CN104936973A - 生产蛋白的方法 - Google Patents

生产蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104936973A
CN104936973A CN201480006129.1A CN201480006129A CN104936973A CN 104936973 A CN104936973 A CN 104936973A CN 201480006129 A CN201480006129 A CN 201480006129A CN 104936973 A CN104936973 A CN 104936973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cutting
pei
dab
less
flocculation agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480006129.1A
Other languages
English (en)
Inventor
A.查特尔
M.霍尔
P.孔帕卢梅
J.R.莫莱克
J.M.雷克
A.D.韦伯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Glaxo Group Ltd
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of CN104936973A publication Critical patent/CN104936973A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/303—Extraction; Separation; Purification by precipitation by salting out
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及通过收获微生物细胞培养液并添加一定量絮凝剂以实现有效粒径分布来生产重组蛋白的方法。本发明还涉及通过添加一定量絮凝剂以实现有效粒径分布来澄清微生物收获物的方法。

Description

生产蛋白的方法
本发明涉及通过收获微生物细胞培养液并添加一定量絮凝剂以实现有效粒径分布来生产重组蛋白的方法。本发明还涉及通过添加一定量絮凝剂以实现有效粒径分布来澄清微生物收获物的方法。
发明背景
重组蛋白的大规模制造是生物技术工业的重要挑战。重组蛋白通常由宿主细胞培养物或经由无细胞的系统生产。在每种情况下，将蛋白从包含杂质的样品纯化至足以用作人治疗产品的纯度。典型工艺涉及初始澄清以移除固体微粒，随后纯化以确保足够纯度。澄清可降低对纯化期间后续层析步骤的负荷。
典型澄清步骤包含离心步骤或过滤步骤或二者。在澄清之前，可使用预处理步骤作为调节样品的方法。调节预处理步骤的实例是絮凝，其引起固体微粒形成较大聚集物，随后通过澄清移除所述较大聚集物。
对使用絮凝剂的许多焦点是增加存在于样品中的固体微粒的粒径以改善澄清效率。这是因为较大聚集物通过离心更易于移除。
澄清方法的开发通常涉及选择有效量的絮凝剂以(i)最大化固体微粒移除、(ii)保存产品质量和产品回收率、(iii)最小化所用絮凝剂的量(过多会引起浑浊)、(iv)最小化絮凝剂对后续纯化步骤(例如层析步骤)的影响和(v)确保絮凝剂移除至治疗产品中的可接受水平。
因此，在选择有效量的絮凝剂以实现期望效应同时最小化不期望效应时，必须实现小心平衡。
用以测定有效量的絮凝剂的经验测试通常在澄清和纯化工艺的不同阶段实施，所述工艺包括评价以下之一或组合：(a)絮凝物特性，诸如(i)絮凝物的形成(絮凝的起始)和絮凝物的破裂；(ii)絮凝物大小；(iii)絮凝物的机械稳定性/强度；(iv)絮凝物的表面剪切抗性；(b)澄清效率；(c)滤过性；和(d)纯化。此类经验测试可耗时且费力。
因此，需要生产重组蛋白的微生物细胞收获物的更有效澄清方法。
发明概述
本发明提供生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括：
(a)收获表达重组蛋白的微生物细胞培养液；和
(b)添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。
在另一方面，本发明提供生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括：
(a)收获表达重组蛋白的微生物细胞培养液；
(b)添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内；和
(c)澄清絮凝收获物。
在另一方面，本发明提供生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括：
(a)收获表达重组蛋白的微生物细胞培养液；
(b)添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内；
(c)澄清絮凝收获物；和
(d)从澄清絮凝收获物纯化重组蛋白。
在另一方面，本发明提供澄清微生物收获物的方法，其中所述方法包括：
(a)收获微生物细胞培养液；
(b)添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内；和
(c)澄清絮凝收获物。
在又一方面，本发明提供修饰的大肠杆菌细胞收获物，其中：
(a)细胞表达细胞周质靶向重组蛋白；
(b)收获物包含0.01-2% PEI；且
(c)收获物的体积粒径分布为约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。
附图简述
图1：显示DOM100收获物的粒径分布，其中添加0.005%、0.05%、0.1%、0.5%和2% PEI。
图2：Dat06收获物的直径等于或小于5μm的颗粒的体积%，其中添加0.03%、0.05%、0.1%、0.5%和2.0% PEI。
图3：DOM101收获物(空心圆)和暴露于高剪切的收获物(闭合圆)的粒径分布。大小分布表示为(a)总体积粒径分布(log标度)；强调峰1(插图b)、峰1和2(插图c)，以及峰3(插图d)的粒径分布。
图4：用0.5% PEI处理的DOM101收获物(闭合圆)和用低剪切(十字形)和高剪切(空心圆)处理的PEI絮凝收获物的粒径分布。大小分布表示为(a)总体积粒径分布(log标度)；强调峰1(插图b)、峰1(插图c)，以及峰2(插图d)的粒径分布。
图5：PEI浓度对DOM100微生物培养液收获物浊度(进料浊度)和离心后浊度(离心液(centrate)浊度)的影响。
图6：DOM0101收获物(a)和0.5% PEI存在下的DOM101收获物(b)的剩余固体%的超比例缩减模型。还代表经受无剪切(闭合圆)、低剪切(十字形)和高剪切(空心圆)的样品。
图7：PEI浓度对DOM100收获物离心液的主要过滤器容量的影响。
图8：三种不同絮凝剂对示例性蛋白Dat06和DOM100的收获物中的DNA浓度的影响。
图9：0.5% PEI对示例性蛋白DOM0101收获物离心液的滤过性的影响。
图10：在不同收获物诱导后时间，有和无0.5% PEI处理的DOM0101收获物离心液的滤过性的Vmax的变化。
图11：解冻DOM101收获物(空心圆)和用高剪切处理的解冻收获物(闭合圆)的粒径分布。大小分布表示为(a)总体积粒径分布(log标度)；强调峰1(插图b)、峰1、2和3(插图c)，以及峰3和4(插图d)的粒径分布。
图12：解冻DOM101收获物(闭合圆)和用高剪切处理的0.5% PEI解冻收获物(空心圆)的粒径分布。大小分布表示为(a)总体积粒径分布(log标度)；强调子峰(插图b)、峰1(插图c)、峰1和2(插图d)，以及峰2的尾端(插图e)的粒径分布。
图13：在无剪切(闭合圆)、低剪切(十字形)和高剪切(空心圆)存在下用0.5% PEI处理的解冻DOM101收获物的粒径分布。大小分布表示为(a)总体积粒径分布(log标度)；强调峰1(插图b)、峰1(插图c)，以及峰2(插图d)的粒径分布。
图14：用剪切解冻DOM101收获物(闭合圆)和均质化解冻DOM101收获物(空心圆)的粒径分布。大小分布表示为(a)总体积粒径分布(log标度)；强调峰1(插图b)、峰2和3(插图c)，以及峰3(插图d)的粒径分布。
图15：解冻DOM101收获物(a)与添加PEI(b)和随后暴露于低剪切(c)或高剪切(d)的显微镜图像。
图16：DOM0101均质化解冻收获物(a)、DOM101解冻收获物(b)和0.5% PEI絮凝DOM101解冻收获物(c)的剩余的固体%的超比例缩减模型(如图6的图注)。
图17：评价具有0-0.6%的PEI浓度范围和pH4-9的pH范围的DAT06发酵收获物的：(A)如于A600nm波长下测量的上清液浊度以评价溶液澄清度(0.2-2.0的标度)；和(B)处理能力，如通过在离心力下穿过0.2μm过滤器的直接过滤性能测量(滤液体积标度为0-250)。
图18：用0.1% PEI(低絮凝剂浓度)和0.4% PEI(高絮凝剂浓度)和不同离子强度(导电率)的NaCl溶液处理Dat06收获物。"低絮凝剂"和"高絮凝剂"仅出于比较原因使用。在A中评价平均颗粒直径(μm)；且在B中评价≤ 5μm的颗粒的体积%。
图19：用4.3% CaCl2、0.1% PEI和0.2% PEI使DOM100收获物发生絮凝。在A中评价平均颗粒直径，且在B中评价≤5μm的颗粒的体积%(粒径由空心正方形显示)。使用分批离心机和管式离心机(连续离心机)测定过滤器容量。
图20：将添加0.4% PEI的Dat06和DOM100收获物与未用絮凝剂处理的样品进行比较。随后通过离心实施澄清且使用定制分析型免疫分析测量HCP水平。
详述
本发明涉及以下认识：可通过影响5μm或以下的颗粒的粒径分布和比例实现利用絮凝剂的更有效澄清方法。本发明人已认识到，在絮凝剂添加后，5μm或以下的颗粒的比例决定澄清效率。通过在絮凝剂添加后实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内而产生更有效澄清方法。
使用此方法防止需要费力经验测试以测定澄清工艺的不同阶段时的絮凝剂的有效量。
与未添加絮凝剂或未实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内的絮凝剂的量相比，本文所述方法在澄清期间离心后产生降低的固体含量(增加的固体移除)。此离心步骤中的固体的有效移除代表显著益处，因为改善性能对下游过滤和/或纯化步骤具有放大效应。这也使用特别粘或具有高密度的细胞培养物。这可经由离心机产生改善的处理时间。
与未添加絮凝剂或未实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内的絮凝剂的量相比，本文所述方法在澄清期间产生改善滤过性。这可产生穿过过滤器的改善流速。此外，可增加最大过滤器容量。因此，总处理时间减少。由于这些优势，可降低过滤器成本。
与未添加絮凝剂或未实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内的絮凝剂的量相比，本文所述方法在澄清期间离心后产生降低浊度。
