CN106399179B - 莫海维芽胞杆菌的应用及其降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及莫海维芽孢杆菌的应用及其降解邻苯二甲酸2‑乙基己酯的方法，属于环境微生物应用领域。本发明的莫海维芽孢杆菌B1811，保藏编号为CGMCCNo.12805；保藏时间为2016年7月21日；属于杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；其应用为降解邻苯二甲酸2‑乙基己酯（NAP）；对邻苯二甲酸2‑乙基己酯的降解率可高达99.6%。采用本发明的莫海维芽孢杆菌B1811降解邻苯二甲酸2‑乙基己酯的方法为：在酵母提取物存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与邻苯二甲酸2‑乙基己酯接触。本发明降解邻苯二甲酸2‑乙基己酯的方法，与本发明之前细菌、真菌降解邻苯二甲酸2‑乙基己酯的方法相比，在菌种来源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及莫海维芽胞杆菌的应用及其降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的方法，属于环境微生物应用领域。
背景技术
邻苯二甲酸2-乙基己酯（Bison（2-ethylhexyl）ortho-phthalate），简称DEHP，是一类重要的环境激素类有机合成化合物，在工业生产中主要用作聚氯乙烯( PVC) 塑料增塑剂，提高塑料的可塑性和易弯曲性。
塑料中，DEHP与塑料分子以氢键或范德华力连接，很容易通过淋洗、迁移或蒸发等方式进入食物、空气、饮用水及其它物质中；DEHP也可以在塑料生产或燃烧过程中通过烟尘沉降释放到环境中。许多动物实验研究结果显示DEHP具有生殖发育毒性、免疫 毒性、胚胎毒性、肝脏毒性及致癌性等多种毒性，并具有引起甲状腺素代谢改变的类雌激素活性。美国环保局（EPA）、欧盟以及中国国家环境监测中心均已将其列入优先控制污染物黑名单。
环境中DEHP的分解、转化方法及技术探索已成为环境污染治理的重要研究方向。但是DEHP在自然环境中的水解、光解速度非常缓慢，属于难降解物质。有研究表明，DEHP的水解半衰期达2000年，光解半衰期也需要105年。与水解及光解等物理降解相比，基于微生物代谢的生物降解过程具有功能微生物多样性、过程简单、成本低、环境友好等特点，使得微生物降解被认为是自然环境中DEHP完全矿化的最有效途径。因此，筛选高效分解DEHP的微生物并阐明其分解代谢途径，对于深化有关消除DEHP环境危害的研究及应用具有现实意义。
近年来，DEHP的微生物降解已经得到广泛的研究，大量能高效降解DEHP的菌株已经从各类环境中分离得到，包括红树林、土壤、海洋、河流与废水处理厂的活性污泥等，微生物类别包括大量细菌以及部分真菌。研究表明，不同来源以及不同类型的微生物在DEHP降解途径方面具有较大差异性，所呈现的降解机制也不尽相同。所述降解机制包括发挥降解作用的关键酶及酶系、降解途径中的关键节点及关键影响因素、微生物自身代谢与降解效果之间的关系、微生物降解广谱性与特异性及其与DEHP结构的关系等。
莫海维芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）主要应用在脂肪酶的发酵，目前未见有关利用莫海维芽胞杆菌降解DEHP的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的新菌株；及该菌株的应用和采用该菌株降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的方法。
技术方案
本发明从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株；属于杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；经鉴定，该菌株是一种莫海维芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）；命名为莫海维芽胞杆菌 B1811；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号为CGMCC No.12805；保藏时间为2016年7月21日。
本发明的莫海维芽胞杆菌B1811能够降解邻苯二甲酸2-乙基己酯；莫海维芽胞杆菌 B1811对邻苯二甲酸2-乙基己酯的降解率可高达99.1%。
采用本发明的莫海维芽胞杆菌B1811降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的其中一种方法为：在酵母提取物存在的条件下，莫海维芽胞杆菌B1811与DEHP接触。其中，酵母提取物的量会影响降解率。所以，上述方法，优选的，在改良BSM 基础盐液体培养基存在的条件下，莫海维芽胞杆菌B1811与DEHP接触；所述改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。
具体的，是将DEHP加入改良BSM基础盐液体培养基；将莫海维芽胞杆菌B1811种子液接种于改良BSM 基础盐液体培养基，在150-200 rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。
上述方法，优选的，改良BSM 基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为6或7 g/L。
上述方法，优选的，培养条件为转速175rpm，温度30℃；其他条件相同情况下，此培养条件下邻苯二甲酸2-乙基己酯的降解率最高。
上述方法，莫海维芽胞杆菌 B1811种子液相对于改良BSM 基础盐液体培养基的接种量的变化，对单位时间内的DEHP降解率有明显影响；通常情况下，接种量越多，单位时间内降解率越高；但是对最终降解率（发酵液中DEHP含量达到稳定时的降解率）没有明显影响。
上述方法，所述莫海维芽胞杆菌B1811种子液是由莫海维芽胞杆菌B1811培养获得的。在获得莫海维芽胞杆菌B1811的条件下，本领域技术人员通过常规操作即可以获得莫海维芽胞杆菌 B1811种子液。
本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。
本发明所用专业术语说明：rpm是转速单位，1 rpm是指每分钟旋转一转。
有益效果：
（1）首次分离培养出能够降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的莫海维芽胞杆菌B1811；
