BR112020001484A2

BR112020001484A2 - produção aperfeiçoada de ramnolipídeos usando pelo menos duas fontes de carbono

Info

Publication number: BR112020001484A2
Application number: BR112020001484-2A
Authority: BR
Inventors: Nattaporn Lohitharn
Original assignee: Logos Technologies, Llc
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2020-07-21
Also published as: MX2020001213A; US11142782B2; CA3071627A1; JP7418321B2; US20210403969A1; EP3662075A4; EP3662075A1; WO2019027878A1; JP2020529203A; CN110997927A; US20190040433A1; AU2018309664A1; ZA202001150B; AU2018309664B2; KR20200027520A

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para aperfeiçoamento de rendimento de ramnolipídeos compreendendo meio de cultura contendo um óleo contendo triglicerídeo e adoçante como uma fonte de carbono.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃO APERFEIÇOADA DE RAMNOLIPÍDEOS USANDO PELO MENOS DUAS FONTES DE CARBONO".

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado para produção de ramnolipídeos (RLs) compreendendo cultura de um micro-organismo produzindo ramnolipídeo em um meio compreendendo pelo menos duas fontes de carbono, em particular, um óleo contendo triglicerídeo e adoçante.

ANTECEDENTES

[0002] Devido a crescentes conceitos ambientais, biotensoativos ganharam muita atenção do público e consumidores. Uma principal busca após biotensoativos são ramnolipídeos (RL) porque eles têm alta habilidade para espuma, limpeza, dispersão, emulsificação e baixas tensões superficiais [1,2]. Ramnolipídeos são glicolipídeos de interface ativa contendo carboidratos (ramnose) e ácidos alifáticos (ácidos hidróxi graxos). Eles contêm uma (mono ramnosilipídeos ou mono ramnolipídeos) ou duas unidades ramnose (di-ramnosilipídeos nou di-ramnolipídeos) e um ou dois (predominantemente dois) resíduos de ácido 3-hidróxi graxo. Ramnolipídeos são predominantemente produzidos através de uma fermentação aeróbica de Pseudomonas aeruginosa. Outras espécies Pseudomonas e E. coli também foram reportadas produzirem ramnolipídeos mas seus rendimentos têm um título e produtividade muito menores que P. aeruginosa [3].

[0003] De modo que ramnolipídeos (RL) possam competir com tensoativos sintetizados baseados em petróleo tais como laureth sulfato de sódio (SLES) e lauril sulfato de sódio (SLS ou SDS), o custo de produção de RL tem de diminuir significantemente. Otimização de método e desempenho de fermentação estão entre os principais condutores de custo. Um número de abordagens incluindo diferentes estoques de alimentação, linhagens geneticamente modificadas e estratégias de fermentação foram realizadas para aumentar produtividade título de RL. Banat et al. [4] e Kaskatepe et al. [5] têm extensivas revisões sobre a produção de biotensoativo usando estoque de alimentação de baixo custo (isto é, corrente de despejo de agriculturas e várias indústrias). Uma vez que ramnolipídeos contêm uma metade ramnose (açúcar) e cauda de ácido 3-hidróxi graxo, vários pesquisadores tentaram usar melaços como o único estoque de alimentação de carbono. Nenhum deles mostrou a concentração de ramnolipídeos > 6 g/L com concentrações de melaços de 2-10% [6-9]. Óleo vegetal, por outro lado, tem sido usado para produzir ramnolipídeo em uma concentração maior comparado ao estoque de alimentação de melaços. Ninguém assim combinou ambos estoques de alimentação para a produção de RL. Um resumo do desempenho de fermentação para produção de RL com óleo vegetal é mostrado na Tabela 1. Tabela 1: Desempenho de fermentação de P. aeruginosa com diferentes tipos de óleo vegetal Fonte de Tipo de concentra- Tempo de Produtivida Referên- carbono fermentação ção de RL fermenta- de de RL cia (g /L) ção (h) (g/L/h) Óleo de soja Alimentação 95 216 0,44 [10] – batelada Óleo de milho Batelada 27 120 0,23 [11] Óleo de palma Batelada 71 144 0,49 [12] Óleo de Batelada 27 72 0,38 [11] girassol Óleo de soja Alimentação 65 90 0,72 [13]* – batelada *controle de pH em 7-7,5 nas primeiras 24 horas então em 6-6,5 após