与未添加絮凝剂或未实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内的絮凝剂的量相比，本文所述方法产生澄清絮凝收获物中的降低DNA浓度。
与未添加絮凝剂相比，其它改善包括针对在澄清期间的剪切影响的改善的保护。
所述改善也适于通过冻融和/或均质化预处理的收获物。
所述方法导致鉴定在澄清期间实现期望效应的絮凝剂的最小有效量。
本文所用"约"在提及可测量值(例如量、时距等)时，意指涵盖偏离指定值±1%、±0.75%、±0.5%、±0.25%、±0.2%和±0.1%的变化，如同此类变化适于实施所述方法一样。
重组蛋白
重组蛋白可包含抗原结合蛋白、单克隆抗体、抗体片段或结构域抗体。
重组蛋白可包含病毒蛋白、细菌毒素、细菌类毒素或癌症抗原。例如，细菌类毒素是白喉类毒素，诸如CRM197；或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜糖缀合物和包含蛋白E和/或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的PilA的蛋白组分。
如本文所用，"重组蛋白"是指任何可施用于哺乳动物以诱导组织、系统、动物或人的生物或医学反应的蛋白和/或多肽。重组蛋白可诱导多于一种生物或医学反应。此外，术语"治疗有效量"意指与未接受该量的相应受试者相比，导致，但不限于，治愈、预防或改善疾病、病症或副作用或疾病或病症的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量以及在患者中有效引起增强或有助于第二药剂的治疗效应的生理功能的量。
本文所用术语"抗原结合蛋白"是指能够结合至抗原的抗体、抗体片段和其它蛋白构建体(诸如结构域)。
本文所用术语"抗体"在最广泛含义上是指具有免疫球蛋白样结构域的分子。如本文所用，"免疫球蛋白样结构域"是指保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特性的多肽的家族，其含有两个β片和通常保守二硫键。该家族包括单克隆(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)、重组、多克隆、嵌合、人源化、双特异性和异源缀合物抗体；单一可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv、双链抗体、TANDABS™等(关于替代"抗体"形式的概述，参见Holliger和Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136)。
短语"单一可变结构域"是指以独立于不同可变区或结构域的方式特异性结合抗原或表位的抗原结合蛋白可变结构域(例如，VH、VHH、VL)。可认为"结构域抗体"或"dAb"与能够结合至抗原或表位的"单一可变结构域"相同。术语"表位结合结构域"是指以独立于不同结构域的方式特异性结合抗原或表位的结构域。
本文所用术语"结构域"是指折叠蛋白结构，其保留独立于蛋白剩余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的离散功能性质，且在许多情况下可进行添加、移除或转移至其它蛋白而不损失蛋白的剩余部分和/或结构域的功能。单一抗体可变结构域或免疫球蛋白单一可变结构域意指包含抗体可变结构域的序列特性的折叠多肽结构域。因此，其包括完整抗体可变结构域和修饰可变结构域(例如其中一个或多个环已经被不具有抗体可变结构域特性的序列置换)、或已经被截短或包含N-或C末端延伸的抗体可变结构域、以及可变结构域中至少部分保留全长结构域的结合活性和特异性的折叠片段。
结构域抗体可以具有其它可变区或可变结构域的形式(例如同多聚物或异多聚物)存在，其中该单一免疫球蛋白可变结构域结合抗原不需要所述其它区或结构域(即其中免疫球蛋白单一可变结构域以独立于其它可变结构域的方式结合抗原)。
结构域抗体可以是人抗体可变结构域。dAb可以是人来源的。换言之，dAb可基于人Ig框架序列。
本文所用术语"抗原结合位点"是指抗原结合蛋白上能够特异性结合抗原的位点，这可以是单一结构域，或其可以是可在标准抗体上发现的成对VH/VL结构域。单链Fv(ScFv)结构域也可提供抗原结合位点。
抗原结合蛋白可包含不同抗原的其它抗原结合位点，诸如其它表位结合结构域。例如，抗原结合蛋白可对多于一种抗原(例如两种抗原或三种抗原或四种抗原)具有特异性。
抗原结合蛋白可由在每一末端直接或间接(例如经由接头序列)连接至结合结构域的抗体的Fc区或其部分组成或基本上由其组成。此类抗原结合蛋白可包含两个由Fc区或其部分分开的结合结构域。分开意指结合结构域不彼此直接连接，且可位于Fc区或任何其它支架区的相对末端(C和N末端)。
抗原结合蛋白可包含两个支架区，其各自在(例如)每一支架区的N和C末端处直接或经由接头间接结合至两个结合结构域。每一结合结构域可结合至不同抗原。
抗原结合蛋白可采取mAbdAb的蛋白支架模式。"mAbdAb"和"dAbmAb"可互换使用且意欲具有与本文所用相同的含义。此类抗原结合蛋白包含蛋白支架，例如Ig支架，诸如IgG，例如单克隆抗体，其连接至其它结合结构域，例如结构域抗体。mAbdAb具有至少两个抗原结合位点，其至少一个来自结构域抗体，且至少一个来自配对VH/VL结构域。
结构域抗体可存在且以单体或多聚物(例如二聚物)形式结合至目标，且可与其它分子组合用于格式化和靶向方法。例如，可制备具有多个结构域的抗原结合蛋白，其中一个结构域结合至血清蛋白，诸如白蛋白。结合血清白蛋白的结构域抗体(AlbudAbsTM)描述于，例如，WO05/118642中，且可本身为结构域融合配偶体提供延长血清半衰期。
dAb也可缀合至其它分子，例如呈与其它分子(例如药物、另一蛋白、抗体分子或抗体片段)的dAb-缀合物或dAb-融合体形式。例如，dAb可以格式化dAb形式存在，例如，dAb可以作为dAb-fc融合体或缀合物存在，如，例如，WO 2008/149148中所述。或者，格式化dAb可以作为mAbdAb存在，如WO 2009/068649中所述。dAb可以作为与延长半衰期的蛋白或多肽(例如，结合至血清白蛋白或延长半衰期的化学部分(例如聚乙二醇(PEG))的另一dAb(AlbudAb™))的融合体或缀合物存在。dAb可以作为与其它治疗或活性分子的融合体或缀合物存在。
本文所用"药物"是指任何可施用于个体以经由在个体中结合至生物目标分子和/或改变其功能产生有益治疗或诊断效应的化合物(例如，小的有机分子、核酸、多肽)。目标分子可以是由个体的基因组编码的内源目标分子(例如，由个体的基因组编码的酶、受体、生长因子、细胞因子)或由病原体的基因组编码的外源目标分子。药物可以是dAb或mAb。
"dAb缀合物"是指包含借助共价或非共价键化学缀合药物的dAb的组合物。优选地，dAb和药物共价键合。此类共价键可以经由肽键或其它方式，诸如经由修饰的侧链。非共价键合可以是直接(例如，静电相互作用、疏水相互作用)或间接键合(例如，经由互补结合配偶体(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合，其中一种配偶体共价键合至药物且互补结合配偶体共价键合至dAb)。当采用互补结合配偶体时，一种结合配偶体可直接或经由合适接头部分共价键合至药物，且互补结合配偶体可直接或经由合适接头部分共价键合至dAb。
如本文所用"dAb融合体"是指包含dAb和多肽药物(其可以是多肽、dAb或mAb)的融合蛋白。dAb和多肽药物作为单一连续多肽链的离散部分(parts或moieties)存在。
因此，本公开的方法可适于以下中的一者或多者：治疗蛋白、单克隆抗体(mAb)、结构域抗体(dAb)、dAb缀合物、dAb融合体、mAbdAb或上述任何其它抗原结合蛋白。
例如，抗原结合蛋白是肽-dAb融合体(例如艾塞那肽4(Exendin 4)- AlbudAbTM/Dat01)、dAb缀合物(例如具有C末端半胱氨酸(对于PYY化学缀合)的AlbudAbTM /Dat06)、dAb-dAb融合体(例如AlbudAbTM – TNFR1 VH dAb / DOM100)或裸dAb(例如VH dAb(抗TNFR1)/DOM101)。
例如，抗原结合蛋白包含SEQ ID NO: 1(Dat01)、SEQ ID NO: 3(Dat06)、SEQ ID NO: 5(DOM100)、SEQ ID NO: 7(DOM101)、或SEQ ID NO: 9(DOM101丙氨酸延伸)或由其组成。
蛋白的表达
合适微生物细胞可以是原核细胞，其包括细菌细胞，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。此细菌细胞包括大肠杆菌(例如，菌株W3110或BL21)、芽孢杆菌属(Bacilli sp.)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和其它合适细菌。
合适微生物细胞可以是真核细胞，其包括酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或真菌(例如曲霉菌属(Aspergilus sp.))。
本文还描述包含编码重组蛋白的重组核酸分子的载体。载体可以是包含一个或多个可操作连接至重组核酸的表达控制元件或序列的表达载体。载体的实例包括质粒和噬菌粒。
合适表达载体可含有许多组分，例如复制起点、可选标记基因、一个或多个表达控制元件(诸如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子))和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列。表达控制元件和信号序列(如果存在)可由载体或其它来源提供。例如，编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列可用于引导表达。
可提供用于在期望细胞中表达的启动子。启动子可以是组成型或诱导型。例如，启动子可以可操作连接至编码抗体、抗体链或其部分的核酸，使得其引导核酸的转录。可使用适于原核细胞的多种启动子( 例如 ，大肠杆菌的lac、tac、trp、phoA、lambdapL、T3、T7(T7A1、T7A2、T7A3)启动子)。可采用的操纵子序列包括lac、gal、deo和gin。可采用一个或多个完美回文对称操纵子序列。
另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的细胞的可选标记，且在可复制表达载体情况下包含复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常见可选标记且可用于原核细胞(例如，内酰胺酶基因(氨苄西林(ampicillin)抗性)、Tet基因(四环素抗性)和真核细胞(例如，新霉素(neomycin)(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄西林或潮霉素(hygromycin)抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许用氨甲蝶呤(methotrexate)在多种细胞中进行选择。
可使用如WO2007/088371中所述的表达载体(例如pAVE037、pAVE007或pAVE011)以表达蛋白。或者，可使用市售载体(诸如pJExpress 401)以表达蛋白。
宿主细胞包含上述重组核酸分子或载体。
