞L-阿拉伯糖醇转化率为87.3％。56h时发酵醪HPLC色谱图见图6。

2、最优培养基5L发酵罐发酵产L-阿拉伯糖醇

种子培养基配方及种子培养同实施例4。

培养基配方为本实施例中1的优化发酵培养基配方。

在5L发酵罐中，以10％(V/V)的接种量接种优化发酵培养基(按本实施例中优化发酵培养基配方)进行培养，培养过程中，初始搅拌转速300rpm，通气量0.5vvm，温度培养30℃，种前及种后pH均约为4.2。培养过程中利用30％的磷酸和25％的氨水恒化自控pH5.0，温度自控在30℃，通过调节转速和通气，调整并控制溶氧在60％以上。每隔4h取样，测量OD_600nm、葡萄糖含量、L-阿拉伯糖含量、L-阿拉伯糖醇含量以及甘油含量。结果显示：48h时，L-阿拉伯糖醇浓度达到最大值，为90.4g/L；L-阿拉伯糖-＞L-阿拉伯糖醇转化率达到90.4％，发酵周期比摇瓶缩短了8个小时，且发酵醪中无甘油残留。48h时发酵醪的HPLC色谱图见图7。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种假丝酵母突变菌株（Candida sp.）FYAT1104，其保藏编号为CGMCC No.4761。

2.权利要求1所述的假丝酵母突变菌株FYAT1104在制备L-阿拉伯糖醇中的应用。

3.一种L-阿拉伯糖醇的发酵方法，其特征在于，所用发酵菌株为假丝酵母突变菌株FYAT1104，其保藏编号为CGMCC No.4761，该方法包括试管斜面培养种子和培养瓶液体发酵；

所述试管斜面培养的培养基包括：酵母粉1～5g/L，蛋白胨1～5g/L，葡萄糖10～25g/L；

试管斜面培养的培养条件为：温度为28～32℃，pH值为3.5～5.5，培养时间为14～20h；所述培养瓶液体发酵的条件为：种子培养液与发酵培养液的体积比为10%，pH值为4.2～5.0，发酵温度为28～32℃，通气量为0.5～1vvm，发酵时间为2～4天；所述培养瓶液体发酵的培养基包括：葡萄糖10～20g/L，L-阿拉伯糖50～100g/L，甘油10～20g/L，氮源5～40g/L。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的氮源为玉米浆、酵母粉或蛋白胨中的一种或几种。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氮源为蛋白胨，其含量为10～20g/L。