JP6866301B2 - ラムノリピド組成物の製造 - Google Patents
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Description
(a) 少なくとも1種のラムノリピド(RL)を含む水性培地を用意するステップと、
(b) (a)において用意した前記培地の非ろ過ベースの滅菌を行うステップと、
(c) (b)の前記滅菌培地においてRL含有相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップと
を含む、方法を提供する。
(a) 少なくとも1種のラムノリピドを含む水性培地(例えば、発酵培地)を用意するステップと、
(b) 用意した前記水性培地(例えば、発酵培地)を熟成させるステップと、
(c) (b)において用意した前記培地の非ろ過ベースの滅菌を行うステップと、
(d) (c)の前記滅菌培地を熟成させるステップと、
(e) (d)の前記熟成させおよび滅菌された培地においてRL含有液体相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップと
を含むことができる。
(a) ラムノリピド(RL)を含む水性培地(例えば、発酵培地)を用意するステップと、
(b) (a)において用意した前記発酵または培養培地を酸処理により滅菌して酸性化した液体相、油性相および固体相を得るステップと、
(c) (b)において得られた前記液体相を除去してかつ前記固体相および場合により油性相を塩基で処理して、中和溶液を得るステップと、
(d) (c)において得られた前記溶液から不溶性物質を除去して、1種または複数のラムノリピドを含む濃縮された清澄なブロスを含む組成物を得るステップと
を、含むことができる。
(a) 1種または複数のラムノリピドを含む水性(例えば、発酵)培地を用意するステップと、
(b) 場合により、用意した前記培地から不溶性不用物を除去するステップと、
(c) 用意した前記培地を滅菌するステップと、
(d) (c)の前記滅菌された培地を熟成させるステップと、
(e) 前記熟成させかつ滅菌された培地から不用物を除去するステップと、
(f) (e)で得られた培地を酸で処理するステップであって、得られた前記酸性化培地が固体相、液体相および油性相を含み、少なくとも液体相が除去され、固体相および場合により油性相が中和されて中和溶液が得られるステップと、
(g) (f)の前記中和溶液から固体不用物を除去して前記濃縮された清澄なブロスを含む前記組成物を得るステップと
を含む。
数値範囲が与えられる場合、文脈上別途明確に指示がない限り下限単位の10分の1まで、その範囲の上限値と下限値の間の各介在値、および、記載された範囲内の他のいずれの記載値または介在値は、本発明の範囲に包含されることは理解されよう。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、そのより小さい範囲に独立に含めることができ、それらもまた本発明の範囲内にあり、記載された範囲中で具体的に排除されたあらゆる限界値も対象となる。記載された範囲が1つまたは両方の限界値を含む場合は、これらの含められた限界値の片方または両方を排除する範囲もまた、本発明に含まれる。
を有する。アルカリ土類金属および遷移金属の場合、ラムノリピド塩の多数部分が各金属と会合することができる。特定の一実施形態では、組成物はモノラムノリピド(式中x=1)およびジラムノリピド(式中x=2)の混合物を含むが、ここで、yおよびzは6であり、MはHまたはNaである。モノラムノリピドは、式C26H48O9を持つ、Rha−C10−C10とよぶことができる。IUPAC名は、3−[3−[(2R,3R,4R,5R,6S)−3,4,5−トリヒドロキシ−6−メチルオキサン−2−イル]オキシデカノイルオキシ]デカン酸である。ジラムノリピドは、式C32H58O13を持つ、RhaRha−C10−C10とよぶことができる。IUPAC名は、3−[3−[4,5−ジヒドロキシ−6−メチル−3−(3,4,5−トリヒドロキシ−6−メチルオキサン−2−イル)オキシオキサン−2−イル]オキシデカノイルオキシ]デカン酸である。より特定の一実施形態では、モノラムノリピドは、総ラムノリピドの約30%から総ラムノリピドの約50%の量で存在することができ、ジラムノリピドは、総ラムノリピドの約50%から約70%ジラムノリピドの量で存在することができる。別の実施形態における組成物は、モノラムノリピド:ジラムノリピドの比が約35:65から約55:45である、モノラムノリピドおよびジラムノリピドを含んでいる。