本发明的微生物细胞培养液的细胞表达重组蛋白。可在细胞内表达重组蛋白。在另一方面，表达的重组蛋白具有信号序列(也称作信号肽)，其沿微生物细胞的分泌途径引导蛋白。
在革兰氏阳性细菌中，分泌蛋白最通常横跨单一膜通过Sec途径或Tat途径移位。在革兰氏阴性细菌中，一些分泌蛋白在单一步骤中经由I型、III型、IV或VI型分泌途径横跨内膜和外膜输出，而其它蛋白首先经由通用Sec或Tat途径输出至细胞周质中且随后主要经由II型或V型机制横跨外膜移位。II型系统涉及两步过程，其中含有Sec分泌序列的未成熟蛋白使用Sec途径输出至细胞周质。通过蛋白裂解移除分泌序列，从而导致在细胞周质中存在成熟的经加工蛋白，且蛋白是否分泌至培养基高度取决于分泌序列、蛋白、细胞和培养条件的特性。同样在细胞裂解(自裂解)的情况下，可假定培养基中的大部分蛋白源自细胞周质且因此对其进行加工。重组蛋白可经由分泌信号序列主动分泌至培养基中；或经由本领域已知的其它细胞途径从细胞周质被动分泌至培养基。
信号序列的加工包括信号序列从蛋白的裂解和移除。然而，已知信号序列的一些氨基酸保留在蛋白的N末端处，使得信号序列未被适当加工。信号序列可90%或更多被加工，使得10%或更少信号保留在蛋白的N末端处。信号序列可至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%被加工。信号序列可约100%被加工，使得在穿过细胞的分泌途径后，在蛋白的N末端处无保留。
信号序列可以是细胞周质靶向信号序列。本领域已知用于引导蛋白至细胞周质的信号序列。例如，使用MalE信号序列。或者，使用PelB或OmpA信号序列。
收获
使微生物宿主细胞在合适条件下生长以表达重组蛋白。微生物细胞培养液是表达重组蛋白的宿主细胞的群体。可在发酵容器中遵循标准程序利用培养基(诸如复杂培养基)使用宿主细胞(例如大肠杆菌)的进料分批发酵生产微生物细胞培养液。发酵条件包括为细胞进料营养和空气供应。
收获是发酵的结束。收获可在发酵期间认为足以结束发酵工艺且回收所表达重组蛋白的任一时间点。收获可在细胞培养液诱导以表达重组蛋白后8小时与50小时之间进行。例如，收获可在诱导后8小时与36小时之间进行。在收获时，微生物细胞群体的固体含量可在5-30%湿细胞重量(WCW)之间。
发酵罐体积可以是：
(i)约10,000升；约5,000升；约2,000升；约1,000升；约500升；约125升；约50升；约20升；约10升；约5升；或
(ii)5升与10,000升之间；10升与5,000升之间；20升与2,000升之间；50升与1,000升之间。
收获物的粒径分布的变化可相当大，其中更大或更小程度的微细(≤5μm)颗粒形成。例如，颗粒≤5μm的总体积%可以是5%或更多、10%或更多、25%或更多、50%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多或100%。
收获物可包含自然裂解(也称作自裂解)的细胞。例如，收获物中的1-50%细胞可已经经历自裂解。或者，收获物中的20-50%、或30-50%或40-50%细胞已经自裂解。或者，收获物中的10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多或50%或更多细胞自裂解。可通过澄清收获物中的DNA浓度或通过电容间接测定自裂解，如实施例中所述。也可通过将重组蛋白释放/分泌至培养基中而间接测定自裂解，但这不必是直接关系，因为存在可释放/分泌至培养基中的其它方式(如上文论述)。
收获可包括排空微生物细胞培养液的发酵罐的任选步骤。
收获物的任选预处理
收获物的预处理是调节收获物的方法。该步骤可在发酵罐中或在已经从发酵罐移除收获物后实施。预处理包括：热、机械或化学裂解收获物(例如通过均质化、冻融、裂解)；和细胞周质提取。可使用本领域已知的方法提取至少一种细胞周质提取物。可在细胞内表达蛋白，且可裂解细胞以释放蛋白。例如，可均质化细胞以从细胞内部或从细胞周质内释放蛋白。
在一个实施方案中，在添加絮凝剂之前未进一步处理收获物。例如，收获物不是裂解物，即其未经化学裂解剂处理。例如，收获物不是均质物。例如，收获物未经受冻融。
絮凝剂的添加
本发明人假设改善的澄清步骤可涉及使用絮凝剂以实现收获物中的低比例(5%或更少)的微细(≤5μm或更小)颗粒。因此，在添加絮凝剂之前监测粒径分布，且絮凝剂的水平不断增加。
絮凝剂包括：矿物质或植物水胶体；阴离子聚电解质(例如聚苯乙烯磺酸酯、阴离子聚丙烯酰胺)；阳离子聚电解质(例如聚乙烯亚胺(PEI)、阳离子聚丙烯酰胺)、来自微生物的天然聚合物(例如壳聚糖)；和化学絮凝剂，例如硫酸铝、合成和非合成聚合物和强阳离子。絮凝剂的具体实例包括PEI(MW：50kDa至100kDa)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)(低分子量版本MW：100kDa至200kDa；或高分子量版本400kDa至500kDa)、酸沉淀、CaCl2、壳聚糖(MW：110kDa)。在一个实施方案中，絮凝剂是PEI(50kDa至100kDa)。在另一个实施方案中，絮凝剂是PDADMAC低分子量版本MW：100kDa至200kDa。在又一个实施方案中，絮凝剂是PDADMAC高分子量版本400kDa至500kDa。在另一个实施方案中，絮凝剂是CaCl2。
絮凝剂引起不溶性或固体物质的聚集，使得可溶性重组蛋白保留于溶液中。PEI既可用作可溶性物质(诸如核酸、脂质、胶状蛋白(不是重组蛋白))的"沉淀"；且也可用作细胞和细胞碎片的"絮凝剂"，使得重组蛋白留在溶液中。
向收获物中添加一定量的絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。该絮凝剂的量可以是收获物的0.01体积%至5体积%之间。或者，絮凝剂的量可以是收获物的0.01体积%至2体积%之间。例如，絮凝剂的量可以是收获物的0.1体积%与2体积%之间、0.1体积%与0.5体积%之间；或0.3体积%与0.5体积%之间，或者是0.5体积%。
例如，PEI、PDADMAC低分子量版本(MW：100kDa至200kDa)或PDADMAC高分子量版本(400kDa至500kDa)为0.1-2%之间的浓度。或者，CaCl2为3-6%之间、例如4.3%的浓度。例如，DOM100收获物中的PEI浓度是0.1-2.0%、0.15-2.0%、0.2-2.0%或0.3-0.5%。或者，DOM100收获物中的CaCl2浓度是4.3%。例如，Dat01收获物中的PEI浓度为0.05-0.8%、0.1-0.8%或0.1-0.2%之间。例如，Dat06收获物中的PEI浓度或PDADMAC(高或低)浓度为0.1-0.5%、0.2-0.5%或0.15-0.4%之间。例如，DOM101收获物中的PEI浓度为0.5%。
絮凝收获物的粒径分布应为约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。这与絮凝剂添加之前的收获物中5μm或更小的大小范围内的颗粒的起始比例无关。因此，如果收获物中在5μm或更小的大小范围内的颗粒的百分比高于5%，则絮凝剂的添加应将该百分比降低至约5%或以下。如果收获物中在5μm或更小的大小范围内的颗粒的百分比为约5%或以下，则絮凝剂的添加应维持该百分比为约5%或以下。
收获步骤与絮凝剂添加之间经过的时间可为0小时至24小时之间。或者，收获步骤与絮凝剂添加之间经过的时间可为0小时至12小时、0小时至6小时或0小时至3小时之间。
可使用配备有小体积分散单元的Malvern Master Size Instrument(Malvern instruments, Worcestershire, UK)根据制造商建议的方案测定粒径分布。
折射率(RI)可设定在1.4至1.6之间。例如，RI可设定为1.45或1.52或1.59。吸附系数可设定为0.000与0.001之间。例如，吸附系数可设定为0.000或0.001。
在添加絮凝剂之后，5μm的大小分布中的颗粒的百分比可以是约5%或更小；约4%或更小；约3%或更小；约2.5%或更小；约2%或更小；约1.5%或更小；约1%或更小；约0.5%或更小；约0.25，或更小；约0.1%或更小；约0.05%或更小；约0.01%或更小；或约0%。
例如，5μm的大小分布中的颗粒的百分比可在0-6%、0-5%、0-4%、0-3%、0-2.5%、0-2%、0-1.5%、0-1%、0-0.05%或0-0.01%范围内。
5μm或更小体积中的颗粒的大小范围可为约4μm或更小；约3μm或更小；约2.5μm或更小；约2μm或更小；约1.5μm或更小；约1μm或更小；约0.5μm或更小。例如，大小范围可为0μm至5μm、0μm至4μm、0μm至3μm、0μm至2μm、或0μm至1μm。
可添加第一量的絮凝剂，评价粒径分布，且如果需要，添加第二量的絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。
澄清
澄清是移除固体微粒的过程。澄清可降低对纯化期间后续层析步骤的负荷。典型澄清步骤包括沉降步骤(也称作沉积，例如通过重力)、和/或离心步骤和/或过滤步骤。
离心步骤可以是连续离心(例如，利用连续进料区)。关于排放固体，离心机可自身是"分批"或"间歇"或"连续"操作。例如，管式离心机可用作连续离心步骤。
离心后剩余的固体%可以是约0%；约0.5%或更小；约1%或更小；约2%或更小；约3%或更小；约4%或更小；约5%或更小；约10%或更小；约15%或更小；或约20%或更小。
可使用离心作为唯一澄清过程。或者，离心可与过滤组合使用以提供组合澄清过程。离心可进行作为第一步骤且随后过滤作为后续步骤，或反之亦然。或者，可使用过滤作为唯一澄清过程。过滤(例如深度过滤)可提供进一步澄清，移除小的固体颗粒。
与无絮凝剂相比，添加絮凝剂的过滤器容量可改善约200%；约300%或更多；约400%或更多；约500%或更多；约600%或更多；约700%或更多；约800%或更多；约900%或更多；约1000%或更多；或约2000%或更多。
重组蛋白的纯化
澄清之后经常纯化以确保重组蛋白的足够纯度。可使用一个或多个层析步骤，例如一种或多种层析树脂；和/或一个或多个过滤步骤。例如，可使用利用树脂诸如蛋白A或L的亲和层析纯化重组蛋白。或者或另外，可使用离子交换树脂(诸如阳离子交换)以纯化重组蛋白。
重组蛋白回收率
实施例中描述四种不同重组蛋白。没有迹象表明蛋白回收率受如通过本文方法所述絮凝剂的使用损害。如通过本文方法所述使用絮凝剂可能实际上改善蛋白从细胞的释放。
其它因素
改变添加絮凝剂后的收获物的pH可用于微调5μm和以下的颗粒的数目。例如，收获物加上絮凝剂的pH可调节至pH≤7。收获物加上絮凝剂的pH可调节至pH 4-7；或pH 4-6；或pH 4-5。
改变添加絮凝剂后的收获物的导电率可用于微调5μm和以下的颗粒的数目或平均颗粒直径。
以下项目描述本发明：
项目1. 生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括：
(a)收获表达所述重组蛋白的微生物细胞培养液；和
(b)添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。
项目2. 项目1的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(c)澄清絮凝收获物。
