KR20200027520A - 2종 이상의 탄소 공급원을 사용하는 람노리피드의 향상된 생산 - Google Patents

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Abstract

트리글리세라이드 함유 오일 및 감미제를 탄소원으로서 함유하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 람노리피드의 수율을 개선시키는 방법이 제공된다.

Description

2종 이상의 탄소 공급원을 사용하는 람노리피드의 향상된 생산
2종 이상의 탄소원, 특히 트리글리세라이드 함유 오일 및 감미제를 포함하는 배지에서 람노리피드 생산 미생물을 배양하는 것을 포함하는 람노리피드(RLs)의 개선된 제조 방법이 제공된다.
환경 문제의 증가로 인해 생물 계면 활성제(bio-surfactant)는 대중과 소비자에게 많은 관심을 받고 있다. 가장 많이 찾는 생물 계면 활성제 중 하나는 람노리피드(RL)인데 발포성, 세척성, 분산성, 유화성 및 표면 장력이 낮기 때문이다[1, 2]. 람노리피드는 탄수화물(rhamnose)과 지방족 산(hydroxy fatty acid)을 포함하는 계면 활성 당지질이다. 하나(모노람노실리피드 또는 모노-람노리피드) 또는 두 개의 람노오스 단위(디람노실리피드 또는 디-람노리피드)와 하나 또는 둘(주로 두 개)의 3-하이드록시 지방산 잔기를 포함한다. 람토리피드는 슈도모나스 애루지노사의 호기성 발효에 의해 주로 생산된다. 다른 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 대장균(E. coli)도 람노리피드를 생산하는 것으로 보고되었지만 수율은 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)보다 역가와 생산성이 훨씬 낮다[3].
람노리피드(RL)가 소듐라우레스설페이트(SLES) 및 소듐라우릴설페이트(SLS 또는 SDS)와 같은 석유계 합성 계면 활성제와 경쟁하기 위해서는 RL 생산 비용이 상당히 낮아져야 한다. 공정 최적화 및 발효 성능이 주요 원가 동인(cost driver) 중 하나이다. RL 생산성 및 역가를 증가시키기 위해 상이한 공급 원료, 유전자 변형된 균주 및 발효 전략을 포함한 다수의 접근법이 수행되었다. Banat et al.[4] 및 Kaskatepe et al.[5]은 저렴한 공급 원료(예 : 농업 및 다양한 산업의 폐기물 흐름)를 사용한 생물 계면 활성제 생산에 대한 광범위한 리뷰를 보유하고 있다. 람노리피드는 람노오스(설탕) 부분과 3-하이드록시 지방산 잔기를 포함하고 있기 때문에 몇몇 연구자들은 당밀을 유일한 탄소 공급 원료로 사용하려고 시도했다. 이들 중 어느 것도 2-10 % 의 당밀 농도에서 람노리피드 농도 > 6 g/L을 나타내지 않았다 [6-9] . 한편, 식물성 오일은 당밀 공급 원료에 비해 고농도로 람노리피드를 생성하는데 사용되어왔다. 지금까지 RL 생산을 위한 두 가지 공급 원료를 모두 조합한 것은 없다. 식물성 기름을 사용한 RL 생산의 발효 성능에 대한 요약은 표 1에 나와 있다.
탄소원 발효 종류 RL 농도 (g /L) 발효시간 (h) RL 생산성
(g/L/h) 		참고문헌
콩기름 유가식(Fed-batch) 95 216 0.44 [10]
옥수수 유 회분식(Batch) 27 120 0.23 [11]
팜유 회분식(Batch) 71 144 0.49 [12]
해바라기 유 회분식(Batch) 27 72 0.38 [11]
콩기름 유가식(Fed-batch) 65 90 0.72 [13]*
* 초기 24시간 동안 7~7.5로 pH 조절 후 6~6.5
미국 특허 제 5,501,966호[10]는 발효 11일(264 시간)에 112g RL/L의 RL을 생성하는 유가식(Fed-batch) 공정을 청구했지만, 계산된 RL 생산성은 단지 0.42g RL/L/h로, 이는 낮은 것으로 간주된다. 생산성(g RL/L/h)은 특정 발효량에서 람노리피드를 얼마나 빨리 생산할 수 있는지를 나타내기 때문에 매우 중요한 공정 매개 변수이다. RL 생산성이 높을수록 RL 생산 비용이 저렴하다.
도 1은 당밀 첨가 변화가 있거나 없는 발효의 pH 경향을 보여준다.
요약
중쇄(medium chain) 또는 장쇄(long chain) 트리글리세라이드 함유 오일(예를 들어, 코코넛 오일 또는 식물성 오일)에 감미제(예를 들어, 비정제 감미제 또는 설탕)를 첨가하거나, 또는 두 오일의 조합을 도입함으로써 람노리피드 생성을 향상시키는 수단이 제공된다. 따라서, 지방산으로부터 람노오스의 de novo 합성을 감소시킨다. 이로 인해 발효 시간이 단축되고 RL 생산성(g RL/L/h)이 향상된다.
또한, 하기의 단계를 포함하는 하나 이상의 람노리피드(RL)를 포함하는 복수의 발효물을 생산하는 반-연속식(semi-continuous) 방법을 제공한다:
(a) 람노리피드 생산 미생물을 2종 이상의 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 1종 이상의 탄소 공급원은 감미제이고 1종 이상의 탄소 공급원은 중쇄(medium chain) 또는 장쇄(long chain) 트리글리세라이드를 포함하는 오일이고, 1종 이상의 질소 공급원, 1종 이상의 인(phosphorous) 공급원, 1종 이상의 마그네슘 공급원, 1종 이상의 칼륨 공급원, 1종 이상의 황 공급원, 1종 이상의 클로라이드(chloride) 공급원, 및 1종 이상의 나트륨 공급원을 포함하는 배양 배지에서 및 선택적으로 유화제의 존재하에 약 1일 이상 동안 및 특히 약 1 내지 약 4일 동안, 보다 특히 약 1 내지 약 3일 동안 및 더욱 보다 특히 약 1 내지 약 2일 동안 람노리피드 생산 미생물을 배양하고, 하나 이상의 람노리피드(RL) 및 하나 이상의 람노리피드 생산 미생물을 포함하는 람노리피드를 포함하는 첫번째 발효 배지를 수득, RL을 약 1.5g RL/L/h 이상, 특히, 약 1.7g RL/L/h, 및 보다 특히 약 1.8g RL/L/h 이상 및 보다 더 특히 약 1.8g RL/L/h 내지 약 3.0g RL/L/h 및 보다 더욱 특히 약 1.8g RL/L/h 내지 약 2.7g RL/L/h의 비율로 수득하는 단계; (b) 단계 (a)에서 수득한 첫번째 발효 배지의 약 70% 이상을 제거하는 단계로서, 특정 실시예에서, 교반 및 공기 흐름을 유지하면서 수행하고, 특정 실시예에서, 상기 공기 흐름은 상기 발효 배지를 함유하는 용기 내에서 산소가 풍부한 공기로 유지되는 것인 단계; (c) (b)에서 제거한 첫번째 발효 배지를 단계 (a)에서 제시된 조성을 갖는 배양 배지로 교체하는 단계; 및 (d) 단계 (a)-(c)를 1회 이상 반복하여 람노리피드 및 하나 이상의 람노리피드 생산 미생물을 포함하는 그 다음 발효 배지를 수득하는 단계로서, 상기 단계 (a)-(c)는 약 20일 이상 및 보다 특히 약 30일 이상 반복될 수 있는 것인 단계.