[0004] Embora a patente US No. 5 501 966 [10] tenha reivindicado um método de alimentação de batelada produzindo RL tão alto quanto

112 g RL/L em 11 dias (264 h) de fermentação e assim, a produtividade de RL calculada é somente 0,42 g de RL/L/h que é considerada baixa. A produtividade (g RL/L/h) é um parâmetro de método muito importante uma vez que ele representa quão rápido os ramnolipídeos podem ser produzidos a partir de um certo volume de fermentação. Quanto maior a produtividade de RL, mais barato o custo de produção de RL.

SUMÁRIO

[0005] É provido um meio para aperfeiçoar a produção de através de introdução de uma adição de um adoçante (por exemplo, um adoçante ou açúcar não refinado) a um meio contendo óleo ou triglicerídeos de cadeia longa (por exemplo, óleo de coco ou óleo vegetal) ou uma combinação dos dois óleos e assim, reduzindo a síntese de novo de ramnoses a partir de ácidos graxos. Isto resulta em um tempo de fermentação mais curto e assim, um aperfeiçoamento em produtividade de RL (g RL/L/h).

[0006] É também provido um método semicontínuo para produção de uma pluralidade de fermentações compreendendo um ou mais ramnolipídeos (RL) compreendendo: (a) cultura de um micro- organismo produzindo ramnolipídeo em meio de cultura compreendendo pelo menos duas fontes de carbono, onde pelo menos uma fonte de carbono é um adoçante e pelo menos uma fonte de carbono é um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média ou longa, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de magnésio, pelo menos uma fonte de potássio, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de cloreto, e pelo menos uma fonte de sódio, por pelo menos cerca de 1 dia e mais particularmente entre cerca de 1 dia a cerca de 4 dias, mesmo mais particularmente entre cerca de 1 a cerca de 3 dias e ainda mesmo mais particularmente entre cerca de 1 a cerca de 2 dias para obter um primeiro meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos (RL) e um ou mais micro-organismos produzindo ramnolipídeos, rendendo RL em uma razão de pelo menos cerca de 1,5 g RL/L/h, particularmente, cerca de 1,7 g de RL/L/h e mais particularmente pelo menos cerca de 1,8 RL/L/h e mesmo mais particularmente rendendo entre cerca de 1,8 g de RL/L/h a cerca de 3,0 g de RL/L/h e ainda mesmo mais particularmente entre cerca de 1,8 g de RL/L/h a cerca de 2,7 g de RL/L/h; (b) remoção de pelo menos cerca de 70% do dito primeiro meio de fermentação obtido em (a), que em uma modalidade particular , ocorre durante agitação e enquanto mantendo fluxo de ar, onde em uma particular modalidade, o dito fluxo de ar é mantido com ar enriquecido com oxigênio, em um recipiente contendo o dito meio de fermentação; (c) substituição de dito primeiro meio de fermentação removido em (b) com meio de cultura tendo a composição mostrada em etapa (a) e (d) repetindo etapas (a)-(c) pelo menos uma vez para obter uma subsequente fermentação compreendendo ramnolipídeos, onde as ditas etapas (a)- (c) são capazes de serem repetidas por pelo menos cerca de 20 dias e mais particularmente por pelo menos cerca de 30 dias.