项目3. 项目2的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(d)从所述澄清絮凝收获物纯化所述重组蛋白。
项目4. 澄清微生物收获物的方法，其中所述方法包括：
(a)收获微生物细胞培养液；
(b)添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内；和
(c)澄清所述絮凝收获物。
项目5. 项目4的方法，其中所述微生物细胞培养液表达重组蛋白。
项目6. 前述项目中任一项的方法，其中(a)的收获步骤与步骤(b)中的絮凝剂添加之间经过的时间为0小时至24小时之间。
项目7. 前述项目中任一项的方法，其中所述方法在步骤(a)与(b)之间进一步包括额外步骤：
(b’)通过(i)机械或化学裂解或(ii)细胞周质提取预处理所述收获物。
项目8. 项目1至6中任一项的方法，其中在步骤(b)之前，步骤(a)的收获微生物细胞培养液未进一步处理。
项目9. 项目2至8中任一项的方法，其中步骤(c)包括(i)沉降；和/或(ii)离心；和/或(iii)过滤。
项目10. 项目1至3和5至9中任一项的方法，其中所述表达重组蛋白包含信号序列。
项目11. 项目10的方法，其中所述分泌重组蛋白的所述信号序列为多于90%被加工。
项目12. 项目10或11的方法，其中所述信号序列为细胞周质靶向信号序列。
项目13. 项目1至3和5至12中任一项的方法，其中所述重组蛋白分泌至所述培养基中。
项目14. 前述项目中任一项的方法，其中(a)的所述微生物细胞培养液中的细胞的1-50%已经经历自裂解。
项目15. 项目14的方法，其中通过电容评价自裂解。
项目16. 前述项目中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(b)中添加第一量的絮凝剂，评价粒径分布，且如果需要，添加第二量的絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。
项目17. 前述项目中任一项的方法，其中所述量的所述絮凝剂以收获物0.01-5体积%之间的量添加。
项目18. 前述项目中任一项的方法，其中所述量的所述絮凝剂以收获物0.01-2体积%之间的量添加。
项目19. 项目18的方法，其中所述絮凝剂为聚乙烯亚胺(PEI)或聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)。
项目20. 项目19的方法，其中所述PEI为高分子量PEI，例如MW 50kDa至100kDa。
项目21. 项目18的方法，其中所述絮凝剂为CaCl2。
项目22. 前述项目中任一项的方法，其中所述微生物细胞培养液为大肠杆菌细胞培养液。
项目23. 前述项目中任一项的方法，其中在步骤(b)中添加所述絮凝剂之后，5μm的大小分布中的颗粒%为约4%或更小；约3%或更小；约2.5%或更小；约2%或更小；约1.5%或更小；约1%或更小；约0.5%或更小；约0.25%或更小；约0.1%或更小；约0.05%或更小；约0.01%或更小；或约0%。
项目24. 前述项目中任一项的方法，其中5μm或更小体积中的颗粒的大小范围为：约4μm或更小；约3μm或更小；约2.5μm或更小；约2μm或更小；约1.5μm或更小；约1μm或更小；约0.5μm或更小。
项目25. 项目9至24中任一项的方法，其中所述离心为通过连续离心。
项目26. 项目9至24中任一项的方法，其中所述离心为通过分批离心。
项目27. 项目2至26中任一项的方法，其中步骤(c)期间剩余的固体%为约0%；约0.5%或更小；约1%或更小；约2%或更小；约3%或更小；约4%或更小；约5%或更小；约10%或更小；约15%或更小；或约20%或更小。
项目28. 项目2至27中任一项的方法，其中与无絮凝剂相比，在絮凝剂存在下步骤(c)期间的过滤器容量改善约200%；约300%或更多；约400%或更多；约500%或更多；约600%或更多；约700%或更多；约800%或更多；约900%或更多；约1000%或更多；或约2000%或更多。
项目29. 项目1至3和5至28中任一项的方法，其中所述重组蛋白为抗原结合蛋白。
项目30. 项目29的方法，其中所述抗原结合蛋白包含dAb(结构域抗体)。
项目31. 如项29的方法，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)肽-dAb融合体；
(b)dAb缀合物；
(c)dAb-dAb融合体；或
(d)裸dAb。
项目32. 项目29的方法，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)艾塞那肽4- AlbudAbTM (SEQ ID NO: 1)；
(b)具有C末端半胱氨酸(SEQ ID NO: 3)的AlbudAbTM；
(c) AlbudAbTM -TNFR1 VH dAb(SEQ ID NO: 5)；或
(d)VH dAb抗TNFR1(SEQ ID NO: 7或9)。
项目33. 项目1至3和5至28中任一项的方法，其中所述重组蛋白包含病毒蛋白、细菌毒素、细菌类毒素或癌症抗原。
项目34. 前述项目中任一项的方法，其中(a)中的所述收获物的固体含量为5-30%湿细胞重量(WCW)。
项目35. 前述项目中任一项的方法，其中所述微生物细胞培养液从发酵罐收获。
项目36. 项目35的方法，其中发酵罐体积为：
(i)约10,000升；约5,000升；约2,000升；约1,000升；约500升；约125升；约50升；约20升；约10升；约5升；或
(ii)5升与10,000升之间；10升与5,000升之间；20升与2,000升之间；50升与1,000升之间。
项目37. 修饰的大肠杆菌细胞收获物，其中：
(a)所述细胞表达细胞周质靶向重组蛋白；
(b)所述收获物包含0.01-2体积% PEI；且
(c)所述收获物的体积粒径分布为约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。
项目38. 项目37的修饰的收获物，其中所述收获物已经通过(i)机械或化学裂解或(ii)细胞周质提取进行处理。
项目39. 项目37或38的修饰的收获物，其中所述细胞的1-50%已经经历自裂解。
项目40. 项目39的修饰的收获物，其中通过电容评价自裂解。
项目41. 项目37至40中任一项的修饰的收获物，其中聚乙烯亚胺(PEI)为高分子量PEI，例如MW 50kD-100kDa。
项目42. 项目37至41中任一项的修饰的收获物，其中5μm的大小分布中的颗粒%为约4%或更小；约3%或更小；约2.5%或更小；约2%或更小；约1.5%或更小；约1%或更小；约0.5%或更小；约0.25%或更小；约0.1%或更小；约0.05%或更小；约0.01%或更小；或约0%。
项目43. 项目37至42中任一项的修饰的收获物，其中5μm或更小体积中的颗粒的大小范围为约4μm或更小；约3μm或更小；约2.5μm或更小；约2μm或更小；约1.5μm或更小；约1μm或更小；约0.5μm或更小。
项目44. 项目37至43中任一项的修饰的收获物，其中所述重组蛋白包含抗原结合蛋白。
项目45. 项目44的修饰的收获物，其中所述抗原结合蛋白包含dAb(结构域抗体)。
项目46. 项目44的修饰的收获物，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)肽-dAb融合体；
(b)dAb缀合物；
(c)dAb-dAb融合体；或
(d)裸dAb。
项目47. 项目44的修饰的收获物，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)艾塞那肽4- AlbudAbTM；
(b)具有C末端半胱氨酸的AlbudAbTM；
(c) AlbudAbTM -TNFR1 VH dAb；或
(d)VH dAb抗TNFR1。
项目48. 项目37至43中任一项的修饰的收获物，其中所述重组蛋白包含病毒蛋白、细菌毒素、细菌类毒素或癌症抗原。
项目49. 项目37至48中任一项的修饰的收获物，其中所述收获物的所述固体含量为5-30%湿细胞重量(WCW)。
项目50. 项目37至49中任一项的修饰的收获物，其中所述收获物体积为：
(i)约10,000升；约5,000升；约2,000升；约1,000升；约500升；约125升；约50升；约20升；约10升；约5升；或
(ii)5升与10,000升之间；10升与5,000升之间；20升与2,000升之间；50升与1,000升之间。
实施例
除非另有说明，否则所用的所有化学品和试剂都来自Sigma Aldrich。
絮凝剂聚乙烯亚胺(PEI)是由伯胺、仲胺和叔胺构成的阳离子聚合物((C2H5N)n ，MW=50,000-100,000Da)且制备为水中的10%或12.5% w/v溶液且在使用之前老化至少30分钟。
絮凝剂聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)是以低分子量版本(100,000-200,000Da)或高分子量版本(400,000-500,000Da)使用的高电荷密度阳离子聚合物。
实施例中使用四种样品重组蛋白且其描述于下表1中。
表 1
据信本文利用DOM101(SEQ ID NO: 7)实施的工作直接等效于针对丙氨酸延伸的DOM101(SEQ ID NO: 9)预测的结果。
在1L发酵容器中遵循标准程序利用复杂培养基使用大肠杆菌的进料分批发酵生产蛋白。随后在诱导后8小时与50小时之间在适当条件下收获发酵物。
使用配备有小体积分散单元的Malvern Mastersize Instrument(Malvern instruments, Worcestershire, UK)根据制造商建议的方案测定粒径分布。折射率(RI)在1.4至1.6范围内。吸附系数在0至0.001范围内。
实施例 1
本研究中使用三种蛋白。Dom100、Dat06和Dat01均是包含如表1中所述结构域抗体(dAb)的重组蛋白。
向发酵收获物中添加预制备10% PEI溶液以产生用于研究的期望浓度。随后在粒径分布测量之前，将其在室温下混合1小时。
图1中给出DOM100收获物和添加0.005%、0.05%、0.1%、0.5%和2% PEI的粒径分布。可看到收获物(未添加絮凝剂)包含直径≤5μm的以体积计的大部分颗粒。然而，重要的是，应注意，单独研究(本文未显示)指示收获物的粒径分布的变化可相当大，具有更大或更小程度的以体积计直径≤5μm颗粒。图1显示通过增加PEI的量，分布中≤5μm颗粒的存在减少。在0.5% PEI下，已移除直径≤5μm的大部分颗粒。
在添加PEI后表达DOM100的收获物的粒径分布的该位移的更详细说明以及表达Dat06或Dat01的收获物的数据一起示于表2中。表2没有聚焦于较大颗粒/聚集物(其经常是利用絮凝剂的研究的焦点)，而是聚焦于≤5μm的颗粒占收获物或絮凝收获物的总体积的百分比。
表 2 ：表达 DOM100 、 Dat06 或 Dat01 的收获物的随递增的 PEI 水平的直径≤ 5µm 的颗粒的体积 %
对于DOM100收获物，在添加PEI后，≤5μm颗粒的比例降低。具体而言，实现约5%或更少颗粒≤5μm的体积粒径分布的PEI浓度为0.1-2.0%(所测试上限)之间。最佳甜蜜点(sweet spot)似乎在0.2%-2.0%(小于2体积%)或0.3-0.5%(小于1.5体积%)的浓度。