1種または複数のラムノリピドを含んでいる用意した水性培地は、当技術分野で公知の方法を使用するラムノリピドを産生する組換え宿主細胞由来の発酵ブロスから得ることができ、特にこの組換え宿主細胞の成果とすることができるが、あるいはラムノリピド産生微生物由来の発酵ブロスから得ることができる。ラムノリピドを産生する組換え宿主細胞は、RhlA遺伝子もしくはそのオルソログおよび/またはRhlB遺伝子もしくはそのオルソログ、および/またはRhlC遺伝子もしくはそのオルソログ、および/またはRhlR遺伝子もしくはそのオルソログ、および/またはRhlI遺伝子もしくはそのオルソログ、および/またはRhlG遺伝子またはそのオルソログ等などを発現する細菌細胞などの、宿主細胞とすることができる。
用意した水性(例えば発酵)培地は滅菌される。具体的には、上記の方法における培地は、当技術で公知の方法を使用して非ろ過法によって滅菌することができる。これらの方法は、熱ベース、化学ベースまたは紫外光照射ベースのいずれかとすることができる。特定の一実施形態では、熱ベース処理とは、湿熱滅菌、特に高圧蒸気滅菌によることができる。
本明細書に記載の培地を使用して得られた組成物および/または培地由来の不用物は、当技術で公知の分離手順を使用して組成物から除去または分離することができる。これらの手順としては、限定されるものではないが、沈降バッチまたは連続遠心分離または超遠心分離が挙げられるが、これに続いて、当技術で公知の手順を使用するデカンテーションまたはろ過を行うことができる。不用物は、分離がプロセスのどこで行われるかに応じて、固体相または液体相のいずれかとすることができる。
培養または発酵培地は、約0〜30℃の間にて少なくとも約1日間および約24〜72時間の間、インキュベートすることによって熟成させることができる。この熟成ステップは、上記の1回のまたは複数の滅菌ステップの前および/または後に行うことができる。
水性(例えば、発酵)培地は、酸で処理し、液体不用物を除去し、次いで残留固体相または層をおよび場合により油性相または層を中和することによって、濃縮するまたは滅菌することができる。特定の一実施形態では、水性培地は酸で処理することができ、したがって、培養培地は約1.5〜2.5、好ましくは約2.05〜約2.15の間のpHに調整される。酸は、酢酸などの有機酸でも鉱酸であってもよい。好ましい一実施形態では、酸は鉱酸、例えばHCl、H2SO4、HNO3またはH3ClO4である。その結果、液体相、油性相および固体相が生成する。液体相は、当技術で公知の手順を使用して、および特定の一実施形態では上記の方法を使用して除去される(例えば、ろ過、またはデカンテーションと組み合わせた遠心分離もしくは沈降)。
水性培地(例えば、発酵培地またはブロス)は、当技術で公知の手順を使用して脱色および/または脱臭することができる。特定の一実施形態では、化学的処理および/または紫外照射処理もしくは可視照射処理が使用される。
別の実施形態では、過酸化物処理による脱色および/または脱臭をフォローしないことを条件として、液体は、当技術で公知の方法を使用して固体不用物を除去した後に除去することができる。これらには、それらに限定されないが、熱、蒸発、フリーズドライ(凍結乾燥)、ドラム乾燥が挙げられる。
[実施例]
ジラムノリピドおよびモノラムノリピドの混合物少なくとも50g/Lを含有する希薄溶液中の発酵ブロスからラムノリピドを、有機溶媒を使用せずに回収する方法が、本明細書で提供される。使用されている一般スキームを図1に示す。
本方法は、実施例1で得られた清澄なブロスから出発し、図2に概略的に示されている。実施例1に記載のように、清澄なブロスは、pH6.0〜6.5で終わる発酵ブロスを周囲条件下で約2日間熟成させることで、作製される。バイオマスは、この熟成方法に使用した容器の底に沈降し、透明な上清は、除去後、清澄なブロスである。方法の次のステップは、pHが約2.1になるまで、濃硫酸などの酸を添加することである。ラムノリピドは溶液から沈殿し、このステップに使用された容器の底に固体相および油状液体相を形成する。固体相および油状液体相の分離は、遠心分離によって迅速化できる。固体相および油状液体相は、廃棄してもリサイクルしてもよい水性上相または水性上層から分離される。次いで、pHが約7.0に達するまで、合わせた固体および油状液体のラムノリピド含有相を、水酸化ナトリウムなどの固体塩基で処理する。これによって、約25〜30%の濃度を持つラムノリピドの粘性水溶液が製造される。最終ステップは、25〜30%ラムノリピド溶液を遠心分離することと、残留固形体から形成されたペレットから液体最終生成物をデカントすることである。この液体を凍結乾燥(フリーズドライ)して、乾燥固体製品を製造することができる。