[0007] Em uma modalidade, o método ainda pode compreender adição de uma composição compreendendo um ou mais micronutrientes em uma concentração de 0,1-0,2% v/v de volume de fermentação total por dia. Ainda em uma outra modalidade particular, pelo menos cerca de 40 g de RL/L são obtidos usando o dito método. Ainda em uma outra modalidade particular, 50 g de RL/L são obtidos; em uma modalidade mesmo mais preferida, pelo menos cerca de 55g de RL/L são obtidos; ainda em uma outra modalidade particular, pelo menos 60 g de RL/L são obtidos; em uma modalidade mesmo mais particular, pelo menos cerca de 65 g de RL/L são obtidos; ainda em uma modalidade mesmo mais particular, pelo menos cerca de 70 g de

RL/L são obtidos; ainda em uma modalidade mesmo mais preferida, pelo menos cerca de 80 g de RL/L são obtidos; em ainda uma modalidade mais particular, pelo menos cerca de 90 g de RL/L são obtidos. Em uma modalidade mesmo mais particular entre cerca de 40 g de RL/L e 110 g de RL/L são obtidos.

[0008] É também provido um método para produção de um ou mais ramnolipídeos compreendendo cultura de um micro-organismo produzindo ramnolipídeo em meio de cultura compreendendo pelo menos duas fontes de carbono, onde pelo menos uma fonte de carbono é um adoçante não refinado e pelo menos uma fonte de carbono é um óleo vegetal, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de magnésio, pelo menos uma fonte de potássio, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de cloreto, pelo menos uma fonte de sódio e opcionalmente pelo menos um emulsificante por pelo menos cerca de 1 dia que rende um título de pelo menos cerca de 40 g de RL/L, mais particularmente pelo menos cerca de 50 g RL/L; mesmo mais particularmente, pelo menos cerca de 55 g de RL/L; ainda mesmo mais particularmente, pelo menos cerca de 60 g de RL/L, ainda mesmo mais particularmente, pelo menos cerca de 70 g de RL/L; mesmo ainda mais particularmente, pelo menos cerca de 80 g de RL/L; mesmo ainda mais particularmente, pelo menos cerca de 90 g de RL/L são obtidos ou alternativamente entre cerca de 40 g de RL/L a cerca de 110 g de RL/Le/ou em uma taxa de pelo menos cerca de 1,5 g de RL/L/h. O método ainda pode compreender isolamento de dito ramnolipídeo(s) de dito meio de fermentação contendo ramnolipídeo. Em uma particular modalidade, o meio de cultura é livre de micronutriente. Este meio de cultura pode ser usado em uma fermentação semicontínua, particularmente o método semicontínuo mostrado acima, assim como fermentações em bateladas e de alimentação em bateladas. Os ramnolipídeos podem ser isolados e purificados usando-se métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a patente US No. 9 884 882 e pedido de patente ser. No. 1561 1045, depositado em 1 de junho de 2017).

DEFINIÇÕES

[0009] Onde é provida uma faixa de valores, é entendido que cada valor interveniente, para o décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente dite de outro modo, entre o limite superior e inferior daquela faixa e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente naquela faixa estabelecida está abrangido dentro da invenção. Os limites superiores e inferiores destas faixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas menores e também são abrangidos dentro da invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos limites, faixas excluindo qualquer ou ambos daqueles limites excluídos também são incluídos na invenção.

[0010] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos também possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, o preferidos métodos e materiais são agora descritos.

[0011] Todas as publicações e patentes citadas nesta exposição são incorporadas por referência em suas totalidades. Nada aqui é para ser construído como uma admissão deque a invenção não é intitulada para preceder tal exposição em virtude da invenção anterior. Para a extensão em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com este relatório descritivo, o relatório descritivo suplantará qualquer tal material.

[0012] Deve ser notado que como aqui usadas e nas reivindicações apostas, as formas singulares "um”, "e” e "o” incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo.

[0013] A menos que de outro modo indicado, o termo "pelo menos” precedendo uma série de elementos é para ser entendido para referir- se a todo elemento nas séries. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as específicas realizações da invenção aqui descrita. Tais equivalentes são pretendidos serem abrangidos pela presente invenção. Por todo este relatório descritivo e as reivindicações que se seguem, a menos que o contexto requeira de outro modo, a palavra "compreende”, e variações tais como "compreende” e "compreendendo”, será entendida implicar a inclusão de um estabelecido inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas. Assim, os termos "compreendendo”, "incluindo”, "contendo”, "tendo”, etc, deve ser lido expansivamente ou de extremidade aberta e sem limitação. Quando aqui usado, o termo "compreendendo” pode ser substituído com o termo "contendo” ou algumas vezes quando aqui usado com o termo "tendo”.