对于Dat01收获物，实现约5%或更少≤5μm颗粒的体积粒径分布的PEI浓度为0.1%-0.8%(所测试上限)之间。最佳甜蜜点似乎在0.1-0.2%(小于1.6体积%)的浓度。
对于Dat06收获物，实现约5%或更少≤5μm颗粒的体积粒径分布的PEI浓度为0.1%-0.5%之间。应注意，对于该收获物，"约5%"等于6.15%和5.35%。假定Dat06收获物粒径分布在范围0.1-0.5% PEI内可降低至低于5%，且这显示于图2中。表2中所述针对Dat06收获物的数据(除了0% PEI(100%)和0.01% PEI(57%))绘制于图2中，外推线以证实以下假设：体积%分布应在0.1%-0.5% PEI的实验衍生点之间下降低于5%的≤5μm颗粒。因此，对于该Dat06收获物，预测最佳甜蜜点会是0.15-0.4% PEI。分析两种其它Dat06收获物：收获物A含有金属螯合剂(EDTA)，且收获物B在发酵期间经控制以具有低细胞质量。在未添加PEI情况下，对于收获物A，直径≤5μm的颗粒占总体积的体积%为97.09%；且对于收获物B为93.78%。对于收获物A，0.1%-0.4%的PEI浓度下≤5μm颗粒的这些百分比降低至约≤5%(1.79-5.62%≤5μm颗粒)；且对于收获物B，0.1%-0.5% PEI(0.64%-1.73%≤5μm颗粒)。没有进一步分析这些。
因此，可看到，增加絮凝剂的量并不直接对应≤5μm范围内的颗粒的降低百分比。可鉴定絮凝剂的最佳量，且该最佳量具有如下文所示改善的效应。
实施例 2
本研究中使用四种实施例重组蛋白。DOM101描述于表1中。表达DOM101的收获物的粒径分布如上述计算。
在本研究中研究剪切的影响，因为通常以实验室规模呈现的剪切条件实质上小于以大制造规模呈现的那些。因此，在以实验室规模实施的早期工艺研究中经常忽略或低估剪切的影响。
研究两种不同水平的剪切：0.04×106 W kg-1的"低剪切"等效最大功耗εmax ，和0.53×106 W kg-1的"高剪切"等效最大功耗εmax 。
将适当样品在旋转盘装置(50mm内直径和10mm高度的20mL不锈钢腔，装配有40mm直径和1mm厚度的不锈钢旋转盘，由定制设计电源组(UCL机械工厂，UCL，London，还参见McCoy R, Hoare M, Ward S. 2009. Ultra scale-down studies of the effect of shear on cell quality; Processing of a human cell line for cancer vaccine therapy. Biotechnology Progress 25(5):1448-1458)控制盘速度(0-20,000rpm))中暴露于剪切20s。盘速度与使用计算流体动力学衍生的关联的最大能量耗散速率有关(对于所涉及方法，例如，参见Boychyn M, Doyle W, Bulmer M, More J, Hoare M. 2000. Laboratory scaledown of protein purification processes involving fractional precipitation and centrifugal recovery, Biotechnology and Bioengineering 69:1-10，现在重新定义且提炼成经验关系ε=(1.7 x 10^-3) (N^3.71)，其中ε具有W kg-1的单位且N是速度(转.sec-1)，100<N<200；和Chatel, A., Kumpalume, P. and Hoare, M. (2013), Ultra scale-down characterization of the impact of conditioning methods for harvested cell broths on clarification by continuous centrifugation - Recovery of domain antibodies from rec E. coli. Biotechnol. Bioeng. doi: 10.1002/bit.25164)。
收获物(空心圆)和暴露于高剪切的收获物(闭合圆)的粒径分布提供于图3中。大小分布表示为(a)对数大小标度上的总体积粒径分布，和分别于插图(b)、(c)和(d)中强调峰1、2和3的粒径分布。收获物和剪切材料的相对体积分数φv为0.11。图的vF和d和相对放大倍数M的轴标度于插图(b)、(c)和(d)中给出。收获物的峰1、2和3的体积比为2：1：97且剪切收获物的体积比为8：4：88。对于三种表达实施例1的收获物的重组蛋白，所观察粒径分布不同，其中大于5μm的较大颗粒的比例较大。如上文所讨论，单独研究(本文未显示)指示收获物的大小分布的变化相当大，具有更大或更小程度的微细颗粒形成。
下表3显示上述每一样品中≤5μm的颗粒占收获物的总体积的百分比。如在增加水平的与生物处理相关的剪切后所见，≤5μm范围内的颗粒的发生率增加，使得大于5体积%含有≤5μm的颗粒。这会增加对后续澄清和纯化步骤的负荷。
絮凝剂的添加
使上述DOM101收获物经受如实施例1中所述PEI处理至0.5% w/v的最终浓度。关于DOM101收获物的先前工作(本文未显示)已经显示0.5%是PEI的最佳量。随后使PEI处理的收获物经受上述剪切。
PEI絮凝收获物(闭合圆)和以低剪切(十字形)和高剪切(空心圆)剪切的PEI絮凝收获物的粒径分布提供于图4中。大小分布表示为(a)对数大小标度上的总体积粒径分布，和分别于插入物(b)、(c)和(d)中强调峰1、1和2的粒径分布。峰1和2的体积比是(PEI絮凝收获物)50：50，(PEI絮凝低剪切)87：13，(PEI絮凝高剪切)93：7。
如可见，在与图3中的无PEI分布相比时，PEI的存在增加最小粒径峰至较大直径点的位移。然而，这又对≤5μm颗粒的体积具有最小影响。
下表3显示上述每一样品中≤5μm的颗粒占收获物的总体积的百分比。在0.5% PEI存在下约5%或更少≤5μm颗粒的体积粒径分布在低和高剪切存在下保持相对恒定。然而，在未添加PEI的情况下，在高剪切存在下，≤5μm的颗粒的百分比使≤5μm的总体积进一步增加6%。该数据表明，在剪切存在下，0.5% PEI产生更有效且稳健的澄清步骤。
表 3 ：表达 DOM100 的收获物在增加剪切下直径≤ 5µm 的颗粒的体积 %
实施例 3
如实施例1中所述用PEI处理DOM100收获物至期望浓度。使用Carr Powerfuge以0.5升/分钟(lpm)和15325转/分钟(rpm)的速度使样品经受连续离心。随后在离心之前(进料浊度)和在离心之后(离心液浊度)使用标准条件利用Hach浊度计(Colorado, US)测量样品的浊度。
图5显示在离心之前和之后增加添加至收获物的PEI的浓度对浊度的影响。离心之前的收获物的浊度(进料浊度)显示随PEI的添加而稳定增加，这与絮凝物的形成一致。离心液浊度显示随PEI的水平增加而降低，这与更有效离心过程步骤一致。在右侧轴上测量离心液浊度，且在左侧轴上绘制进料浊度，这是因为离心液浊度比进料浊度低数个数量级。离心后的该浊度改善与如表2中所示于0.1%-2.0%的PEI浓度下针对DOM100观察到的5%或更低的≤5μm颗粒一致。具体而言，在本研究中，离心液浊度改善始于0.1% PEI，且改善直至0.5% PEI的终点，最佳在0.4%。这与表2中所示针对DOM100收获物0.3-0.5%的PEI浓度下的最佳甜蜜点一致。
实施例 4
在有和无PEI的情况下，如实施例2中制备DOM101收获物。随后使用由以下先前描述的方法使样品经受超比例缩减离心方法：Tait AS, Aucamp JP, Bugeon A, Hoare M. 2009. Ultra scale-down prediction using microwell technology of the industrial scale clarification characteristics by centrifugation of mammalian cell broths. Biotechnology and Bioengineering 104(2):321-331。通过测定于波长600nm的吸光率下光学密度的相对减少计算剩余的固体百分比。
图6显示DOM101收获物(a)和0.5% PEI存在下DOM101收获物(b)的剩余固体%。每一图中还表示未经受剪切(闭合圆)、经受低剪切(十字形)和高剪切(空心圆)的样品(剪切如上文实施例2中所述)。
数据表示为平均值±s.d.；线是使用三阶多项式的最佳最小平方拟合。对于图(a)，给出单一关联，因为与增加剪切速率不存在一致趋势。在所有情况下，经由提供对照的原点拟合关联。
如图6中可见，0.5% PEI的存在显著降低离心后剩余的固体% -无PEI添加情况下剩余的固体百分比存在至多10-15%，而在0.5% PEI情况下，这降低至剩余0.8%固体。
实施例 5
在一定范围PEI浓度下如实施例1中制备DOM100收获物。随后使该物质如实施例3中所述穿过离心机，且随后穿过包含主要和次要过滤器的过滤器组。计算过加压之前主要过滤器的最大容量(也称作Vmax)(L/m2)且针对所添加PEI%绘图。如图7中可见，主要过滤器容量实质上随PEI的浓度增加而上升，对应于在絮凝剂添加后收获物中≤5μm颗粒的存在减少。可观察到由于添加PEI而产生的过滤器容量改善始于0.1% PEI且在0.4%达到峰值，在该研究中0.5%的终点处仍观察到改善。最佳值似乎在0.4% PEI。这与实施例3和表2一起显示，利用实现在≤5μm范围内总颗粒5%或更低的絮凝剂的水平的DOM100收获物的澄清显著改善。该改善与如表2中所示在0.1%-2.0%的PEI浓度下针对DOM100观察到的5%或更低的≤5μm颗粒，且特别是表2中所示0.3-0.5%的PEI浓度下针对DOM100收获物的最佳甜蜜点一致。
实施例 6
如下文所述处理Dat06和DOM100收获物。通过离心澄清对照收获物且利用来自Invitrogen的Quant-iT dsDNA Broad Range测定试剂盒根据制造商的说明书测量DNA水平。使用Gaulin型均质化在10,000psi的目标压力下均质化所有其它收获物，通过2次。这些均质化收获物都用增加浓度的PEI(对于Dat06和DOM100收获物)或高或低MW PDADMAC(对于Dat06收获物)处理且随后通过离心澄清。如上文针对对照收获物所述测量DNA水平。
可将DNA视为细胞裂解的指示剂-在完整细胞存在下，上清液中应存在非常少。DNA的存在本身可能影响澄清，因为其增加上清液的粘度且可促使有效离心澄清中的损失和降低过滤器通量速率。
图8显示对照和用三种类型的絮凝剂处理的均质化样品的DNA浓度。对照、非均质化样品中存在大量DNA(十字)表明已发生显著细胞裂解。可比较DOM100对照(灰色十字)与具有0% PEI的DOM100均质化收获物(黑线)，这指示约50%细胞已经经历自裂解。这可能增加对澄清步骤的负荷。如可见，絮凝剂的存在明显降低澄清收获物中的DNA浓度。具体而言，在PEI存在下DOM100收获物的DNA浓度降低对应于降低浊度(实施例3)和改善的主要过滤器组(实施例5)，其与如表2中所示≤5μm范围内的5%或更少颗粒，且特别是0.3-0.5%的PEI浓度下的最佳甜蜜点相关。