일 구현예에서, 상기 방법은 하루에 총 발효 부피 0.1-0.2 % v/v의 농도로 하나 이상의 미량 영양소를 포함하는 조성물을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수있다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 상기 방법을 사용하여 약 40g 이상의 RL/L이 수득된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 50g의 RL/L이 수득되고; 보다 특정한 실시 양태에서, 약 55g 이상의 RL/L이 수득되고; 또 다른 특정 실시양태에서, 약 60g 이상의 RL/L이 수득되고; 보다 특정한 실시양태에서, 약 65g 이상의 RL/L이 수득되고; 보다 더 구체적인 실시양태에서, 약 70g 이상의 RL/L이 수득되고; 훨씬 더 특정한 실시양태에서, 약 80g 이상의 RL/L이 수득되고; 훨씬 더 특정한 실시 양태에서, 약 90g 이상의 RL/L이 수득된다. 훨씬 더 특정한 실시양태에서, 약 40g의 RL/L 내지 110 g의 RL/L이 수득된다.
2종 이상의 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 람노리피드 생산 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 하나 이상의 람노리피드를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 1종 이상의 탄소 공급원은 비정제 감미제이고 1종 이상의 탄소 공급원은 식물성 오일, 1종 이상의 질소 공급원, 1종 이상의 인 공급원, 1종 이상의 마그네슘 공급원, 1종 이상의 칼륨 공급원, 1종 이상의 황 공급원, 1종 이상의 클로라이드 공급원, 1종 이상의 나트륨 공급원 및 선택적으로 1종 이상의 유화제를 포함하는 배양 배지에서 약 1일 이상 동안 배양하여 약 40 g 이상의 RL/L, 보다 특히 약 50g 이상의 RL/L; 보다 특히, 약 55g 이상의 RL/L; 더욱 더 특히, 약 60g 이상의 RL/L, 더욱 더 특히, 약 70g 이상의 RL/L; 훨씬 더 특히, 약 80g 이상의 RL/L; 더욱 더 특히, 약 90g 이상의 RL/L의 역가로 수득되거나, 또는 대안적으로 약 40g의 RL/L 내지 약 110g의 RL/L 및/또는 약 1.5g 이상의 RL/L/h의 속도로 수득된다. 상기 방법은 상기 람노리피드 함유 발효 배지로부터 상기 람노리피드를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수있다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 미량 영양소가 없다. 이 배양 배지는 반-연속식 발효법, 특히 상기 기재된 반-연속식 발효법뿐만 아니라 회분식 및 유가식 발효법에 사용될 수 있다. 람노리피드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리 및 정제될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 9,884,883 및 미국 출원 번호 15611045, 2017년 6월 1일 출원).
정의
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한과 다른 언급되거나 게재된 값 사이에서 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 하한 단위의 10분의 1까지 각 개재 값이 이해되고 언급된 범위는 본 발명에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한도에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허는 그 전문이 참조로 포함된다. 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시를 앞당길 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참조에 의해 포함 된 재료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 한, 본 명세서는 그러한 재료를 대체할 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용 된 바와 같이, 단수 형태 "a", "and" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 참조를 포함한다는 점에 유의해야한다.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소 앞에있는 "적어도"라는 용어는 시리즈의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야한다. 당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시 양태와 많은 등가물을 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및하기 청구 범위에 걸쳐, 단어 "포함하다", 및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 그룹을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 또는 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 단계. 따라서, "포함하는", "포함하는", "갖는" 등의 용어는 광범위하게 또는 개방형으로 제한없이 읽혀져야한다. 본 명세서에서 사용될 때, "포함하는"이라는 용어는 "함유하는"이라는 용어로 또는 때때로 "갖는"이라는 용어로 사용될 때 사용될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, "감미제"는 식용 제품을 감미시키는 물질이다.
본원에 정의된 바와 같이, "비정제 감미료"는 설탕 가공의 부산물로서 물과 설탕을 함유하는 감미제이지만 정제 공정을 거치지 않았다. 또한 수액, 뿌리(예 : 감자, 고구마, 사탕무, 특히 사탕무), 넥타, 꽃, 잎, 과일, cane, 나무, 줄기 등을 포함하되 이에 국한되지는 않는다.
본원에 정의된 바와 같이, "정제 감미제"는 당업계에 공지 된 방법을 사용하여 정제 공정을 거친 감미제이다.
본원에 정의된 바와 같이, "유화제"는 유화제(유화액의 혼합 가능한 혼합물)를 잘 분산시키기 위해 전형적으로 사용되는 계면 활성제 유형이다. 유화제는 전형적으로 소수성(water-fearing) 및 친수성(water-loving) 모이어티를 갖는다. 오일 및 물을 포함하는 에멀젼에서, 유화제는 오일을 향한 소수성 부분으로 오일을 둘러싸고, 따라서 오일 분자가 합체될 수 없도록 보호층을 형성할 것이다. 이 작용은 분산된 상을 작은 입자로 유지하고 유제를 보존하는 데 도움이 된다. 유화제는 음이온성, 비이온성 또는 양이온성일 수있다.
본원에 정의된 바와 같이, "중쇄 트리글리세라이드"는 6-12개의 탄소 원자의 지방족 꼬리를 갖는 지방산을 함유한다.
본원에 정의된 "장쇄 트리글리세라이드"는 13개 초과의 탄소 원자의 지방족 꼬리를 갖는 지방산을 함유한다.
본원에 정의된 "식물성 오일"은 식물 또는 이의 일부로부터 유래된 트리글리세라이드의 혼합물을 함유한다.