[0014] Como aqui definido, um "adoçante” é uma substância que adoça um produto comestível.

[0015] Como aqui definido, "um adoçante não refinado” é um adoçante contendo água e açúcar como um subproduto de processamento de açúcar mas não sofreu o método de refino. Ele pode ser extraído diretamente de incluindo mas não limitado a seiva, raízes (por exemplo, batatas, batatas doces, beterrabas, particularmente beterraba sacarina), néctares, flores, folhas, frutos, cana, árvores, caules.

[0016] Como aqui definido, um "adoçante refinado” é um adoçante que sofreu um método de refino usando métodos conhecidos na técnica.

[0017] Como aqui definido, um "emulsificante” é um tipo de tensoativo tipicamente usado para manter emulsões (misturas metastáveis de fluidos imiscíveis) bem dispersas. Emulsificantes tipicamente têm uma metade hidrofóbica (afastando água) e uma hidrofílica (afetuosa com água). Em uma emulsão envolvendo um óleo e água, emulsificantes circundarão o óleo com sua metade hidrofóbica orientada na direção de óleo, assim formando uma camada protetora de modo que as moléculas de óleo não podem coalescer. Esta ação auxilia a manter a fase dispersa em partículas pequenas e preserva a emulsão. Emulsificantes podem ser aniônicos, não iônicos ou catiônicos.

[0018] Como aqui definido, "um triglicerídeo de cadeia média” contém entre ácidos graxos tendo uma cauda alifática de 6-12 átomos de carbono.

[0019] Como aqui definido, "um triglicerídeo de cadeia longa” contém ácidos graxos tendo uma cauda alifática de mais que 13 átomos de carbono.

[0020] Como aqui definido, um "óleo vegetal” contém misturas de triglicerídeos derivados de uma planta ou sua parte.

[0021] Como aqui definido, um "ramnolipídeo” refere-se a um glicolipídeo que tem uma porção lipídeo que inclui uma ou mais, metades ácido β-hidróxi carboxílico saturado ou insaturado, tipicamente linear e uma porção sacarídeo de uma ou mais unidades de ramnose. A porção sacarídeo e a porção lipídeo estão ligadas via uma ligação β-glicosídica entre o grupo 1-OH de uma metade ramnose da porção sacarídeo e o grupo 3-OH de um ácido β-hidróxi carboxílico da porção lipídeo. Assim o grupo carboxílico de uma metade ácido carboxílico define a extremidade do ramnolipídeo. Onde mais de uma metade ramnose é incluída em um ramnolipídeo, cada uma das metades ramnose não ligadas à porção lipídeo está ligada a uma outra metade ramnose via uma ligação 1,4-β-glicosídica. Em realizações onde dois ou mais ácidos β-hidróxi carboxílicos estão presentes em um ramnolipídeo, as metades ácido β-hidróxi carboxílico são selecionadas independentemente umas das outras. Metades ácido β- hidróxi carboxílico de uma respectiva pluralidade de metades de ácido β-hidróxi carboxílico em algumas realizações podem ser idênticas. Em algumas realizações elas são diferentes umas das outras.

[0022] Como aqui definida, uma "composição micronutriente” é uma composição compreendendo um micronutriente presente em uma quantidade de não mais que cerca de 20 mg/L.

[0023] Os termos "meio de cultura”, "meio de fermentação” são sinônimos e são usados intercambiavelmente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] A Figura 1 mostra tendências de pH de fermentação com e sem mudança de adição de melaços.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0025] É aqui provido um método aperfeiçoado para produção deramnolipídeos. Em uma particular modalidade, o ramnolipídeo pode ter a estrutura (I).

