CN101665778A - 黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌及其在结冷胶生产中的应用 - Google Patents

黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌及其在结冷胶生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌(Sphingomonassp.ZD001)及其在微生物发酵制备结冷胶中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2009年09月10日，保藏编号：CCTCC No：M 209198。本发明的有益效果主要体现在：该菌株发酵液不含黄色素而呈乳白色，只需用少量的乙醇或异丙醇沉淀多糖，即可得到无色优质的结冷胶，可使结冷胶生产简化后续提纯脱色工艺，提高得率，降低生产成本。

Description

黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌及其在结冷胶生产中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一株黄色素生成缺陷但能生产正常品质结冷胶的鞘脂单胞菌菌株ZD001(Sphingomonas sp.ZD001)及其在微生物发酵制备结冷胶中的应用。
(二)技术背景
结冷胶(Gellan Gum)是少动鞘脂单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)经好氧发酵产生的微生物胞外多糖，由美国Kelco公司于1978年开发成功。它是继黄原胶之后又一种无毒、安全、理化性质优良的微生物胞外多糖。日本早在1988年就准许在食品中使用，美国于1992年获FDA批准而用于食品，我国于1996年批准其作为食品增稠剂、稳定剂使用，另有十多个国家也已批准用作食品添加剂。近年来，结冷胶以其独特的优良特性，被作为新型乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶剂、缓释剂、成膜材料等日益广泛地应用于食品、医药、化工等工业领域，应用前景广阔。
结冷胶是由β-1，3-D-葡萄糖，β-1，4-D-葡萄糖醛酸和α-1，4-L-鼠李糖按摩尔比2∶1∶1组成，其以β-1，3-D-葡萄糖、β-1，4-D-葡萄糖醛酸、β-1，3-D-葡萄糖、a-1，4-L-鼠李糖的连接顺序构成四糖单元。在四糖单元聚合形成的糖长链骨架上连有酰基，分子量一般为5×105-1×106道尔顿左右。结冷胶主要以两种形式存在，即未经脱酰基的高酰基结冷胶(也称天然结冷胶)和经物理化学方法人工脱酰基的低酰基结冷胶。高酰基天然结冷胶中有两种酰基，即乙酰基和甘油酰基，通常乙酰基连接在第一个葡萄糖残基的C6位上，而甘油酰基连接在同一个葡萄糖残基的C2位上，一般每个四糖单元中平均含有1个甘油酰基，0.5个乙酰基。低酰基结冷胶则是由高酰基结冷胶通过脱酰基处理后而基本上不含酰基的产物，因此，结冷胶分子因是否脱酰基和脱酰基程度不同，分子量差异较大，目前在食品工业上应用较多的是分子量相对较低的低酰基结冷胶。
当前生产所用的结冷胶产生菌少动鞘脂单胞菌在发酵过程中同时会产生代谢副产物黄色素(主要是类胡萝卜色素)，这不仅与结冷胶竞争碳源，还使发酵液变黄。在结冷胶制备过程中，尤其是在高酰基结冷胶的制备过程中，为了去除胶体中的黄色素，增加了结冷胶提取脱色中乙醇或异丙醇的用量(一般用3倍发酵液体积的乙醇或异丙醇)与操作时间，使提取纯化的效率降低、成本提高。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一株黄色素生成缺陷但能生产正常品质结冷胶的鞘脂单胞菌菌株ZD001(Sphingomonas sp.ZD001)。该ZD001菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072；保藏日期：2009年9月10日；保藏编号：CCTCC No：M209198。故该菌株以下称ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株。
本发明采用的技术方案：
ZD001.(CCTCC NO：M 209198)菌株是本申请发明人分离选育所得。对其16S rDNA进行测序与分子比对，其与少动鞘脂单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)16S rDNA核苷酸序列同源性为99％以上，认定ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株为已见报道的结冷胶产生菌少动鞘脂单胞菌的同种变异株。