본원에 정의된 바와 같이, "람노리피드"는 하나 이상의 전형적으로 선형, 포화 또는 불포화 하이드록시-카르복실산 잔기 및 하나 이상의 람노오스 단위의 당류 부분을 포함하는 지질 부분을 갖는 당지질을 지칭한다. 당 부분 및 지질 부분은 당 부분의 람노오스 잔기의 1-OH 기와 지질 부분의 하이드록시-카르복실산의 3-OH 기 사이의 글리콜 당 결합을 통해 연결된다. 따라서, 하나의 카복실산 잔기의 카복실산 그룹은 람노리피드의 말단을 정의한다. 하나 이상의 람노오스-모이어티가 람노리피드에 포함되는 경우, 지질 부분에 연결되지 않은 각각의 람노오스 모이어티는 1,4 β-글리코시드 결합을 통해 다른 람노오스 모이어티에 연결된다. 둘 이상의 β-하이드록시-카르복실산이 람노리피드에 존재하는 구체예에서, 하이드록시-카르 복실산 잔기는 서로 독립적으로 선택된다. 각각의 복수의 α-하이드록시 카르복실 산 잔기의 α-하이드록시 카르복실산 잔기는 일부 구체예에서 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 이들은 서로 상이하다.
본원에 정의된 바와 같이, "미량 영양소 조성물"은 약 20mg/L 이하의 양으로 존재하는 미량 영양소를 포함하는 조성물이다.
용어 "배양 배지", "발효 배지"는 동의어이며 상호 교환적으로 사용된다.
상세한 설명
람노리피드의 개선된 제조 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 람노리피드는 구조(I)을 가질 수 있다.
Figure pct00001
m=2, 1 또는 0, 특히 1 또는 0, n=1 또는 0, 또는 특히 1, R1 및 R2는 서로 독립적으로 탄소수 2 내지 24, 바람직하게는 5 내지 13의 동일하거나 상이한 유기 라디칼 원자, 특히 선택적으로 분지형, 선택적으로 치환된, 특히 히드록실-치환, 선택적으로 불포화, 특히 선택적으로 모노-, 디-또는 트리 불포화 알킬 라디칼, 바람직하게는 펜테닐, 헵테닐, 노네닐, 운데세니 및 트리데세닐로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 원자 및 (CH2)O-CH3(o = 1 내지 23, 바람직하게는 4 내지 12).
주쇄 및 분지 모두는 예를 들어 N, O, S, Se 또는 Si와 같은 헤테로 원자를 추가로 함유할 수 있거나 탄소 원자가 이들 헤테로 원자 중 하나로 대체 될 수 있다. 지방족 잔기는 하나 이상의 작용기로 치환되거나 비치환 될 수있다. 치환기는 예를 들어 아미노, 아미도, 카르보닐, 카르복실, 히드록실, 니트로, 티오 및 술포닐과 같은 임의의 관능기일 수 있다.
람노리피드 생성 미생물
위에서 언급한 바와 같이, 방법은 람노리피드 생성 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 람노리피드 생성 미생물은 람노리피드를 생산하는 숙주 세포일 수 있다. 람노리피드를 생산하는 재조합 숙주 세포는 RhlA 유전자 또는 그것의 ortholog 및또는 RhlB 유전자 또는 ortholog를 발현하는 박테리아 세포, 및/또는 RhlC 유전자 또는 ortholog 및/또는 RhlR 유전자와 같은 숙주 세포 일 수 있다. 또는 이의 ortholog 및/또는 RhlI 유전자 또는 이의 ortholog 및/또는 RhlG 유전자 또는 이의 ortholog 및 기타일 수 있다.
대안적으로, "람노리피드-생성 미생물"은 박테리아와 같은 임의의 미생물 일 수 있으며, 이들은 필라 악티노박테리아(phyla Actinobacteria), 피미쿠테스(Fimicutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 박테리아를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 조건 하에서 람노리피드를 합성/생성하는 능력을 갖는다. 특정 구체예에서, 람노리피드 생성 미생물은 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) 강(class)의 박테리아이다. 추가의 구체예에서, 람노리피드 생성 미생물은 슈도모나데일스(Pseudomonadales) 목(order)의 박테리아이다. 또 다른 추가의 구체예에서, 람노리피드 생성 미생물은 슈도모나 다카에(Pseudomonadacae) 과(family)의 박테리아이다. 추가의 구체예에서, 람노리 피드 생성 미생물은 슈도모나스 속의 박테리아, 예컨대 P. alcaligenes, P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. c1emancea, P. collierea, P. fluorescens, P. luteola, P putida, P. stutzeri 및 P. teessidea이다. 추가의 구체예에서, 람노리피드 생성 미생물은 P. aeruginosa이다.
배양(발효) 배지
람노리피드 함유 미생물은 배양(발효라고도 함) 배지에서 배양된다. 상기 배양 배지는 2종 이상의 탄소 공급원, 1종 이상의 질소 공급원, 1종 이상의 인 공급원, 1종 이상의 황 공급원, 1종 이상의 나트륨 공급원, 1종 이상의 마그네슘 공급원, 1종 이상의 칼륨 공급원, 1종 이상의 황 공급원 및 1종 이상의 클로라이드 공급원을 포함한다.
특정 구체예에서, 탄소 공급원은 감미제 및 하나 이상의 중쇄 및/또는 장쇄 트리글리세라이드를 함유하는 오일일 수 있다(본 명세서에서 각각 중쇄 트리글리세라이드 함유 오일 및 장쇄 트리글리세리드 함유 오일로도 지칭됨). 특정 실시 양태에서, 각각의 감미제는 약 0.1% 내지 약 2% w/v의 양으로 존재할 수 있고/있거나 각 오일은 약 3% 내지 약 15% w/w, 특히 약 4% 내지 약 10% w/w의 양으로 존재할 수 있고 더욱 특히 약 6% 내지 약 12% w/w 사이에 존재할 수 있다.
감미제는 정제 또는 비정제 감미제일 수 있다. 정제 감미제의 예는 설탕(테이블 슈가) 및 스테비아를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 비정제 감미제는 설탕 가공 및/또는 수액, 하나 이상의 뿌리, 과일, 하나 이상의 종자, 하나 이상의 넥타, 하나 이상의 꽃, 하나 이상의 잎, 하나 이상의 나무, 하나 이상의 줄기 및/또는 하나 이상의 동물로부터 유래될 수 있다. 보다 특정한 실시 양태에서, 사용되는 상기 비정제 감미제는 당밀, 쌀 또는 보리 맥아 시럽, 넥타, 야콘 시럽, 사탕무 시럽, 옥수수 시럽, 수수 시럽, 메이플 시럽, 야자 설탕 또는 감자 또는 고구마로부터 유래된 감미제 중 하나 이상일 수 있거나. 가장 특정한 구체예에서, 비정제 감미제는 당밀이다. 다른 구체예에서, 탄소 공급원은 단당류, 예를 들어 포도당, 이당류, 예를 들어 설탕, 설탕 알코올, 예: 글리세롤, 장쇄 알칸, 예를 들어 n- 헥사데칸, 카프릴산(옥탄산이라고도 함)과 같은 지방산 또는 이들의 혼합물, 유기산(예 : 젖산, 아세트산, 시트르산, 프로피온산), 알코올 (예를 들어 에탄올), 및 이들의 혼합물일 수 있다.