[0026] onde m = 2, 1 ou 0, em particular 1 ou 0, n = 1 ou 0, ou em particular 1, R1 e R2 = independentemente um do outro um radical orgânico idêntico ou diferente com 2 a 24, preferivelmente 5 a 13, átomos de carbono, em particular radical alquila opcionalmente ramificado, opcionalmente substituído, em particular substituído com hidroxila, opcionalmente insaturado, e particularmente opcionalmente mono-, di- ou tri-insaturado, preferivelmente um selecionado do grupo consistindo em pentenila, heptenila, nonenila, undecenila, e tridecenila e (Cl3/4)o-Cl3/43, onde o = 1 a 23, preferivelmente 4 a 12.

[0027] Ambas, a cadeia principal assim como as ramificações além disso podem conter heteroátomos como, por exemplo, N, O, S, Se ou Si ou um átomo de carbono pode ser substituído por um destes heteroátomos. Uma metade alifática pode ser substituída ou não substituída com um ou mais grupos funcionais. Substituintes podem ser quaisquer grupos funcionais, como, por exemplo, mas não limitados a, amino, amido, carbonila, carboxila, hidroxila, nitro, tio, e sulfonila. Micro-organismo produzindo ramnolipídeo

[0028] Como notado acima, o método compreende cultura de um micro-organismo produzindo ramnolipídeo. Um micro-organismo produzindo ramnolipídeo pode ser uma célula hospedeira produzindo ramnolipídeos. Uma célula hospedeira recombinante produzindo ramnolipídeos pode ser uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana que expressa um gene Rh1A ou seu ortólogo e/ou um gene Rh1B ou seu ortólogo, e/ou um gene Rh1C ou seu ortólogo, e/ou gene Rh1R ou seu ortólogo, e/ou gene Rh11 ou seu ortólogo, e/ou gene Rh1G ou seu ortólogo e outros.

[0029] Alternativamente, um "micro-organismo produzindo ramnolipídeo” pode ser qualquer micro-organismo, tais como bactérias, que têm a capacidade para sintetizar / produzir ramnolipídeos sob condições apropriadas que incluem mas não são limitadas a bactéria da fila Actinobactéria, Fimicutes e Proteobactérias. Em uma particular modalidade, o micro-organismo produzindo ramnolipídeo é uma bactéria da classe Gammaproteobactetria. Ainda em uma modalidade, o micro-organismo produzindo ramnolipídeo é uma bactéria da ordem Pseudomonadales. Ainda em uma outra modalidade, o micro-organismo produzindo ramnolipídeo é uma bactéria da família Pseudomonadacae. Ainda em uma modalidade, o micro-organismo produzindo ramnolipídeo é uma bactéria do gênero Pseudomonas, tal como P. alcaligenes, P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. c1emancea, P. collierea, P. fluorescens, P. luteola, P. putida, P. stutzeri e P. teessidea. Ainda em uma modalidade, o micro-organismo produzindo ramnolipídeo é P. aeruginosa. Meio de cultura (fermentação)

[0030] O micro-organismo contendo ramnolipídeo é cultivado em meio de cultura (também referido como fermentação). O dito meio de cultura compreende pelo menos duas fontes de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de sódio, pelo menos uma fonte de magnésio, pelo menos uma fonte de potássio, pelo menos uma fonte de enxofre e pelo menos uma fonte de cloreto.

[0031] A fonte de carbono, em uma modalidade particular , pode ser um adoçante e um óleo contendo um ou mais triglicerídeos de cadeia média e/ou cadeia longa (também aqui referidos como óleo triglicerídeo contendo cadeia média e óleo triglicerídeo contendo cadeia longa respectivamente). Em uma modalidade mais particular, cada adoçante pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 2% peso /volume e/ou cada óleo pode estar presente na quantidade de cerca de 3% a cerca de 15% peso/peso, particularmente, entre cerca de 4% a cerca de 10% peso/peso, e mais particularmente, entre cerca de 6% e cerca de 12% peso/peso.