実施例1に記載の「低減された色および臭気を有する清澄なブロス」または「低減された色および臭気を有する滅菌発酵ブロス」を開始とする、pHシフトを使用する、30〜40%ラムノリピド溶液を製造する方法が提供されるが、図3および図4に概略的に示されている。
本方法は、図5に概略的に示されているが、ラムノリピドを産生する生体がなお含有されている発酵ブロスの遠心分離またはろ過などの固体/液体分離プロセスを行うことによって開始される。次いで、清澄な液体生成物は、濃硫酸、または別の濃い、強い鉱酸を使用してpH2.1に酸性化される。沈降または遠心分離の後、油状層と固体層である密度の高い生成物から水層をデカントする。この油状および/または固体層は、水酸化ナトリウムなどの固体塩基でpH7に中和し、溶液が得られる。最終的な固体/液体分離工程を行って、あらゆる残留不溶性不純物を除去する。次いで、液体は、例えば、高圧蒸気滅菌により滅菌する。
50〜60%ラムノリピド溶液を製造するために、実施例3、「pHシフトを使用する、30〜40%ラムノリピド溶液を製造するための有機溶媒を使用しない濃縮方法」で開示されている方法の変更形態が提供される。
この方法は、50〜60%ラムノリピド溶液を製造するための実施例5、「pHシフトを使用する、50〜60%ラムノリピド溶液を製造するための有機溶媒を使用しない濃縮方法」に記載の方法の変更形態であるが、溶液は酸沈殿後に得られる油状層を含み、したがってラムノリピドの回収が高められることから、より高い収率にある。
本発明は次の実施態様を含む。
[1]1種または複数のラムノリピドを含む組成物を得るための、有機溶媒を使用しない方法であって、
(a) 少なくとも1種のラムノリピド(RL)を含む水性培地を用意するステップと、
(b) (a)において用意した前記培地の非ろ過ベースの滅菌を行うステップと、
(c) (b)の前記滅菌培地においてRL含有相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップと
を含み、場合により、
(1)ステップ(a)の後であってステップ(b)の前に、ステップ(a)において用意した前記培地から固体不用物を除去するステップ、および/または
(2)滅菌ステップ(b)の後であって分離ステップ(c)の前に、ステップ(a)の前記滅菌培地を熟成させるステップ、および/または
(3)ステップ(c)の後に、流体を、分離したRL含有相から場合により除去して、固体組成物を得るステップ、および/または
(4)前記滅菌ステップの前および/または後に、用意した培地を脱色および/もしくは脱臭するステップ
をさらに含む、方法。
[2]ステップ(a)の後であってステップ(b)の前、および/またはステップ(b)の後であってステップ(c)の前に、
(1)ステップ(a)において用意した前記培地を熟成させて、熟成されかつ滅菌された培地を得るステップをさらに含み、
ステップ(a)の後であって前記培地が(1)において熟成される前に、固体不用物がステップ(1)において用意した培地から場合により除去される、上記[1]に記載の方法。
[3]前記培地が約0〜30℃の間にて少なくとも約1日間、熟成される、上記[2]に記載の方法。
[4]前記滅菌が、熱処理、化学処理および/または照射による、上記[1]から[3]に記載の方法。
[5]前記化学処理が酸性化処理および/または過酸化物処理による、上記[4]に記載の方法。
[6]ステップ(b)の前にステップ(a)で用意した前記培地を熟成させるステップと、
(b)前記熟成された培地を滅菌するステップと、
(c)前記滅菌された培地においてRL含有相を不用物から分離するステップとを含み、場合により、
(c)(1)前記RL含有相をさらに滅菌するステップと、
(c)(2)前記滅菌したRL含有相においてRL含有相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップと
をさらに含む、上記[1]から[5]に記載の方法。
[7]ステップ(b)における前記滅菌ステップが、化学処理および/または照射処理によるものであり、ステップ(c)(2)における前記滅菌ステップが熱処理によるものである、上記[6]に記載の方法。
[8]得られたラムノリピドを含む前記組成物が少なくとも約5重量%ラムノリピドを含む清澄なブロスである、上記[1]から[6]に記載の方法。
[9]前記脱色および/または脱臭ステップが化学的処理および/または照射処理によるものである、上記[1]に記載の方法。
[10]前記方法において、前記方法が、
(i)用意した前記培地を滅菌する前に、ステップ(a)において用意した前記培地から固体不用物を除去するステップをさらに含み;