하나의 특정 실시 양태에서, 오일은 중쇄 트리글리세라이드 함유 오일로서, 상업적으로 입수 가능한 중쇄 트리글리세라이드 오일로, 이는 코코넛 오일, 팜유 및/또는 다른 중쇄 트리글리세리드(예 : 카프릴산 함유), 코코넛 오일 또는 팜유의 혼합물을 함유할 수 있다. 장쇄 트리글리세라이드는 콩 오일, 유채 오일, 해바라기 오일, 잇꽃 오일, 땅콩 오일, 대마 오일, 자트로파 오일, 호리병박 오일, 아마씨 오일, 옥수수 오일, 양귀비씨 오일, 달맞이꽃 오일, 올리브 오일일 수 있다. 일 구현 예에서, 장쇄 트리글리세라이드는 13개 초과의 탄소 원자의 지방족 꼬리를 갖는 지방산; 특정 실시 양태에서, 이는 13 내지 21개의 탄소 원자의 지방족 꼬리를 갖는 지방산을 함유한다.
특정 구체 예에서, 오일은 식물성 오일일 수있다. 식물성 오일은 콩 오일, 잇꽃 오일, 땅콩 오일, 대마 오일, 카놀라 오일, 자트로파 오일, 호리병박 오일, 아마씨 오일, 옥수수 오일, 양귀비씨 오일, 달맞이꽃 오일, 올리브 오일, 팜 커넬 오일, 팜 오일, 유채 오일, 참기름, 해바라기 오일, 포도씨 오일, 호두 오일, 밀 배아 오일, 또는 식물성 오일의 조합일 수 있다.
보다 특정한 실시 양태에서, 장쇄 트리글리세라이드는 식물성 오일일 수 있고 감미제는 비정제 감미제일 수 있다.
다른 특정 실시 양태에서, 중쇄 또는 장쇄 트리글리세라이드는 상기 식물성 오일이 옥수수 오일, 카놀라 오일 또는 콩 오일인 식물성 오일 또는 중쇄 트리글리세라이드가 코코넛 오일이고 감미제가 당밀, 사탕무 시럽 또는 수수 시럽과 같은 비정제 감미제인 중쇄 트리글리세라이드일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 배양 배지는 3종 이상의 탄소 공급원을 포함할 수 있으며, 여기서 2종 이상의 탄소 공급원은 감미제이고 1종 이상의 탄소 공급원은 중쇄 또는 장쇄 트리글리세리드 함유 오일이다. 보다 특정한 실시 양태에서, 2종 이상의 탄소 공급원은 비정제 감미제이고 1종 이상의 탄소 공급원은 중쇄 트리글리세리드 함유 오일, 예를 들어 코코넛 오일이다.
다른 특정 구체예에서, 배양 배지는 4종 이상의 탄소 공급원을 포함하며, 여기서 2종 이상의 탄소 공급원은 중쇄 또는 장쇄 트리글리세라이드를 함유하는 오일이고 2종 이상의 탄소 공급원은 감미제이다. 보다 특정한 실시 양태에서, 탄소 공급원 중 하나 이상은 중쇄 트리글리세리드 함유 오일(예를 들어, 코코넛 오일)이고, 탄소 공급원 중 하나는 장쇄 트리글리세리드 함유 오일(예를 들어, 카놀라 오일과 같은 식물성 오일)이고 2종 이상의 탄소 공급원은 비정제 감미제(예를 들어, 당밀, 수수 시럽, 사탕무 시럽)이다.
질소원은 황산 암모늄, 인산 암모늄, 우레아, 효모 추출물, 육류 추출물, 펩톤 및 옥수수 침지액일 수있다. 특정 구체예에서, 질소원은 NaNO3이다. 또 다른 구체예에서, 질소는 약 5-20 g/L의 양으로 존재할 수 있다.
인 공급원은 특정 실시 양태에서 H3PO4 또는 K2HPO4 일 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 인은 약 1-15 g/L의 양으로 존재한다.
특정 구체예에서, 마그네슘 이온은 MgSO4·7H2O 및/또는 MgCl2 일 수 있다. 특정 구체예에서, 마그네슘은 약 0.2-2 g/L의 양으로 존재한다.
칼륨은 KCl 및/또는 KOH 일 수있다. 특정 실시 양태에서, 칼륨은 약 0.1 내지 약 2g/L의 양으로 존재한다.
나트륨은 NaCl, NaNO3 및 NaOH일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 나트륨 이온은 약 1-15 g/L의 양으로 존재한다.
클로라이드는 KCl 및 NaCl 일 수있다. 특정 실시 양태에서, 상기 클로라이드 이온은 약 0.1-1g/L의 양으로 존재한다.
황은 H2SO4 일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 황 이온은 약 0.1-1 g/L의 양으로 존재한다.
황 및 클로라이드 공급원은 수성층 폐기물 스트림으로부터 유래할 수 있거나, 또는 미국 특허 제 9,884,883 호에 기술된 절차를 사용하여 얻을 수 있는 산 처리된 정화 발효 브로쓰의 수성 액체상 또는 수성상으로 지칭될 수도 있다. 특정 구체예에서, 람노리피드는 산 처리된 정화 발효 브로쓰로부터 용액으로부터 침전되어 바닥에서 고체상 및 유성 액체상을 형성하고 수성 액체상이 이 단계에 사용 된 용기의 상단에서 생성된다. 수성 액체상은 당업계에 공지된 절차를 사용하고 특정 구체예에서 상기 제시된 방법(예를 들어, 디캔팅과 함께 원심 분리 또는 침전)을 사용하여 제거된다. 상기 언급된 수성층은 (이 pH 조정 동안 사용된 산의 유형에 따라 약 1.5 내지 2.5, 바람직하게는 약 2.05 내지 약 2.15)의 황 또는 클로라이드의 공급원이며 미량 영양소의 공급원이다.
배양 배지는 유화제를 추가로 포함할 수있다. 특정 구체예에서, 유화제는 아라비아 검, 구아 검 및 람노리피드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 상기 배양 배지에서 유화제 대 탄소원의 비는 약 0.1 % 내지 약 20 % w/w이다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 상기 유화제는 약 0.1 내지 2 중량 %의 양으로 존재할 수 있다.