（2）莫海维芽胞杆菌B1811对邻苯二甲酸2-乙基己酯的降解率超过99.1%；
（3）本发明降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的方法，与本发明之前细菌、真菌降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的方法相比，在菌种来源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作简单。
保藏信息：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中国科学院微生物研究所
保藏日期：2016年7月21日
保藏编号：CGMCCNo.12805
分类命名：莫海维芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）。
附图说明
图1为本发明中所述莫海维芽胞杆菌B1811的显微镜下形态特征；图1中，莫海维芽胞杆菌B1811为杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；
图2为莫海威芽孢杆菌B1811与相关种的16S rDNA序列系统发育分析；
图3为莫海威芽孢杆菌B1811与相关种的gyrB序列系统发育分析。
具体实施方式
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1菌株B1811的鉴定
菌株B1811分离自土壤，其形态如图1所示，属于杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢。提取其基因组DNA，并利用16s rDNA和BCR1引物对于该基因组DNA进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株比对。
(1)16S rDNA 序列分析：
16s rDNA正向引物27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,如SEQ ID NO.1所示；
16s rDNA反向引物1541R：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3′，如SEQ ID NO.2所示；
扩增所得16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示，序列全长为1461bp。将该扩增所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图2。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1811”与模式菌株Bacillus mojavensis RO-H-1T/JH600280同源性达99.8％。
(2)gyrB基因序列分析
gyrB-34F基因正向引物：5'-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3'，如SEQ ID NO.4所示；
gyrB-977R基因反向引物：5'-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3'，如SEQ ID NO.5所示；
扩增所得gyrB基因序列如SEQ ID NO：6所示，序列全长为887bp。将该扩增所得gyrB基因序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图3。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1811”与模式菌株B.malacitensis CECT 5687(DQ903179)同源性达99.5％。
因此可以判定B1811为一种全新的莫海威芽孢杆菌。经过鉴定确认其所属菌种后，莫海威芽孢杆菌B1811于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12805；此生物材料已经存活试验测试并通过该试验。
实施例2 莫海维芽胞杆菌B1811液体摇瓶培养液制备
（1）斜面培养：莫海维芽胞杆菌B1811接种于斜面培养基上，在40℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、琼脂 1.8g、蒸馏水余量，pH为中性，115℃灭菌20 min。
（2）取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175 rpm、30℃的条件下恒温震荡培养24h，得到种子培养液。所述种子培养基，每1L中含有的成分为：硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、琼脂粉15g、酵母提取物5g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌25min。
（3）将10μL的DEHP（工业纯）以无菌操作加入含有50mL的改良BSM 基础盐液体培养基的摇瓶中，将莫海维芽胞杆菌B1811的种子培养液以1mL 的接种量接种到摇瓶中，在175r/min、30℃的条件下恒温震荡培养72h；得发酵液。所述改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有的成分为：酵母提取物5.0g、硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌15min。
实施例3 DEHP 标准曲线制定与含量测定
（1）高效液相色谱法（HPLC）制作标准曲线：取600μL DEHP以甲醇为溶剂，制备成1mg/mL的DEHP溶液，稀释十倍后分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL 定容至2mL 离心管中，即浓度梯度（μg/mL）为10、20、30、40、50、60、70 分别用0.45μm 有机滤膜过滤后置于液相小瓶中待测。本实施例3中的高效液相检测条件为：色谱柱为Sepax Gp-C18 柱（150mm*4.6mm，5.0μm）；流动相为乙腈-水（83：17，V/V）；进样量10μL；流速1.0mL/min；柱温25C°；紫外检测器波长210nm。以DEHP的峰面积为横坐标，以DEHP的浓度为纵坐标，制作标准曲线；进而获得峰面积-浓度方程。
实施例4 高效液相法检测DEHP的降解率