本实施例还显示两种替代絮凝剂(高或低MW PDADMAC)的结果与PEI的结果相当。
实施例 7
在0.5% PEI存在和不存在下如实施例4中离心DOM101收获物以产生离心液。随后使用Tecan Evo II(Tecan, Theale, UK)上的真空驱动的小规模系统测量在阻断之前在含有Pall Seitz-EKS 60D 0.2μm过滤器(具有标称孔径0.05-0.2μm的深度过滤器)的小规模过滤器上实现的滤液的体积且针对两个样品的时间绘图。
图9显示在0.5% PEI存在下可获得的滤液体积几乎是在无PEI情况下可获得的3倍-在0% PEI情况下，在200μl滤液体积下在30s内实现最大值，且在0.5% PEI情况下，这在600μl下在110s内仍缓慢升高。这对DOM101收获物的滤过性具有显著影响且具有随后减少此类工艺成本的效果。
实施例 8
在诱导后的不同时间收获DOM101，且一半样品用0.5% PEI处理。随后如实施例4中离心PEI和无PEI处理的两种样品且随后使其经历如实施例7中的过滤研究。随后计算两组样品的Vmax且针对诱导时间绘图。Vmax测量是样品的滤过性的直接测量且可用于基于所接收数据放大过滤工艺。
如图10中可见，工艺中0.5% PEI絮凝步骤的存在通过将最大可获得滤液增加250%(诱导后0小时)、从而在发酵结束时(诱导后45小时)增加至2500%而显著改善滤过性。可观察到，在诱导后约25小时，在发酵结束时，离心液的滤过性在无PEI处理的样品中显著降低至几乎零。用PEI处理的样品的Vmax不仅保持恒定较高，而且较不易受诱导后时间影响，显示0.5% PEI絮凝步骤为澄清过程增加相当大的稳健性。
25小时的诱导时间后的滤过性降低可与发酵细胞培养液中观察到的自裂解的量相关，该量可以是约50%(参见下文实施例6和实施例9)。
实施例 9
还可使用电容探针(Aber Instruments Ltd, Aberystwyth, UK)间接测量自裂解，该探针测量从发酵期间记录的最大测量值至在计算最大测量值后的troph(最低点，其通常与收获点相同)的电容减少百分比。表4显示通过电容测量的许多DOM101发酵复制品中观察的细胞裂解的量。
表 4 ：如通过 DOM101 收获物中的电容测定的细胞裂解的变化
DOM101发酵 收获时观察的细胞裂解的比例(%)
A 30
B 32
C 41
D 24
E 19
F 20
实施例 10
图11显示对于表达DOM101的冻融(解冻的)收获物的剪切的性质和影响。呈现解冻收获物(空心圆)和如实施例2中经受εmax= 0.53×106 W kg-1下的高剪切的解冻收获物(闭合圆)的粒径分布(如实施例1中计算)。解冻收获物和经受高剪切的解冻收获物的相对固体体积分数φv为0.11w/v。两种材料的峰1、2、3、4的体积比为5：7：4：84。
如可见，解冻材料的分布非常类似。表5显示≤5μm直径的样品颗粒占总体积的体积%，其显示对于未剪切为13.2%且对于经剪切为12.3%。在与显示剪切对未预处理的收获物的影响的图3相比时，似乎冻融工艺对在高剪切存在下研究的样品的粒径分布具有稳定效应。这对于实验材料是令人感兴趣的观察结果，然而，在生物处理中，该材料较不可能作为澄清的部分被冷冻。
絮凝剂的添加
图12显示0.5% PEI絮凝对表达DOM101的冻融收获物的影响。提供解冻收获物(闭合圆)和如实施例2中经受εmax= 0.53×106 W kg-1下的高剪切的PEI絮凝解冻收获物(空心圆)的粒径分布。解冻收获物的相对固体体积分数φv为0.11w/v且PEI絮凝物质为0.15w/v(针对利用PEI溶液的稀释因子校正所引用的φv值)。峰1和2的体积比为~ 20 : 80。
如从表5可见，在PEI从8.08%增加至0.6%后，≤5μm颗粒的百分比降低。
实施例 11
图13显示低和高剪切对PEI絮凝的表达DOM101的冻融收获物的影响。呈现PEI絮凝解冻收获物(闭合圆)和如实施例2中经受εmax 0.04×106 W kg-1下的低剪切(十字形)和εmax 0.53×106 W kg-1下的高剪切(空心圆)的PEI絮凝解冻收获物的粒径分布(如实施例1中测量)。具有低剪切的PEI絮凝解冻收获物的相对固体体积分数φv为0.13w/v且具有高剪切的PEI絮凝解冻收获物为0.12w/v(针对利用PEI溶液的稀释因子校正所引用的φv值)。
如从表5可见，剪切对PEI絮凝解冻收获物的影响是减小存在的颗粒的大小，但PEI的存在维持大部分颗粒高于≤5μm范围(分布%从0.6%移位至2.01%(低剪切)或至1.84%(高剪切))。这显示，即使在递增的剪切水平存在下，PEI澄清步骤也是稳健步骤。
实施例 12
使表达DOM101的冻融收获物经受剪切或使用在500巴和4℃下操作的高压均质器(Gaulin Micron Lab40, Lubeck, Germany)均质化，通过2次。随后如实施例1中测量来测定样品的粒径分布。
图14显示均质化对粒径分布的影响。呈现剪切的解冻收获物(闭合圆)和均质化收获物(空心圆)的粒径分布。解冻收获物的相对固体体积分数φv为0.11w/v且均质化收获物为0.078w/v。
如从图14和表5中的分布可见，均质化对解冻收获物的粒径分布具有显著影响，≤5μm范围内的颗粒的数目升高至94.73%。均质化样品中普遍存在非常小颗粒可对生物处理具有极端有害的影响。
表 5 ：在实施例 10 、 11 和 12 中所述的不同条件下直径≤ 5µm 的颗粒的体积 %
样品 ≤5µm直径的颗粒占总体积的体积%
(图11) DOM101解冻收获物 13.22
(图11) DOM101 剪切解冻收获物 12.32
(图12) DOM101解冻收获物 8.08
(图12) DOM101剪切解冻收获物，0.5% PEI处理 0.6
(图13) DOM101解冻收获物，0.5% PEI处理 0.6
(图13) DOM101解冻收获物，0.5% PEI处理，低剪切 2.01
(图13) DOM101解冻收获物，0.5% PEI处理，高剪切 1.84
(图14) DOM101剪切解冻收获物 13.22
(图14) DOM101 解冻均质化收获物 94.73
实施例 13
使用Gaulin型均质化在10,000psi的目标压力下均质化Dat01收获物，通过2次。用递增浓度的PEI处理均质化收获物。下表6显示≤5μm范围内的颗粒的大的百分比可通过添加0.054%-0.99%或0.374%-0.65% PEI(所测试上限)降低至小于5%。因此，均质化的预处理调节步骤也可受益于适当量的PEI添加以产生更有效的澄清过程。
表 6 ：蛋白均质物的递增 PEI 水平下直径在 5µm 下的颗粒的体积 %
PEI 浓度 % w/v ≤5µm直径的Dat01均质物颗粒占总体积的体积%
0 81.78
0.054 3.27
0.99 4.53
0.146 5.49
0.194 6.77
0.244 6.98
0.374 2.82
0.509 2.44
0.65 2.14
实施例 14
使用常规显微镜捕获在添加0.5% PEI之前(a)和之后(b)和经受上述低剪切(c)或高剪切(d)的冻融DOM101收获物图像，图15中所示。
如从图15可见，在添加PEI后形成大量无规则大尺寸的絮凝物(b)。这些随后变得稍微较小且在经受即使低剪切(c)后也变得更小且在高剪切(d)后变得更小。高剪切后存在的絮凝物大于未处理图像(a)中观察到的细胞。
实施例 15
以与实施例4中实施的相同方式使冻融DOM101收获物经受超比例缩减离心研究。使解冻收获物样品经受0.5% PEI絮凝(c)。还使用在500巴和4℃下操作的高压均质器(Gaulin Micron Lab40, Lubeck, Germany)使解冻收获物样品经受均质化，通过2次(a)。将不同悬浮液均暴露于以下条件：无剪切(实心圆)；低剪切(空心圆)；高剪切(空心三角形)(如上文所述)。
图16显示(a)均质化解冻收获物、(b)解冻收获物和(c)PEI絮凝解冻收获物剩余的固体百分比。数据表示为平均值±s.d.；线是使用三阶多项式的最佳最小平方拟合。对于图(a)和(b)，给出单一关联，这是因为与增加剪切速率不存在一致趋势。在所有情况下，经由提供对照的原点拟合关联。
如从图可见，解冻样品(b)显示剩余至多16%固体且均质化样品(a)显示剩余至多60%固体-这些都不适于进一步处理，这是因为剩余的固体%过高-通常期望量为小于1%。在添加0.5% PEI情况下充分地实现小于1%的该目标，这显示减少至剩余小于0.2%固体。
实施例 16
在来自DOM101收获物的DOM101的产率或上述样品中的任一者的单体/二聚物的概况中未观察到明显差异(本文未显示数据)。假定这也适于所述其它重组蛋白。
实施例 17
向发酵收获物(Dat06)中添加预制备1.5% PEI溶液以产生PEI的期望浓度范围(0-0.6%)。用200mM乙酸或1M NaOH调节溶液的pH以实现期望pH范围(4至9)。典型细胞培养液的pH为pH 6-7之间。在室温混合约5至10分钟后，使用分批离心机以3400rcf持续20分钟从上清液分离每一PEI浓度和pH条件的絮凝微粒以完成絮凝剂沉降。在600nm波长下测量所得上清液浊度以评价溶液澄清度，结果示于图17(A)中。通过在3400rcf的离心力下持续90秒穿过0.2μm过滤器的直接过滤性能来测量处理能力，结果示于图17(B)中。尽管未直接测量这些絮凝条件的粒径，但图2、5和7中已确立澄清度和过滤性能与粒径分布之间的关联。使用具有0.2μm过滤器和吸光度读数的板形式可用作高通量形式以得到设计空间的理解。
除絮凝剂浓度外，pH也可影响大肠杆菌溶液的絮凝行为。本实施例显示pH与絮凝剂浓度的相互作用对溶液的澄清度具有影响。在>0.4% PEI的絮凝剂浓度下，溶液的浊度较低，这与溶液pH无关。低于0.3% PEI的絮凝剂浓度，低于pH 7.0，溶液澄清度较大(即，低浊度)。本研究的结果与图1中所示更详细粒径分析一致；表明pH与PEI浓度的组合可用于微调大小低于5μm的颗粒的数目。
实施例 18
如实施例1中概述用0.1% PEI和0.4% PEI处理Dat06的收获物样品。在图18中，出于比较原因，使用术语"低絮凝剂"表示0.1% PEI，且使用术语"高絮凝剂"表示0.4% PEI。如前述实施例中测定"0"导电率样品的两种PEI浓度的粒径。对于所述导电率样品，稀释剂从纯水变为不同离子强度的NaCl溶液。平均颗粒直径(A)和≤5μm的颗粒体积%(B)的结果显示于图18中。所有样品都取自相同发酵培养液，但置于>1：100的稀释水平下的不同盐溶液中。
置于水基质中的0.1% PEI处理的样品的平均颗粒直径远大于用0.4%的较高浓度的PEI处理的样品。在高盐(NaCl)浓度下，不同絮凝剂浓度的平均颗粒直径变得更类似。对于低导电率(和随后)离子强度的水平，对于"低絮凝剂浓度"0.1% PEI，平均颗粒直径高于"高絮凝剂浓度"0.4% PEI下。在较高浓度的盐(高导电率和离子强度)，对于不同絮凝剂浓度水平，平均颗粒直径的变化小得多。这允许基于盐浓度以及絮凝剂浓度微调平均颗粒直径。图18A显示该现象的实例，其中对于0.1%絮凝剂和低导电率，平均颗粒直径达到大于60μm，且在导电率大于100mS/cm时，平均粒径为20-30μm，平均颗粒直径对高离子强度下的絮凝剂浓度远不那么敏感。