특정 구체 예에서, 배양 또는 발효 배지는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 멸균된다. 이들 방법은 여과 기반, 열 기반, 화학 기반 또는 자외선 기반일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 열 기반 처리는 습열 멸균, 특히 오토 클레이빙을 통한 것일 수 있다.
일 구현 예에서, 배양 배지(예를 들어, 발효 배지)는 상기 절차 중 하나에 의해 멸균될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 발효 배지는 상기 제시된 하나 이상의 절차에 의해 멸균될 수 있으며, 이러한 멸균은 임의의 순서로 이루어질 수 있다. 발효의 첫 번째 사이클 동안 발효에서 멸균될 수 있지만 후속 주기에서 다른 용기에서 멸균되어야 한다.
미량 영양소 조성물
위에서 언급한 바와 같이, 상기 방법은 미량 영양액 또는 조성물을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 미량 영양소는 미량의 Fe, Mn, Zn, Cu, Na 일 수있다. 특정 구체 예에서, 상기 미량 영양소는 Fe, Mn, Zn, Na 또는 Cu 염이다. 보다 특정한 구체예에서, 상기 미량 영양소 조성물은 Fe, Mn, Zn, Na 및 Cu 염을 포함한다. 조성물은 여과에 의해 멸균될 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 Cu 염은 CuCl2·2H2O 및 CuSO4·5H2O 중 적어도 하나이고 미량 영양액 약 0.5-3 g/L의 양으로 존재할 수 있으며; 상기 Mn 염은 MnSO4·H2O 및 MnCl2·4H2O 중 하나 이상이고 약 0.1-2 g/L의 미량 영양액의 양으로 존재할 수 있으며; 상기 Zn 염은 ZnSO4·7H2O 또는 ZnCl2이고 약 0.5-3 g/L의 미량 영양액의 양으로 존재할 수 있으며; 상기 Fe 염은 FeCl3·6H2O 또는 FeSO4 중 하나 이상이고 약 0.1-1 g/L의 미량 영양액의 양으로 존재할 수 있으며; 상기 나트륨 염은 Na3C6H5O7·2H2O이고 미량 영양소 용액의 약 1-5 g/L의 양으로 존재할 수 있다.
실시예
실시예 1: 황화되지 않은 블랙스트랩(blackstrap) 사탕수수 당밀 첨가제 및 유화제로서 아라비아 검을 함유한 람노리피드의 6% 콩 오일 반-연속식 발효
람노리피드의 발효는 작업량 7.5L의 10L 발효조 용기(Labfors 5, Infors HT, Switzerland)에서 수행된다. 발효 배지는 탈 이온수(DI)수의 균형에 유화 오일 및 영양 용액을 함유한다. 먼저, 주방용 블렌더를 사용하여 유화제로 사용된 0.8% 아라비아 검을 갖는 8% 유화 콩오일 1.5L를 제조하였다. 당밀 첨가(무황(sulfur) 블랙스트랩 당밀, 미국 골든 배럴 (Golden Barrel), 미국)로, 당밀을 오토 클레이브에서 121℃에서 50분 동안 멸균하기 전에 1%, 0.5% 또는 0.25% w/v로 유화 오일에 첨가한다. 37℃로 냉각시킨 후, 9.69 g/L 85% H3PO4, 5.21 g/L NaOH, 1 g/L MgSO4· 7H2O, 1 g/L KCl 및 15 g/L NaNO3를 함유하는 0.2 미크론 멸균 여과된 영양소 용액을 첨가하였다. 85% H3PO4를 제외한 모든 화학 물질은 99% 이상의 순도를 가진다. H2SO4는 US 출원 2017년 6월 1일자로 출원된 제 15611045 호의 실시예 3으로부터 수득된 2.5% R4 배양물로 접종하기 전에 발효 배지의 pH를 6.3으로 조정하는데 사용된다.
37℃, 0.14 vvm 공기 공급 속도 및 300-650 rpm 교반 속도에서 발효를 수행하여 용존 산소(DO)를 15 % 이상 유지한다. 교반 속도가 650rpm에 도달했지만 % DO가 여전히 15% 미만인 경우, 총 가스 유량을 일정하게 유지하기 위해 순수한 산소가 공기와 함께 첨가된다(0.14 vvm). US20160326561로 공개된 미국 특허 제 15/146,508 호에 열거된 실시예 2에 따라 제조된 마이크로-트레이스 요소 조성물의 대략 20%가 페리스티틱 펌프를 사용하여 발효기에 80㎖/일로 연속적으로 첨가된다. 실리콘 기반 소포제(Snapsil FD30, BRB, 네덜란드)가 발효 중에 거품을 녹아웃하기 위해 자동으로 첨가된다. pH가 7.9를 초과하지 않으면 발효는 pH 제어없이 일어난다. 이 시점에서 7.9에서 pH를 제어하기 위해 25% H2SO4가 자동으로 첨가된다.
발효가 완료된 후, 펌프를 사용하여 % DO를 15%(즉, 교반 및 공급된 가스가 여전히 켜져 있음)를 유지하면서 약 77% 발효 브로쓰(5.8 L)가 배출된다. 이 실시 예의 첫 번째 단락에서 언급된 바와 같이 분리된 용기에 제조된 새로 멸균된 5.8L의 8% 유화 오일 배양 배지는 발효기에서 새로운 공급 원료로 공급된다. "DF(Draw and Fill)"라고 하는 이 프로세스는 US20160326561로 공개된 제 15/146,508 호 미국 출원에 개시되어있다. 접종 후 발효기로부터 제거된 77% 발효 브로쓰의 첫 번째를 배치 DF0이라 한다. 이어서, DF0 이후 발효기로부터 다음 발효 배지를 DF1이라 칭한다.
도 1에 도시된 DF1(당밀 없음), DF5, 6 및 7(0.5 % 당밀 첨가)에 대한 발효 과정에 걸친 pH의 경향은 pH 변화의 3상 패턴을 나타낸다. 첫째, 발효 시작시 pH가 급격히 증가한다. 둘째, pH가 다시 증가하는 3단계에 도달하기 전에 pH는 안정적으로 유지되거나 약간 감소한다. 당밀을 첨가하면 2단계가 단축된다. 3단계에서, % DO의 증가와 함께 pH가 급격히 상승하는 반면 교반 및 공기 흐름은 일정하게 유지되어 발효가 완료되었음을 나타낸다. 제거된 발효 브로쓰를 9500rpm에서 10분 동안 또는 5분에 14,000rpm으로 원심 분리한 후에 상부에 오일층이 없는 투명한 상청액을 수득한다. 이어서, 각각의 DF로부터 수득된 투명한 RL 상청액을 멸균하고 다시 원심 분리하여 정화된 브로쓰(CB)를 수득하고, 이는 물질의 출발 농도에 따라 100 내지 200회 이상 DI 수로 희석되기 전에 0.2 미크론에서 여과된다. 이어서, 희석 된 샘플을 람노리피드 정량화를 위해 HPLC-ELSD(실시예 2에 나타낸 상세 방법)에 주입한다.