所述ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株的16S rDNA序列如下：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGATCCTTCGGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCTTGGGGTTCGGAATAACTCCCCGAAAGGGGTGCTAATACCGGATGATGTCGAAAGACCAAAGATTTATCGCCCTGAGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGAAGATAATGACTGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTCAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTGAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGTGCTTGGCACTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATGGTAGGACGACTGGCAGAGATGCCTTTCTTCCCTTCGGGGACCTACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGACTTTAGTTACCATCATTAAGTTGGGTACTTTAAAGTAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAAGTACAGTGGGCAGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTAATCTCCAAAACTTGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGTAAGAGAGGCAGGCGACCACGGTGGGCTTAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT。
所述ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株特征如下：为革兰氏阴性杆菌；无芽孢；直杆状；在营养琼脂平板上菌落呈乳白色；氧化酶试验阳性；接触酶试验阳性；专性需氧；分解葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖；淀粉水解试验阳性；不能液化明胶；43℃不生长；菌体大小为1.5～5.0μm×0.8-1.0μm；不产黄色素。
本发明还涉及所述的ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株在微生物发酵制备结冷胶中的应用。
具体的，所述应用为：将所述ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株按常规方法经活化、种子培养后，接种至常规适用于鞘脂单胞菌的发酵培养基，28～32℃、pH6.8～7.2摇床培养32～60h，获得含有高酰基结冷胶的发酵液。该发酵液可直接分离纯化得到高酰基结冷胶，也可进行脱酰基处理制取低酰基结冷胶。
制备产物为高酰基结冷胶时，方法如下：将所述含有高酰基结冷胶的发酵液调pH值为5.0～6.0，升温至50℃～70℃(优选60℃)保温30min～2h(优选1h)后，降温至40℃～50℃，调pH为7.0，加入溶菌酶和碱性蛋白酶保温1h～3h(优选2h)去除蛋白质；去除蛋白质后的发酵液加入絮凝剂溶液进行絮凝沉淀(絮凝剂溶液加入量约为去除蛋白质后发酵液体积的5％)，再经分离(加入体积为发酵液体积30％左右的体积浓度90％以上的异丙醇或乙醇，优选95％异丙醇，搅拌，板框压滤)、干燥(90℃)，制得所述高酰基结冷胶，所述絮凝剂(浓度通常为20％，w/v)为下列之一或其中两种以上的混合：CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl。
制备产物为低酰基结冷胶时，方法如下：往所述含有高酰基结冷胶的发酵液中加入碱金属或碱土金属氯化物溶液(浓度通常为20％，w/v)，调pH为11.0，固液分离(板框固液分离)得到纤维料1，将纤维料1与水按1∶4～6体积比混合，调pH2.5～4.0(优选pH3.0)，洗涤15min～1h(优选30min)，压滤得到纤维料2，将纤维料2与水按1∶9～12体积比混合均匀，升温至80℃～90℃(优选83℃～87℃)，加入碱性试剂调pH为9.5～10.5(优选pH9.8～10.2)反应8min～15min(优选10min～12min)，反应结束后调反应液pH为中性，加入助滤剂(添加量为1～3％，w/v，优选2％)，过滤，取滤液加入絮凝剂(优选10％质量浓度，添加体积为滤液体积的5％)进行絮凝沉淀，再经分离、干燥，制得所述低酰基结冷胶；所述碱金属或碱土金属氯化物为下列之一或其中两种以上的混合：CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl(优选CaCl2)，所述碱性试剂为下列之一或其中两种以上的混合：NaOH、KOH、Na3PO4，所述助滤剂为硅藻土、珍珠岩或其混合物，所述絮凝剂为下列之一或其中两种以上的混合：CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl(优选KCl)。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一株黄色素生成缺陷的鞘脂单胞菌ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株，其发酵液不含黄色素而呈乳白色，提取时可减少乙醇或异丙醇用量，简化工序，提高得率，降低成本，利于工业化生产获得优质的结冷胶。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株的分离及鉴定