对于"低絮凝剂浓度"0.1% PEI，大小≤5μm的颗粒的体积在高导电率下增加，而大小≤5μm的颗粒在宽范围导电率内对于"高絮凝剂浓度"0.4% PEI保持相对类似。对于Dat06在"高絮凝剂浓度"0.4% PEI下，关于平均颗粒直径和大小≤5μm的颗粒的观察支持更稳定絮凝物。PEI的两个浓度(0.1%和0.4%)实现在0导电率下≤5μm的"约5%"群体，但PEI的较高浓度(0.4%)在递增导电率内实现≤5μm群体的更稳定%。
实施例 19
利用4.3% CaCl2、0.1% PEI和0.2% PEI通过添加每一组分并混合约1小时使DOM100收获物絮凝；类似于实施例1中遵循的程序。随后通过静态光散射(Malvern Mastersizer)测量发酵培养液的平均粒径。将样品分成两个单独等份样品；将一份分批离心且使用管式离心机(连续离心机)使另一份离心；二者具有类似总加速力。随后使用深度/膜过滤器组以恒定流速过滤来自离心机样品的所得上清液，以移除剩余细胞碎片。通过用在达到25psi回压之前处理的总体积除以主要深度过滤器的前面面积测量过滤器容量。所有情况下的大部分颗粒的大小>5μm。在图19A中评价平均颗粒直径，且在图19B中评价≤5μm的颗粒体积%。
具有如通过静态光散射测量的较小平均粒径的样品具有分批离心样品的较低主要深度过滤器容量。该关联表明，在絮凝、随后分批离心期间形成的较大平均大小离子将改善随后深度过滤器的过滤器容量。经由Carr管式离心机处理的样品观察到相反结果。如果比较≤5μm大小限制的颗粒的数目与分批离心机性能，则观察到性能相关。
实施例 20
如实施例1中所述处理Dat06和DOM100收获物。比较添加0.4% PEI的样品与未用絮凝剂处理的样品。随后通过离心实施澄清且使用定制分析型免疫测定测量HCP水平。
可认为HCP物质的高水平为细胞裂解的指示。大的增加可指示大量细胞裂解，这可引起粘度增加和澄清困难。高HCP水平也可引起额外下游纯化挑战。
图20显示有和无0.4% PEI处理的DOM100和Dat06样品的HCP浓度。尽管PEI能够移除Dat06中的大量宿主细胞蛋白群体，但DOM100的情况并非如此。结果例举宿主细胞蛋白群体的复杂性质和可在产物间预计的差异。PEI能够移除基本水平的HCP和/或絮凝剂比其它类型能够更有效地移除特定类型的宿主细胞蛋白。
序列表

Claims (20)

1.生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括：
(a) 收获表达所述重组蛋白的微生物细胞培养液；和
(b) 添加一定量絮凝剂以实现如下的体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。
2.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(c)澄清所述絮凝收获物。
3.权利要求2的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(d)从所述澄清絮凝收获物纯化所述重组蛋白。
4.澄清微生物收获物的方法，其中所述方法包括：
(a)收获微生物细胞培养液；
(b)添加一定量絮凝剂以实现如下的体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内；和
(c)澄清所述絮凝收获物。
5.权利要求4的方法，其中所述微生物细胞培养液表达重组蛋白。
6.权利要求2至5中任一项的方法，其中步骤(c)包括(i)沉降；和/或(ii)离心；和/或(iii)过滤。
7.权利要求1至3、5和6中任一项的方法，其中表达的重组蛋白包含信号序列。
8.权利要求7的方法，其中所述信号序列是细胞周质靶向信号序列。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述量的所述絮凝剂以所述收获物0.01-5体积%之间的量添加。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述量的所述絮凝剂以所述收获物0.01-2体积%之间的量添加。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述絮凝剂是聚乙烯亚胺(PEI)或聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)。
12.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述絮凝剂是CaCl2。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物细胞培养液是大肠杆菌细胞培养液。
14.权利要求1至3、5至13中任一项的方法，其中所述重组蛋白是抗原结合蛋白。
15.权利要求14的方法，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)肽-dAb融合体；(b)dAb缀合物；(c)dAb-dAb融合体；或(d)裸dAb。
16.权利要求14的方法，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)艾塞那肽(Exendin)4- AlbudAbTM (SEQ ID NO: 1)；(b)具有C末端半胱氨酸的AlbudAbTM (SEQ ID NO: 3)；(c) AlbudAbTM -TNFR1 VH dAb(SEQ ID NO: 5)；或(d)VH dAb抗TNFR1(SEQ ID NO: 7或9)。
17.修饰的大肠杆菌细胞收获物，其中：
(d)所述细胞表达细胞周质靶向重组蛋白；
(e)所述收获物包含0.01-2体积% PEI；且
(f)所述收获物的体积粒径分布为约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。
18.权利要求17的修饰的收获物，其中所述重组蛋白包含抗原结合蛋白。
19.权利要求18的修饰的收获物，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)肽-dAb融合体；(b)dAb缀合物；(c)dAb-dAb融合体；或(d)裸dAb。
20.权利要求18的修饰的收获物，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)艾塞那肽4- AlbudAbTM；(b)具有C末端半胱氨酸的AlbudAbTM；(c) AlbudAbTM -TNFR1 VH dAb；或(d)VH dAb抗TNFR1。
CN201480006129.1A 2013-01-31 2014-01-29 生产蛋白的方法 Pending CN104936973A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361758870P 2013-01-31 2013-01-31
US61/758870 2013-01-31
US201361899437P 2013-11-04 2013-11-04
US61/899437 2013-11-04
PCT/EP2014/051705 WO2014118220A1 (en) 2013-01-31 2014-01-29 Method of producing a protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104936973A true CN104936973A (zh) 2015-09-23

Family

ID=50033522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480006129.1A Pending CN104936973A (zh) 2013-01-31 2014-01-29 生产蛋白的方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20150368292A1 (zh)
EP (1) EP2951192A1 (zh)
JP (1) JP2016504918A (zh)
KR (1) KR20150113105A (zh)
CN (1) CN104936973A (zh)
AU (1) AU2014211438B2 (zh)
BR (1) BR112015017994A2 (zh)
CA (1) CA2897345A1 (zh)
IL (1) IL239737A0 (zh)
RU (1) RU2015128651A (zh)
SG (1) SG11201505388QA (zh)
TW (1) TW201514193A (zh)
WO (1) WO2014118220A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105462943A (zh) * 2015-12-30 2016-04-06 海口奇力制药股份有限公司 无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201404991YA (en) 2012-02-23 2014-09-26 Stage Cell Therapeutics Gmbh Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials
SG11201708751RA (en) * 2015-05-15 2017-11-29 Glaxo Group Ltd Method of producing a recombinant protein
MA45489A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
MY190347A (en) * 2016-08-10 2022-04-15 Spiber Inc Production method for insoluble recombinant protein aggregate
WO2018197949A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Juno Therapeutics Gmbh Oligomeric particle reagents and methods of use thereof
SG11202101113YA (en) * 2018-08-30 2021-04-29 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Methods of detecting nucleic acid
JP7239509B6 (ja) * 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
CN110577566B (zh) * 2019-08-09 2021-05-04 北京首朗生物科技有限公司 一种梭菌菌体蛋白的制备方法
MX2023003276A (es) 2020-09-22 2023-05-03 Basf Se Método para recuperar una proteína de un caldo de fermentación que comprende un alto grado de células lisadas.