다양한 농도의 당밀 첨가에 의한 발효 결과가 표 2에 제시되어 있다. 발효를 중단시키지 않고 10L 발효조 용기를 사용하여 65L 이상의 발효 브로쓰를 생성하는 이러한 "draw and fill" 공정으로 18일 동안 발효를 연속적으로 수행하였다. 표 2의 결과는 당밀을 첨가하면 주로 2차 pH 변화 단계(그림 1) 동안 발효 시간이 짧아져 당밀 농도에 관계없이 당밀이 없는 것과 비교하여 더 높은 RL 생산성을 산출함을 분명히 보여준다. 이것은 또한 g CDW/L(g 세포 건조 중량/L) 컬럼에 도시된 박테리아 세포 질량의 증가로 인한 것일 수 있다.
DF# %당밀 첨가 발효시간 (h) RL(g/L) RL 생산성(g/L/h) g CDW/L %콩 오일 소비
DF0* 0% 76 75 1.0 16 90%
DF1 0% 50 67 1.3 17 92%
DF2 1% 38 72 1.9 32 96%
DF3 1% 34 69 2.0 37 94%
DF4 1% 36 69 1.9 37 95%
DF5 0.50% 28 59 2.1 36 94%
DF6 0.50% 28 60 2.2 31 93%
DF7 0.50% 28 63 2.2 36 94%
DF8 0.25% 33 63 1.9 28 91%
DF9 0.25% 34 62 1.8 25 93%
DF10 0.25% 34 65 1.9 22 95%
*8% 콩오일이 사용됨.
실시예 2: 정량 및 람노리피드 구조의 분석
1290 Infinity 증발 광 산란 검출기(ELSD) 및 역상 컬럼인 Pinnacle DB C18 (100×2.1 mm, 3 미크론 부품 번호 9414312)이 장착된 Agilent 1260 Infinity 고압 액체 크로마토 그래피(HPLC) 시스템은 Restek의 정량화에 사용된다. 샘플에서 람노리피드의 농도, 칼럼 온도는 40℃에서 일정하게 유지된다. 샘플 주입량은 25㎕이다. 이동상은 0.25 ㎖/분으로 동일한 부피의 5mM 암모늄 아세테이트 및 아세토 니트릴을 함유한다. 분무 및 증발기 온도는 1.7 SLM의 질소와 함께 40℃이다. RL 농도는 희석 크로마토 그래피를 사용하여 집에서 얻은 표준의 알려진 농도(즉, 순수한 디-람노리피드 및 순수한 모노-람노리피드의 교정 곡선)를 사용하여 계산된다.
람노리피드의 구조는 electrospray 이온화 (LC/MS)와 Waters ZQ2000 단일 사중 극자 질량 분석기에 연결된 Waters Corporation 2695 분리 모듈을 사용하여 분석된다. LC 컬럼은 HPLC 셋업에서 사용된 것과 동일하다. 주입량은 5㎕이다. 이동상은 5mM 암모늄 아세테이트(A) 및 아세토니트릴(B)로 구성된다. 유속은 2분 동안 A=60%(B=40%)를 갖는 0.2 ㎖/분 이고, 이어서 15분에 100% B로 구배되고, 여기서 LC 처리의 나머지 동안 유지된다. 샘플은 4℃로 유지되고 컬럼 온도는 40℃로 일정하게 유지된다. 람노리피드의 검출을 위한 LC/MS 조건은 하기 표 3에 열거되어 있다.
LC/MS 조건
파라미터 세팅
Capillary (kV) 3.2
Cone (V) Per Ion
Extractor (V) 5
Source Temp (°C) 100
Desolvation Temp (°C) 300
Desolvation Gas (L hr-1) 250
Cone Gas (L hr-1) 50
실시예 3: 7.8% 콩 오일 및 0.5% 비 황화 블랙 스트랩 사탕 수수 당밀의 유화제로서 람노리피드의 RL 반-연속식 발효
발효 조건, 배지 및 영양소 조성물은 실시예 1로부터 제조된 정제된 람노리 피드가 유화제로서 사용되는 것을 제외하고는 실시예 1에 도시된 것과 동일하다. 탄소 공급 원료는 7.8% 콩 오일이고 0.5% 비 황화 블랙 스트랩 당밀이다. 정제된 람노리피드는 처음에 새로 멸균된 배양 배지로 유화제로서 배양 배지에 첨가된다.
람노리피드(RL) 농도 및 생산성은 표 4에 제시되어 있다. RL은 DF0의 경우 0.5% 및 DF1-DF3의 경우 0.1%에서 유화제로서 초기에 배지에 첨가되기 때문에, 그 양을 빼고 실제 RL 농도 발효에서 생성된 양은 조정된 RL(g/L)로 보고된다.
7.8% 콩오일 및 0.5% 당밀의 RL 발효 수행도
Batch 유화제로서 %RL 조정된 RL (g/L) 발효(h) RL 생산성(g/L/h) %C in oil to C in RL
DF0 0.5% 78 44 1.8 80%
DF1 0.1% 90 35 2.6 92%
DF2 0.1% 93 34 2.7 95%
DF3 0.1% 80 33 2.4 82%
미생물은 LB 브로쓰를 함유한 진탕 플라스크에서 콩 오일을 함유한 발효기까지 새로운 환경에 적응하는데 시간이 필요하기 때문에 DF0에 대해 발효 시간이 더 오래 걸린다는 점에 주목할 가치가 있다. 도시된 DF0의 모든 RL 생산성은 DF1+로부터 얻은 것보다 낮다. 이는 또한 첫 번째 접종(DF0) 후 RL 생산성 및 발효 공정 효율이 증가하기 때문에 반 연속 발효 공정의 장점이다. 배치 발효 과정은 발효가 처음부터 시작해야하기 때문에 (즉, 각 배치에 대한 새로운 접종) 새로운 배치가 시작될 때마다 이 지연으로 고통받을 것이다.
% 탄소 전환율은 콩 오일에 함유된 탄소의 양을 람노리피드에서 탄소로 전환하여 계산된다. LC/MS 결과는 람노리피드 샘플이 C10-C10 및 C10-C12 꼬리와 함께 주로 모노-및 디-람노오스를 함유함을 보여 주었다. 이 결과에 기초하여, 콩 오일에서 람노리피드 생산으로의 계산된 탄소 전환율은 80%보다 크다.
