CN103361284B - 一株能产生除草活性物质的铜绿假单胞菌菌株及其粗毒素制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)菌株(编号CB-4),及其粗毒素的制备方法,属于微生物应用于农业植物保护领域。此菌株粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果,尤其是对马唐的种子萌发根茎长的IC50分别达到299.25mg·L-1和210.11mg·L-1,具有安全环保,对农作物无害等特点。
Description
技术领域
本发明为一株铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4)及其次生代谢产物用于控制杂草的方法,属于微生物应用于农业植物保护领域。
背景技术
全世界约有3万余种杂草,其中1800多种能够对各种农业作物造成危害,每年会造成作物总产量约9.7%的损失。化学除草剂是目前常用的防治杂草的方法,但长期使用,其弊端也日益突出,如杂草产生抗药性、水体土壤污染、残留不易降解等。开发研制无污染、安全的新型除草剂已成为当务之急。生物除草剂具有对目标杂草以外的植物影响小、环境负效应小、安全性高的特点而备受人们的青睐,尤其是微生物除草剂以其开发周期短、成本低而越来越显示出独特的优势。微生物除草剂分为微生物活体除草剂和微生物次生代谢产物除草剂。次生代谢产物除草剂具有结构新颖、相对于活体制剂更易保存、多靶标作用位点、环境中易于降解等优点。
近年来从自然界筛选出具有除草活性的细菌,成为生物除草剂开发研究的热点。已发现的具有除草效果的细菌主要包括如下几个属:假单胞菌属(Pseudomonas),欧文氏菌属(Erwinia),黄杆菌属(Flavobacterium),柠檬酸杆菌属(Citrobacter),无色杆菌属(Achromobacter),肠杆菌属(Enterobacter),产碱杆菌属(Alcalligenes)等。其中假单胞菌属有Zidack等发现丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonassyringaepv.phaseolicola)能使Kudzu叶片黄枯,局部坏死;Kenedy等报道荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)D7菌株可抑制旱雀麦(BromustectromL.)的生长;美国Banowetz等发现五株荧光假单胞菌(P.fluorescens)能够产生一种抑制早熟禾种子萌发物质。通过检索,尚未发现以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)提取物用做除草剂的相关文献报道。
本发明为一种铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株(编号CB-4),及其粗毒素的制备方法。此菌株粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果,尤其是对马唐的种子萌发根茎长的IC50分别达到299.25mg·L-1和210.11mg·L-1。而且具有安全环保,对农作物无害等特点。
权利要求
1、一种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonasaeruginosa),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期2012年1月10日,保藏编号:CGMCCNo.5721,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2、权利要求1所述铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4),其特征在于:此菌株粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果。
3、权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株(编号CB-4)粗毒素的制备方法。
发明内容
一、一株铜绿假单胞菌菌株
编号CB-4,(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期2012年1月10日,保藏编号:CGMCCNo.5721,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。此菌株由河北衡水市郊外农田中顶腐玉米病灶处分离得到,经生理生化实验和16SrDNA序列比对鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。此菌株形态为直形、两头钝圆的杆菌,大小0.5~0.8μm×1.5~3.0μm,一端生鞭毛,革兰氏染色为阴性,吲哚阴性,硝酸盐还原阳性,适宜生长温度35-37℃,可产生水溶性色素,将LB固体培养基染成蓝绿色。首次发现此菌株产生的粗毒素对马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草等杂草均有很强的抑制效果,相同浓度粗毒素施用于玉米、小麦、大豆、高粱植株均未见明显药害。CB-4菌株粗毒素具体除草效果见具体实施方式。
二、铜绿假单胞菌CB-4菌株粗毒素的制备方法
1、种子液制备,培养基配方:葡萄糖-10g,蛋白胨-10g,NaCl-5g,KCl-0.1g,MgSO4-0.1g,蒸馏水1000mL,调pH至6.5-7.2。