前記方法において、ステップ(a)において用意した前記培地が、前記培地を酸処理することによってステップ(b)において滅菌され、得られた前記酸性培地が固体相、液体相および油性相を含み、少なくとも液体相が除去され、ステップ(c)の前に固体相および場合により油性相が中和されて中和溶液が得られ、
ここで、前記の固体相および油性相が別々に中和されて別々の溶液を得るか、または前記の固体相および油性相が合わされ、前記合わされた固体相および油性相が中和されて中和溶液が得られ、
ステップ(c)において、不溶性不用物質が前記溶液から除去されてラムノリピドを含む前記組成物が得られ、前記ラムノリピドを含む組成物は少なくとも約30重量%ラムノリピドを含む濃縮された清澄なブロスであり;
前記方法は、場合により、前記培地がステップ(b)において酸で処理される前および/または後に追加の滅菌ステップをさらに含み;
前記方法は、場合により、
(1)前記追加の滅菌ステップの前および/または後に、不溶性不用物を前記溶液から除去するための追加の分離ステップ、および/または
(2)滅菌後に、前記滅菌して濃縮した清澄なブロスを脱色および/または脱臭するステップ、および/または
(3)ステップ(c)において得られた前記溶液から流体を除去するステップ、および/または
(4)ステップ(c)において得られた前記溶液から水を除去するステップ
をさらに含む、上記[1]に記載の方法。
[11]前記追加の滅菌ステップの前および/または後に、用意した前記培地を熟成させるステップをさらに含む、上記[10]に記載の方法。
[12]前記組成物がモノラムノリピドおよびジラムノリピドを含み、モノラムノリピド:ジラムノリピドの比が、約35:65から約55:45である、上記[1]から[11]に記載の方法。
[13]上記[10]から[12]に記載の方法により得ることができる中和溶液を含む組成物。
[14]上記[1]から[12]に記載の方法により得ることができる脱色および/または脱臭培地を含む組成物。
[15]上記[1]から[12]に記載の方法により得ることができる熟成された培地を含む組成物。
Claims (8)
- 1種または複数のラムノリピドを含む組成物を得るための、有機溶媒を使用しない方法であって、前記ラムノリピドを含む組成物は少なくとも30重量%ラムノリピドを含む濃縮された清澄なブロスであり、
(a) 少なくとも1種のラムノリピド(RL)を含む水性培地を用意するステップと、
(b) ステップ(a)において用意した前記培地から固体不用物を除去するステップと、
(c) ステップ(b)で得られた培地を酸で処理して酸性培地を得るステップであって、得られた前記酸性培地が固体相、液体相および油性相を含むステップと、
(d) 少なくともステップ(c)で得られた液体相を除去するステップと、
(e) ステップ(c)で得られた固体相および場合により油性相を中和して中和溶液を得るステップと、
(f) ステップ(e)における前記中和溶液から不溶性不用物質を除去して前記組成物を得るステップと
を含む、方法。 - ステップ(c)において前記培地が酸で処理される前および/または後に、滅菌ステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記滅菌ステップの前および/または後に、不溶性不用物を前記溶液から除去するための追加の分離ステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 滅菌後に、前記滅菌して濃縮した清澄なブロスを脱色および/または脱臭するステップをさらに含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記滅菌ステップの前および/または後に、用意した前記培地を熟成させるステップをさらに含む、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)において得られた前記溶液から水を除去するステップをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記の固体相および油性相が別々に中和されて別々の溶液が得られる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記の固体相および油性相が合わされ、前記合わされた固体相および油性相が中和されて中和溶液が得られる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
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