실시예 4: 8.8% 옥수수 오일 및 0.5% 비 황화 블랙 스트랩 사탕 수수 당밀의 RL 반-연속식 발효
발효 조건, 배지 및 영양소 조성물은 실시예 1로부터 제조된 정제된 람노리 피드가 유화제로서 사용되고 7.5 ㎖ 미세-미량 원소가 매일 첨가되는 것을 제외하고는 실시예 1에 도시된 것과 동일하다. 탄소 공급 원료는 0.5% 비 황화 블랙 스트랩 당밀을 갖는 8.8 % 옥수수 오일이고, 정제된 람노리피드는 DF0의 시작 부분에서 0.1%로 유화제로서 배양 배지에 첨가된다. DF1-DF5의 유화제로 람노리피드가 첨가되지 않는다.
Batch 조정된 RL (g/L) 발효 시간(h) RL 생산성(g/L/h) %모노 RL
DF1 106 46 2.3 55%
DF2 93 45 2.1 54%
DF3 106 51 2.1 58%
DF4* 82 40 2.1 53%
DF5 97 49 2.0 60%
*7.8% 옥수수 오일이 사용됨.
옥수수 오일의 발효에서 얻은 RL 생산성은 콩 오일의 RL 생산성과 같다. RL 생산성은 2-2.3 g RL/L/h의 범위이다.
실시예 5: 사탕무 및 수수 시럽을 사용한 다양한 농도의 플라스크 실험
진탕 플라스크 실험은 250㎖ 파이렉스 얼렌 마이어(Pyrex Erlenmeyer) 배플 플라스크에서 MaxQ ™ 8000 Stackable Orbital Shakers(Thermo Scientific)를 사용하여 37℃, 250 rpm에서 수행된다. 각각의 플라스크는 실시예 1에 기재된 것과 동일한 영양소 조성을 갖는 8% 콩 오일을 함유하는 배양 배지 40㎖를 함유하지만 미세 미량 원소를 함유하지 않았다. 배플 플라스크를 121℃에서 20분 동안 고압 멸균하고, P. aeruginosa 배양물로 2.5% v/v 접종하기 전에 실온으로 냉각시켰다. 멸균 피펫을 사용하여 68, 92 및 116 시간에 샘플을 수집했다. 샘플을 14,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 투명한 상청액(오일층 없음)을 얻은 다음, HPLC/ELSD를 사용하여 RL 농도 분석을 위해 희석하기 전에 0.2 마이크론에서 멸균 및 여과하였다.
투명한 상청액이 없는 샘플(즉, 상단에 오일층이 있음)은 "No CB"로 표시되며 이는 샘플에서 너무 높은 오일 농도로 인해 HPLC에 주입되지 않았음을 의미한다. 표 6에 나타낸 결과는 사탕무 시럽 및 수수 시럽의 첨가에 의해 람노리피드 생산이 또한 향상됨을 분명히 보여준다.
사탕무 및 수수 시럽 설탕이 함유된 람노리피드 농도
플라스크(h) 첨가제 없음 사탕무 시럽 수수 시럽
0.50% 1% 1.50% 0.50% 1% 1.50%
68 No CB No CB No CB No CB No CB No CB 74
92 No CB 72 84 80 No CB 90 103
116 56 71 77 80 88 85 91
실시예 6: 8% 콩 오일 및 0.5% 비 황화된 블랙 스트랩 사탕 수수 당밀을 사용한 RL 회분식(batch) 발효
발효 조건, 배지 및 영양소 조성물은 이것이 발효가 R4 접종(시간 = 0)으로 시작되고 발효가 완료되면 발효가 종료되고 청소되는 회분식(batch) 발효라는 것을 제외하고는 실시예 4에 도시된 것과 동일하다. 탄소 공급 원료는 0.5% 비 황화 블랙 스트랩 당밀을 갖는 8% 콩 오일이다. 정제된 람노리피드는 새로 멸균된 배양 배지와 함께 0.1%에서 유화제로서 배양 배지에 첨가된다.
발효가 완료 되려면 44시간이 걸린다. 람노리피드(RL) 농도는 44시간 내에 88 g/L에서 수득되고 따라서 RL 생산성은 당밀 첨가없이 실시예 1에 도시된 DF0에서 수득된 1 g/L/h와 비교하여 1.9 g/L/h이다.
실시예 7: 8% 코코넛 오일 및 람노리피드를 유화제로 사용한 0.5% 비 황화된 블랙스트랩 사탕 수수 당밀의 RL 반-연속식 발효
발효 조건, 배지 및 영양소 조성물은 탄소 공급 원료가 8% 코코넛 오일인 것을 제외하고는 실시예 3에 도시된 것과 동일하다. 람노리피드는 DF0에서 생성되므로 DF1-DF4의 유화제로 추가되지 않는다. 발효 시간은 0.5% 당밀 첨가하에서 32 내지 36시간 동안 유지된다.
8% 코코넛 오일 및 0.5% 당밀을 사용한 RL 발효 수행도
Batch RL (g/L) 발효 시간(h) RL 생산성 (g/L/h) %모노 RL
DF0 68 38 1.8 66%
DF1 75 33 2.2 63%
DF2 74 33 2.3 64%
DF3 74 32 2.3 62%
DF4 75 36 2.1 61%
실시예 8: 설탕 첨가의 조합을 사용한 8% 코코넛 오일의 RL 발효
발효 조건, 배지 및 영양소 조성물은 당 첨가제가 비 황화 블랙 스트랩 사탕 수수 당밀, 수수 시럽 및 사탕무 시럽인 것을 제외하고는 실시예 7에 도시된 것과 동일하다.
8% 코코넛 오일 및 다양한 설탕 첨가를 사용한 RL 발효 수행도
설탕 RL (g/L) 발효 시간(h) RL 생산성 (g/L/h) %모노 RL
설탕 없음 91 88 1.0 57%
0.25% 당밀+ 0.25% 수수 79 33 2.4 63%
0.25% 당밀 + 0.25% 사탕무 80 35 2.3 60%
0.25% 사탕무 + 0.25% 수수 82 57 1.4 56%
0.5% 사탕무 + 0.5% 수수 81 41 2.0 59%
실시예 9: 0.5% 비 황화된 블랙 스트랩 사탕 수수 당밀을 사용한 중쇄 및 장쇄 트리글리세라이드 오일의 RL 발효
발효 조건, 배지 및 영양소 조성물은 각각 중쇄 및 장쇄 트리글리세라이드 오일을 나타내는 4% 코코넛 및 4% 카놀라 오일이 0.5% 당밀을 갖는 공급 원료로 사용되는 것을 제외하고는 실시예 7에 도시된 것과 동일하다. 발효는 RL 농도 88 g/L로 32시간 내에 완료되므로, RL 생산성은 2.8 g/L/h이다.