（1）向实施例2获得的发酵液中加入与发酵液等量的乙腈对DEHP 进行提取，超声（40KHZ，300W）辅助提取30min后取其中2mL用乙腈定容至10mL，混合均匀后离心（12000rpm,10min），将离心后的上清液用有机滤膜（0.45μm）进行过滤，弃去初滤液，取续滤液置于液相小瓶中，以实施例3步骤（1）的检测条件，采用高效液相色谱仪（HPLC）进行分析。运行时间为20 分钟，读取保留时间在8.5 min左右的峰面积值。根据实施例3的峰面积-浓度方程，得续滤液中DEHP的浓度，进而计算出发酵液中DEHP的残留浓度。
（2）降解率的计算公式：降解率%= (C0-C)/C0*100%，C0 为用莫海维芽胞杆菌B1811降解之前DEHP的总质量浓度（μg/mL）（即实施例2步骤（3）发酵之前摇瓶中混合液的DEHP 质量浓度：0.1713μg/mL），C 为发酵液中的DEHP 的残留浓度（μg/mL）。经计算，实施例2的降解率为98.9%
实施例5 莫海维芽胞杆菌B1811降解DEHP的优化
将实施例2步骤（3）中的种子液接种量依次改为2、3、4、5、6mL，其他操作同实施例2。按照实施例4的步骤测定发酵液的DEHP浓度，进而计算DEHP的降解率。在不同接种量条件下，DEHP降解率如表1所示。
实施例6
将实施例2步骤（3）中所用改良BSM 基础盐液体培养基的酵母提取物的含量依次修改为1、2、3、4、5、6、7、8、10g/L；其他操作同实施例2。按照实施例4的步骤测定发酵液的DEHP浓度，进而计算DEHP的降解率。在不同酵母提取物的含量条件下，DEHP降解率如表2所示。
表1
| 种子液接种量（mL） | DEHP降解率（%） |
| 0 | 0 |
| 1 | 98.9 |
| 2 | 98.1 |
| 3 | 98.9 |
| 4 | 99.1 |
| 5 | 99.0 |
| 6 | 99.1 |
表2
| 酵母提取物添加量（g/L） | DEHP降解率（%） |
| 0 | 0 |
| 1 | 96.5 |
| 2 | 97.8 |
| 3 | 97.2 |
| 4 | 98.7 |
| 5 | 98.9 |
| 6 | 99.1 |
| 7 | 99.1 |
| 8 | 99.0 |
<110>北京工商大学
<120>莫海维芽胞杆菌的应用及其降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的方法
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
AAGGAGGTGA TCCAGCC 17
<210>3
<211>1461
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
ATACATGCAG TCGAGCGGAC AGATGGGAGC TTGCTCCCTG ATGTTAGCGG CGGACGGGTG 60
AGTAACACGT GGGTAACCTG CCTGTAAGAC TGGGATAACT CCGGGAAACC GGGGCTAATA 120
CCGGATGCTT GTTTGAACCG CATGGTTCAA ACATAAAAGG TGGCTTCGGC TACCACTTAC 180
AGATGGACCC GCGGCGCATT AGCTAGTTGG TGAGGTAATG GCTCACCAAG GCAACGATGC 240
GTAGCCGACC TGAGAGGGTG ATCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC 300
GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC AACGCCGCGT 360
GAGTGATGAA GGTTTTCGGA TCGTAAAGCT CTGTTGTTAG GGAAGAACAA GTACCGTTCG 420
AATAGGGCGG TACCTTGACG GTACCTAACC AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG 480
CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GGGCTCGCAG 540
GCGGTTCCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCC CGGCTCAACC GGGGAGGGTC ATTGGAAACT 600
GGGGAACTTG AGTGCAGAAG AGGAGAGTGG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA 660
GATGTGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGA CTCTCTGGTC TGTAACTGAC GCTGAGGAGC 720
GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAGT 780
GCTAAGTGTT AGGGGGTTTC CGCCCCTTAG TGCTGCAGCT AACGCATTAA GCACTCCGCC 840
TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT 900
GGAGCATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCTCTG 960
ACAATCCTAG AGATAGGACG TCCCCTTCGG GGGCAGAGTG ACAGGTGGTG CATGGTTGTC 1020
GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGATCTTA 1080
GTTGCCAGCA TTCAGTTGGG CACTCTAAGG TGACTGCCGG TGACAAACCG GAGGAAGGTG 1140
GGGATGACGT CAAATCATCA TGCCCCTTAT GACCTGGGCT ACACACGTGC TACAATGGAC 1200
AGAACAAAGG GCAGCGAAAC CGCGAGGTTA AGCCAATCCC ACAAATCTGT TCTCAGTTCG 1260
GATCGCAGTC TGCAACTCGA CTGCGTGAAG CTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGCAT 1320
GCCGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAC GAGAGTTTGT 1380