CN114574457B (zh) * 2022-01-25 2024-07-23 华东理工大学 一种快速分离纯化蛋白质的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1061217A (zh) * 1991-06-18 1992-05-20 华东化工学院 从发酵液中提取l-赖氨酸的方法
CN101665778A (zh) * 2009-09-25 2010-03-10 浙江大学 黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌及其在结冷胶生产中的应用
US20110184154A1 (en) * 2008-10-17 2011-07-28 Percivia Llc Cell broth clarification and host cell protein removal

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA012622B1 (ru) 2004-06-01 2009-10-30 Домэнтис Лимитед Биспецифичные гибридные антитела с увеличенным периодом полувыведения из сыворотки
GB0602173D0 (en) 2006-02-03 2006-03-15 Avecia Ltd Expression system
EA200901494A1 (ru) * 2007-06-06 2010-06-30 Домантис Лимитед Способы селекции протеазоустойчивых полипептидов
CN104650235A (zh) 2007-11-30 2015-05-27 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体
EP2411054A2 (en) * 2009-03-27 2012-02-01 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates
WO2011008814A2 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 Immune Tolerance Institute, Inc., A California Not-For-Profit Corporation Multiplexed measurement of exogenous and endogenous dna
MX2012003939A (es) * 2009-09-30 2012-07-30 Glaxo Group Ltd Fusiones y conjugados de farmaco.
MX2012005024A (es) * 2009-10-27 2012-09-07 Glaxo Group Ltd Polipeptidos anti-tnfr1 estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1061217A (zh) * 1991-06-18 1992-05-20 华东化工学院 从发酵液中提取l-赖氨酸的方法
US20110184154A1 (en) * 2008-10-17 2011-07-28 Percivia Llc Cell broth clarification and host cell protein removal
CN101665778A (zh) * 2009-09-25 2010-03-10 浙江大学 黄色素生成缺陷鞘脂单胞菌及其在结冷胶生产中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MILBURN P,: "Selective flocculation of nucleic acids, lipids, and colloidal particles from a yeast cell homogenate by polyethyleneimine, and its scale-up.", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *
SALT D E,: "Selective flocculation of cellular contaminants from soluble proteins using polyethyleneimine: A study of several organisms and polymer molecular weights.", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *
WANG S,: "Fouling of microfiltration membranes by organic polymer coagulants and flocculants: Controlling factors and mechanisms", 《WATER RESEARCH》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105462943A (zh) * 2015-12-30 2016-04-06 海口奇力制药股份有限公司 无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20150368292A1 (en) 2015-12-24
IL239737A0 (en) 2015-08-31
BR112015017994A2 (pt) 2017-07-11
AU2014211438B2 (en) 2017-02-02
AU2014211438A1 (en) 2015-08-20
CA2897345A1 (en) 2014-08-07
EP2951192A1 (en) 2015-12-09
SG11201505388QA (en) 2015-08-28
JP2016504918A (ja) 2016-02-18
TW201514193A (zh) 2015-04-16
WO2014118220A1 (en) 2014-08-07
RU2015128651A (ru) 2017-03-06
KR20150113105A (ko) 2015-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104936973A (zh) 生产蛋白的方法
KR101944121B1 (ko) 단백질의 정제 방법
EP1814912B2 (en) Process for obtaining antibodies
Chatel et al. Ultra scale‐down characterization of the impact of conditioning methods for harvested cell broths on clarification by continuous centrifugation—Recovery of domain antibodies from rec E. coli
WO2019104860A1 (zh) 抗PD-1的纳米抗体PD-1/Nb52及其制备方法与应用
CN106188297A (zh) 抗CTLA‑4的纳米抗体Nb91及其制备方法与应用
Voulgaris et al. Enhancing the selective extracellular location of a recombinant E. coli domain antibody by management of fermentation conditions
Yuan et al. Bioproduced proteins on demand (Bio-POD) in hydrogels using Pichia pastoris
Grage et al. Recombinant protein production by in vivo polymer inclusion display
CN106046164A (zh) 抗CTLA‑4的纳米抗体Nb36及其制备方法与应用
Petrus et al. A microbial expression system for high-level production of scFv HIV-neutralizing antibody fragments in Escherichia coli
Pleckaityte et al. Production in yeast of pseudotype virus-like particles harboring functionally active antibody fragments neutralizing the cytolytic activity of vaginolysin
TW201805298A (zh) 製造重組蛋白質之方法
US11667887B2 (en) Method of producing a recombinant protein
Rosini et al. Optimized rapid production of recombinant secreted proteins in CHO cells grown in suspension: The case of RBD
Schoonooghe et al. Production of antibody derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
CN116640225B (zh) 一种鲎凝血因子组合、反应体系、试剂盒及其应用
CN115925805B (zh) 一种人质膜膜泡关联蛋白pv-1融合蛋白及其制备方法
WO2017113181A1 (zh) IgG杂合型抗TNFα和IL-17A双特异性抗体
Yang et al. High human GLUT1, GLUT2, and GLUT3 expression in Schizosaccharomyces pombe
CN115246882A (zh) 一种抗pd-1鲨鱼单域抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用
US20210246497A1 (en) Methods of detecting nucleic acid
Pedersen et al. Purification and functional characterization of nine human Aquaporins produced in Saccharomyces cerevisiae for the purpose of biophysical characterization
Salte Rapid evaluation of options for the primary recovery of antibody fragments expressed in high cell density cultures
JP2018143100A (ja) 有用物質の生産方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150923