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Claims (20)

  1. 하기의 단계를 포함하는 하나 이상의 람노리피드(RL)를 포함하는 복수의 발효물을 생산하는 반-연속식(semi-continuous) 방법:
    (a) 람노리피드 생산 미생물을 2종 이상의 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 1종 이상의 탄소 공급원은 감미제이고 1종 이상의 탄소 공급원은 중쇄(medium chain) 또는 장쇄(long chain) 트리글리세라이드를 포함하는 오일이고, 1종 이상의 질소 공급원, 1종 이상의 인(phosphorous) 공급원, 1종 이상의 마그네슘 공급원, 1종 이상의 칼륨 공급원, 1종 이상의 황 공급원, 1종 이상의 클로라이드(chloride) 공급원, 및 1종 이상의 나트륨 공급원을 포함하는 배양 배지에서 및 선택적으로 유화제의 존재하에 약 1일 이상 동안 람노리피드 생산 미생물을 배양하고, 하나 이상의 람노리피드(RL) 및 하나 이상의 람노리피드 생산 미생물을 포함하는 람노리피드를 포함하는 첫번째 발효 배지를 수득하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 수득한 첫번째 발효 배지의 약 70% 이상을 제거하는 단계;
    (c) (b)에서 제거한 첫번째 발효 배지를 단계 (a)에서 제시된 조성을 갖는 배양 배지로 교체하는 단계;
    (d) 단계 (a)-(c)를 1회 이상 반복하여 람노리피드 및 하나 이상의 람노리피드 생산 미생물을 포함하는 그 다음 발효 배지를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)는 약 1.7g RL/L/h 이상을 생성 및/또는 상기 방법은 약 40g RL/L 이상을 생성하는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 람노리피드 생산 미생물은 단계 (a)에서 약 1일 내지 약 4일 동안 배양되는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 일일 총 발효량의 0.1% v/v에서 20mg/L 이하의 미량 영양소 용액 농도로 하나 이상의 미량 영양소를 포함하는 조성물을 단계 (a)의 상기 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효 배지는 교반 및 공기 흐름을 유지하면서 단계 (b)에서 제거되는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 발효 배지는 교반 및 산소가 풍부한 공기의 흐름을 유지하면서 단계 (b)에서 제거되는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 단계 (b) 사이에 침강(sedimentation) 단계가 없는 것인, 방법.
  8. 2종 이상의 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 람노리피드 생산 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 하나 이상의 람노리피드의 제조 방법에 있어서, 상기 탄소 공급원은 감미제 및 중쇄(medium chain) 또는 장쇄(long chain) 트리글리세라이드를 함유하는 오일, 1종 이상의 질소 공급원, 1종 이상의 인 공급원, 1종 이상의 마그네슘 공급원, 1종 이상의 칼륨 공급원, 1종 이상의 황 공급원, 1종 이상의 클로라이드 공급원, 1종 이상의 나트륨 공급원 및 선택적으로 유화제를 포함하는 배양 배지에서 약 1일 이상 동안 배양하여 약 40 g/L 이상의 역가 및/또는 약 1.5g RL/L/hr 이상의 비율로 람노리피드를 수득하는 단계 및 선택적으로 상기 배양 배지로부터 상기 하나 이상의 람노리피드를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배양 배지는 미량 영양소가 없는 것인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 배양은 반-연속식(semi-continuous) 발효법, 회분식(Batch) 발효법 또는 유가식(Fed-batch) 발효법을 사용하여 수행되는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배양은 제1항의 반-연속식 발효법을 사용하여 수행되는 것인, 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 람노리피드 생산 미생물은 슈도모나스(Psuedomonas) 미생물인 것인, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 배양 배지는 상기 배양 배지 중에 약 0.1 중량% 내지 약 2.0 중량% 사이의 각 감미제 w/v 및/또는 상기 배양 배지 중에 약 3-15 중량% 사이의 각 오일을 포함하는 것인, 방법.
  14. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 감미제는 비정제 감미제 및/또는 상기 오일은 식물성 오일인 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 비정제 감미제는 수액, 하나 이상의 뿌리, 과일, 하나 이상의 종자, 하나 이상의 나무 또는 하나 이상의 동물로부터 유래된 것인, 방법.
  16. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 감미제는 당밀, 쌀 또는 보리 맥아 시럽, 넥타, 야콘 시럽, 사탕무 시럽, 수수 시럽 중 적어도 하나 및/또는 상기 오일은 콩 오일, 잇꽃 오일(safflower oil), 땅콩 오일, 대마 오일, 자트로파 오일(jatropha oil), 코코넛 지방, 호리병박 오일(calabash oil), 아마씨 오일, 옥수수 오일, 양귀비씨 오일, 달맞이꽃 오일, 올리보 오일, 팜 커넬 오일, 팜 오일, 유채 오일, 참기름, 해바라기 오일, 포도씨 오일, 호두 오일, 밀 배아 오일, 코코넛 오일 또는 중쇄 트리글리세라이드 오일 중 적어도 하나인 것인, 방법.
  17. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 람노리피드 생산 미생물은 3종 이상의 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양되는 것으로서, 상기 탄소 공급원에서 2종 이상의 탄소 공급원은 감미제이고 1종 이상의 탄소 공급원은 중쇄(medium chain) 또는 장쇄(long chain) 트리글리세라이드를 포함하는 오일인 것인, 방법.
  18. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 람노리피드 생산 미생물은 3종 이상의 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양되는 것으로서, 상기 탄소 공급원에서 2종 이상의 탄소 공급원은 비정제 감미제이고 1종 이상의 탄소 공급원은 중쇄(medium chain) 트리글리세라이드를 포함하는 오일인 것인, 방법.
  19. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 람노리피드 생산 미생물은 4종 이상의 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양되는 것으로서, 상기 탄소 공급원에서 2종 이상의 탄소 공급원은 중쇄(medium chain) 또는 장쇄(long chain) 트리글리세라이드를 포함하는 오일이고 2종 이상의 탄소 공급원은 감미제인 것인, 방법.
  20. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 람노리피드 생산 미생물은 4종 이상의 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양되는 것으로서, 상기 탄소 공급원에서 1종 이상의 탄소 공급원은 중쇄(medium chain) 트리글리세라이드를 포함하는 오일이고, 탄소 공급원 중 하나는 장쇄(long chain) 트리글리세라이드를 포함하는 오일이고 및 2종 이상의 탄소 공급원은 비정제 감미제인 것인, 방법.
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