1、无菌采集土壤样品，稀释涂布于YM琼脂培养基平板上；
2、该平板置于30℃培养5天；
3、挑取不同形态的细菌菌落，于相同培养基平板分别划线纯化分离，置于30℃培养5天。
YM琼脂培养基终浓度组成为：0.30％酵母抽提物，0.30％麦芽抽提物，0.50％蛋白胨，1.00％葡萄糖，琼脂1.50％，溶剂为蒸馏水。
注：本发明中培养基浓度均指质量体积百分比浓度，某组分浓度1％表示100mL培养基中含有1g该物质。
经筛选获得一株黄色素生成缺陷的ZD001(CCTCC NO：M 209198)菌株。该菌为革兰氏阴性杆菌；无芽孢；直杆状；在营养琼脂平板上菌落呈乳白色；氧化酶试验阳性；接触酶试验阳性；专性需氧；分解葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖；淀粉水解试验阳性；不能液化明胶；43℃不生长；菌体大小为1.5-5.0μm×0.8-1.0μm；不产黄色素。
实施例2：ZD001(CCTCC NO：M 209198)的发酵工艺
1、纯菌种接种于YPG培养基斜面上，30℃培养72h；
2、一级种子培养：将斜面种子接入50mL一级种子培养基(盛于250mL三角瓶)，于30℃，200rpm振荡培养24h，即为一级种子液；
3、二级种子培养：将一级种子液以5％体积比的接种量接入100mL二级种子培养基(盛于500mL三角瓶)，于30℃，200rpm振荡培养12h，即为二级种子液；
4、罐上发酵：将二级种子液以5％体积比的接种量接入发酵培养基中，30℃、pH 6.8～7.2条件下，通风1.0vvm，转速300rpm，培养48小时；
5、收集发酵产物：收集步骤4培养48小时的含结冷胶发酵液。
YPG斜面培养基组成与终浓度为：葡萄糖2.00％，蛋白胨0.50％，酵母抽提物0.30％，琼脂1.50％，溶剂为蒸馏水，pH7.2；
一级种子培养基终浓度组成为：酵母膏0.20％；牛肉膏0.30％；蛋白胨0.50％；氯化钾0.10％，溶剂为蒸馏水，pH7.2；
二级种子培养基：葡萄糖1.50％；酵母膏.0.50％；蛋白胨0.50％；磷酸二氢钾0.06％；磷酸氢二钾0.06％；硫酸镁0.06％，溶剂为蒸馏水，pH7.2；
发酵培养基：葡萄糖3.00％；酵母膏0.05％；蛋白胨0.30％；磷酸二氢钾0.06％；磷酸氢二钾0.10％；硫酸镁0.06％；溶剂为蒸馏水，pH7.2。
实施例3：高酰基结冷胶的制备工艺
1、发酵液预处理：发酵液100L，用10％(v/v)的HCl调pH6.0，升温至60℃，保温1h；
2、蛋白杂质去除：降温至40℃时，用10％(w/v)NaOH调pH7.0，加入50g的溶菌酶(20万U/g，庞博生物)及100g的碱性蛋白酶(2万U/g，庞博生物)，保温2h；
3、絮凝沉淀，分离：经过预处理及蛋白去杂处理后的发酵液中加入5L浓度为20％(w/v)的CaCl2溶液，搅拌30min后，加入30L异丙醇，继续搅拌1h后，板框压滤；
4、干燥、粉碎：压滤所得纤维料90℃干燥2h后粉碎，制得高酰基结冷胶成品，为乳白色粉末，含氮量为0.05～0.30％。
实施例4：脱酰结冷胶的制备工艺
1、发酵液预处理：取成熟发酵液100L，加入3L浓度为20％(w/v)的CaCl2溶液，搅拌10min后用10％NaOH调pH至11.0，搅拌3min后板框压滤，得纤维料；
2、洗涤：将步骤1预处理后的纤维料与水按1∶5的体积比混合，用10％HCl调pH3.0，搅拌30min后板框压滤，得纤维料。
3、脱酰基处理：将步骤2洗涤后的纤维料与水按1∶10的体积比混合，搅拌均匀，升温至90℃左右，使纤维料完全溶解，维持温度85℃，加入10％NaOH水溶液，调pH值9.5～10.5，反应10min后，用10％HCl调pH6.0；
4、加入质量为料液体积2％的硅藻土，维持温度80℃以上板框过滤后加入料液(滤过液)体积5％的KCl溶液(质量浓度为10％)，板框压榨；
5、干燥、粉碎：压榨所得结冷胶纤维料90℃干燥2h后粉碎，制得低酰基结冷胶成品。所得的低酰基结冷胶为乳白色粉末，强度≥800g/cm2，透光率≥80％。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江大学
浙江中肯生物科技有限公司
<120>黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌及其在结冷胶生产中的应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1481
<212>DNA
<213>Sphingomonas sp.