将按上述配方配制好的培养基倒入250mL三角瓶,每瓶100mL,121℃高压灭菌30min,冷却后在超净台内,无菌操作条件下,接种保存在-80℃甘油中的铜绿假单胞菌CB-4菌株,接种量1%,接种后放37℃,转速180rpm的摇床中培养24h,即为种子液。
2、发酵罐发酵,发酵罐培养液配方:葡萄糖-1%,蛋白胨-1%,NaCl-0.5%,KCl-0.01%,MgSO4-0.01%,pH6.5-7.2。
70L发酵罐按70%装上述培养基,装料后在120℃,0.12MPa下灭菌30分钟。冷却至30℃左右后按1%的比例接种制备好的种子液;培养温度37℃,通气量1∶1(v/v·min),发酵至72小时完毕。
3、将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取48h,期间不断震荡使其充分萃取,之后分液得到乙酸乙酯相,减压浓缩至干,得到的黄绿色油膏状物质即为粗毒素。
具体实施方式
实例1:
将铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素加蒸馏水分别稀释成1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100mg·L-1,各加1%的吐温80作为助剂,以茎叶处理法进行除草生物活性测定。具体方法是:口径φ7cm、高10cm塑料杯中(杯底有小孔)装入8cm深的蛭石,每杯中均匀撒入已催芽的马唐种子,覆盖1cm后的蛭石,播种后的塑料杯转移至磁盘中,保持0.5cm的水层,25℃,光照3800Lx,湿度70%条件下培养,至马唐生长至2叶片约2~3cm时供实验用。喉头喷雾器均匀喷洒各药剂,每盆马唐喷洒0.4mL,处理48h后观察结果,按下列公式计算死亡率。死亡率如表1。
表1不同浓度铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素处理马唐死亡率
其IC50为335.25mg·L-1,毒力回归方程为y=3.7185x-4.4369,相关系数R2=0.979。
实例2:
将铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素加甲醇溶解,分别稀释成62.5、125、250、375、500、750、1000mg·L-1,以抑制种子萌发法测定除草生物活性。具体方法是:在φ5cm的培养皿内放入皿底大小的滤纸片,每皿加不同浓度的CB-4菌株粗毒素甲醇溶液各2mL,放通风处完全干透后各加蒸馏水2mL,每皿播种10粒经催芽的马唐种子,以甲醇作为对照。48h后测量根芽长度,按下列公式计算抑制率。抑制率如表2
表2不同浓度铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素对马唐种子萌发抑制效果
粗毒素抑制马唐根长的IC50为299.25mg·L-1,毒力回归方程为y=2.5795x-1.3336,相关系数R2=0.9501。抑制马唐茎长的IC50为210.11mg·L-1,毒力回归方程为y=2.3192x-0.4867,相关系数R2=0.945。
实例3:
近年来蛋白核小球藻常作为除草剂筛选的模式生物。250mL三角瓶SE培养基装100mLSE培养基灭菌,接种1mL蛋白核小球藻种液(购自中科院淡水藻种库),分别加入不同浓度的粗毒素甲醇溶液各0.2mL,使藻液中的粗毒素浓度分别为500、50、10、5mg·L-1,设甲醇对照,光照3700Lx,温度25℃培养7天,每天用紫外分光光度计在最大吸收波长680nm处测定藻液吸光度。结果如表3。
表3不同浓度铜绿假单胞菌菌株(CB-4)粗毒素处理蛋白核小球藻
见随着时间的增长,CB-4菌株粗毒素对蛋白核小球藻的抑制作用越来越明显,较高浓度的粗毒素可以非常有效的抑制蛋白核小球藻的生长。
Claims (3)
1.一种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonasaeruginosa),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期2012年1月10日,保藏编号:CGMCCNo.5721,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种保藏编号为CGMCCNo.5721的菌株在防治马唐、反枝苋、稗草、狗尾草、虎尾草中的应用。
3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株粗毒素的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:(1)种子液制备,培养基配方:葡萄糖10g,蛋白胨10g,NaCl5g,KCl0.1g,MgSO40.1g,蒸馏水1000mL,调pH至6.5-7.2;
将按上述配方配制好的培养基倒入250mL三角瓶,每瓶100mL,121℃高压灭菌30min,冷却后在超净台内,无菌操作条件下,接种保存在80℃甘油中的铜绿假单胞菌菌株,接种量1%,接种后放37℃,转速180rpm的摇床中培养24h,即为种子液;
(2)发酵罐发酵,发酵罐培养液配方:葡萄糖1%,蛋白胨1%,NaCl0.5%,KCl0.01%,MgSO40.01%,pH6.5-7.2;
70L发酵罐按70%装上述培养基,装料后在120℃,0.12MPa下灭菌30分钟,冷却至30℃后按1%的比例接种制备好的种子液;培养温度37℃,通气量1∶1(v/v·min),发酵至72小时完毕;
(3)将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取48h,期间不断震荡使其充分萃取,之后分液得到乙酸乙酯相,减压浓缩至干,得到的黄绿色油膏状物质即为粗毒素。
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