AACACCCGAA GTCGGTGAGG TAACCTTTAT GGAGCCAGCC GCCGAAGGTG GGACAGATGA 1440
TTGGGGTGAA GTCGTAACAA G 1461
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
ggTgTWRgKg CNgTCgTAAA Cg 22
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
CCSgCAgART CACCCTCTAC g 21
<210>6
<211>887
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
AACGCGTTAT CAACAGAGCT TGATGTGACT GTTCACCGTG ACGGAAAAAT CCATCGCCAA 60
GTCTATAACC GCGGTGTCCC GGTTTCTGAT CTTGAGGTTA TTGGCGAAAC GGATCATACA 120
GGAACGACTA CACACTTTGT TCCAGATCCT GAAATCTTCA CGGAAACAAC TGAGTATGAA 180
TATGATTTGC TTGCTAACCG TGTTCGCGAA CTAGCCTTTT TGACAAAAGG CGTAAACATC 240
ACGATTGAAG ATAAACGTGA AGGCCAAGAG CGCAAAAATG AGTATCATTA CGAAGGCGGA 300
ATTAAAAGCT ATGTAGAGTA TTTAAACCGC TCCAAAGAAG TTGTCCATGA AGAGCCGATT 360
TATATTGAAG GCGAAAAGGA CGGCATTACG GTTGAAGTCG CTCTGCAATA CAATGACAGC 420
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AGAATGGCTG CGAAAAAAGC GCGTGAATTA ACGCGCCGCA AAAGTGCTTT GGAGATTTCA 840
AACCTTCCTG GTAAATTAGC GGACTGCTCT TCGAAAGACC CGAGCAT 887
Claims (7)
1.一种莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)B1811的用途，用于降解邻苯二甲酸2-乙基己酯；所述莫海威芽孢杆菌B1811保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12805，保藏时间为2016年7月21日。
2.一种采用权利要求1所述莫海威芽孢杆菌B1811降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的方法，其特征在于，在酵母提取物存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与邻苯二甲酸2-乙基己酯接触。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在改良BSM基础盐液体培养基存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与邻苯二甲酸2-乙基己酯接触；所述改良BSM基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物3-8g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是将邻苯二甲酸2-乙基己酯加入改良BSM基础盐液体培养基；将莫海威芽孢杆菌B1811种子液接种于改良BSM基础盐液体培养基，在150-200rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，培养条件为转速175rpm，温度30℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，改良BSM基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为6g/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述莫海威芽孢杆菌B1811种子液是由莫海威芽孢杆菌B1811培养获得的。
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- 2016-10-09 CN CN201610880273.9A patent/CN106399179B/zh active Active
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| CN103571771A (zh) * | 2013-09-12 | 2014-02-12 | 四川农业大学 | 一株邻苯二甲酸酯高效降解芽孢杆菌的筛选鉴定及其应用 |
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| Biodegradation of an endocrine-disrupting chemical，Biodegradation of an endocrine-disrupting chemical;C. S. Quan etal.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20051231;第66卷;第702-710页 * |
| Biodegradation of dibutyl phthalate and di-(2-ethylhexyl) phthalate and microbial community changes in mangrove sediment;Shaw-Ying Yuan etal.;《Journal of Hazardous Materials》;20101231;第184卷;第826-831页 * |
| 增塑剂邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的危害、分布及生物降解;孟雪征等;《生态环境学报》;20141231;第23卷(第8期);第1384-1389页 * |
| 邻苯二甲酸二丁酯降解菌株的筛选鉴定及其降解特性研究;李建龙等;《现代食品科技》;20141231;第30卷(第10期);摘要，第109页左栏第1.2节 * |
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