<400>1
agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcatgc ctaacacatg caagtcgaac    60
gagatccttc ggggtctagt ggcgcacggg tgcgtaacgc gtgggaatct gccttggggt   120
tcggaataac tccccgaaag gggtgctaat accggatgat gtcgaaagac caaagattta   180
tcgccctgag atgagcccgc gtaggattag ctagttggtg tggtaaaggc gcaccaaggc   240
gacgatcctt agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccag   300
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct gatccagcaa   360
tgccgcgtga gtgatgaagg ccttagggtt gtaaagctct tttacccggg aagataatga   420
ctgtaccggg agaataagcc ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg   480
ggctagcgtt gttcggaatt actgggcgta aagcgcacgt aggcggcttt gtaagtcaga   540
ggtgaaagcc tggagctcaa ctccagaact gcctttgaga ctgcatcgct tgaatccagg   600
agaggtgagt ggaattccga gtgtagaggt gaaattcgta gatattcgga agaacaccag   660
tggcgaaggc ggctcactgg actggtattg acgctgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa   720
caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga taactagctg tccgggtgct   780
tggcacttgg gtggcgcagc taacgcatta agttatccgc ctggggagta cggccgcaag   840
gttaaaactc aaaggaattg acgggggcct gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc   900
gaagcaacgc gcagaacctt accagcgttt gacatggtag gacgactggc agagatgcct   960
ttcttccctt cggggaccta cacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga  1020
gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgact ttagttacca tcattaagtt  1080
gggtacttta aagtaaccgc cggtgataag ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtcc  1140
tcatggccct tacgcgctgg gctacacacg tgctacaatg gcaagtacag tgggcagcaa  1200
tcccgcgagg gtgagctaat ctccaaaact tgtctcagtt cggattgttc tctgcaactc  1260
gagagcatga aggcggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc  1320
ccaggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg ggttcacccg aaggcgttgc  1380
gctaactcgt aagagaggca ggcgaccacg gtgggcttag cgactggggt gaagtcgtaa  1440
caaggtagcc gtaggggaac ctgcggctgg atcacctcct t                      1481

Claims (7)

1.一株黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌(Sphingomonas sp.)ZD001，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2009年09月10日，保藏编号：CCTCC No：M 209198。
2.如权利要求1所述的鞘脂单胞菌，其特征在于所述鞘脂单胞菌的16SrDNA序列如下：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCA
AGTCGAACGAGATCCTTCGGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGG
GAATCTGCCTTGGGGTTCGGAATAACTCCCCGAAAGGGGTGCTAATACCGGA
TGATGTCGAAAGACCAAAGATTTATCGCCCTGAGATGAGCCCGCGTAGGATTA
GCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGA
GAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGA
GGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCC
GCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGAAGATA
ATGACTGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGT
AGGCGGCTTTGTAAGTCAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTG
CCTTTGAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTG
TAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTC
ACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT
TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGTGC
TTGGCACTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTAC
GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTG
GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACA
TGGTAGGACGACTGGCAGAGATGCCTTTCTTCCCTTCGGGGACCTACACACA
GGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC
GCAACGAGCGCAACCCTCGACTTTAGTTACCATCATTAAGTTGGGTACTTTAA
AGTAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCA
TGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAAGTACAGTGGGC
AGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTAATCTCCAAAACTTGTCTCAGTTCGGATTG
TTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG
CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT
GGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGTAAGAGAGGCAGGC
GACCACGGTGGGCTTAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAG
GGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT。
3.如权利要求1所述的鞘脂单胞菌，其特征在于所述鞘脂单胞菌菌株特征如下：为革兰氏阴性杆菌；无芽孢；直杆状；在营养琼脂平板上菌落呈乳白色；氧化酶试验阳性；接触酶试验阳性；专性需氧；分解葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖；淀粉水解试验阳性；不能液化明胶；43℃不生长；菌体大小为1.5～5.0μm×0.8-1.0μm；不产黄色素。
4.如权利要求1所述的鞘脂单胞菌在微生物发酵制备结冷胶中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述鞘脂单胞菌菌株经活化、种子培养后，接种至适用于鞘脂单胞菌的发酵培养基，28～32℃、pH6.8～7.2摇床培养32～60h，获得含有高酰基结冷胶的乳白色发酵液。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述含有高酰基结冷胶的发酵液经分离纯化，制得高酰基结冷胶；所述分离纯化方法如下：含有高酰基发酵液调pH值为5.0～6.0，升温至50℃～70℃保温30min～2h后，降温至40℃～50℃，调pH为7.0，加入溶菌酶和碱性蛋白酶保温1h～3h去除蛋白质；去除蛋白质后的发酵液加入絮凝剂溶液进行絮凝沉淀，再经分离、干燥，制得所述高酰基结冷胶，所述絮凝剂为下列之一或其中两种以上任意比例的混合：CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述含有高酰基结冷胶的发酵液经脱酰基处理后、再经分离纯化制得低酰基结冷胶，所述的低酰基结冷胶的制备方法如下：含有高酰基结冷胶的发酵液加入碱金属或碱土金属氯化物溶液，调pH为11.0，固液分离得到纤维料1，将纤维料1与水按1∶4～6体积比混合，调pH2.5～4.0，洗涤15min～1h，压滤得到纤维料2，将纤维料2与水按1∶9～12体积比混合均匀，升温至80℃～90℃，加入碱性试剂调pH为9.5～10.5反应8min～15min，反应结束后调反应液pH为中性，加入助滤剂，过滤，取滤液加入絮凝剂进行絮凝沉淀，再经分离、干燥，制得所述低酰基结冷胶；所述碱金属或碱土金属氯化物为下列之一或其中两种以上的混合：CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl，所述碱性试剂为下列之一或其中两种以上的混合：NaOH、KOH、Na3PO4，所述助滤剂为硅藻土、珍珠岩或其混合，所述絮凝剂为下列之一或其中两种以上的混合：CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl。
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