[0032] O adoçante pode ser um adoçante refinado ou não refinado. Exemplos de adoçantes refinados podem incluir mas não são limitados a sacarose (açúcar de mesa) e stevia. O adoçante não refinado pode ser derivado de processamento de açúcar e/ou de seiva, uma ou mais raízes, fruto, uma ou mais sementes, um ou mais néctares, uma ou mais flores, uma ou mais folhas, uma ou mais árvores, um ou mais caules, e/ou um ou mais animais. Em uma modalidade mais particular, o dito adoçante não refinado usado pode ser pelo menos um de melaços, xarope de malte de cevada ou arroz, néctar, xarope yacon, xarope de beterraba sacarina, xarope de milho, xarope de sorgo, xarope de ácer, açúcar de palma, ou adoçante derivado de batatas ou batatas doces. Em uma modalidade mais particular, o adoçante não refinado é melaços. Em uma outra modalidade, a fonte de carbono ainda pode compreender um monossacarídeo, por exemplo, glicose, um dissacarídeo, por exemplo, sacarose, um álcool de açúcar, por exemplo, glicerol, um alcano de cadeia longa, por exemplo, n- hexadecano, um ácido graxo tal como ácido caprílico (também chamado ácido octanóico), ou suas misturas, ácidos orgânicos (por exemplo, ácido lático, ácido acético, ácido cítrico, ácido propiônico),

álcoois (por exemplo, etanol) e misturas destes.

[0033] Em uma modalidade particular, o óleo é óleo contendo triglicerídeo de cadeia média que pode ser óleo triglicerídeo de cadeia média comercialmente disponível, que pode conter uma mistura de óleo de coco, óleo de palma e/ou outros triglicerídeos de cadeia média (por exemplo, contendo ácido caprílico), óleo de coco ou óleo de palma. O triglicerídeo de cadeia longa pode ser óleo de soja, óleo de canola, óleo de girassol, óleo de açafrão, óleo de amendoim, óleo de semente de cânhamo, óleo de jatropha, óleo de cabaça, óleo de semente de linho, óleo de milho, óleo de semente de papoula, óleo de enótera, óleo de oliva. Em uma modalidade, o triglicerídeo de cadeia longa contém ácidos graxos tendo uma cauda alifática de mais que 13 átomos de carbono; em uma particular modalidade, ele contém ácidos graxos tendo uma cauda alifática de entre 13-21 átomos de carbono.

[0034] Em uma modalidade particular , o óleo pode ser um óleo vegetal. O óleo vegetal pode ser óleo de soja, óleo de açafrão, óleo de amendoim, óleos de semente de cânhamo, óleo de canola, óleo jatropha, óleo de cabaça, óleo de linhaça, óleo de milho, óleo de semente de papoula, óleo de enótera, óleo de oliva, óleo de centro de palma, óleo de palma, óleo de semente de colza, óleo de sésamo, óleo de girassol, óleo de semente de uva, óleo de noz, óleo de germe de trigo, ou uma combinação de óleos vegetais.

[0035] Em uma modalidade mais particular, o triglicerídeo de cadeia longa pode ser um óleo vegetal e o adoçante pode ser um adoçante não refinado.

[0036] Em uma outra modalidade particular, o triglicerídeo de cadeia média ou longa pode ser um óleo vegetal onde o dito óleo vegetal é óleo de milho, óleo de canola ou óleo de soja ou um triglicerídeo de cadeia média onde o triglicerídeo de cadeia média é óleo de coco e o adoçante é um adoçante não refinado que pode ser melaços, xarope de beterraba sacarina ou xarope de sorgo.

[0037] Em uma particular modalidade, o meio de cultura pode compreender pelo menos três fontes de carbono, onde pelo menos duas das fontes de carbono são adoçantes e pelo menos uma fonte de carbono é um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média ou longa. Em uma modalidade mesmo mais particular, pelo menos duas das fontes de carbono são adoçantes não refinados e pelo menos uma fonte de carbono é um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média, por exemplo, óleo de coco.

[0038] Em uma outra modalidade particular, o meio de cultura compreende pelo menos quatro fontes de carbono, onde pelo menos duas das fontes de carbono são óleos contendo triglicerídeos de cadeia média ou longa e pelo menos duas fontes de carbono são adoçantes. Em uma modalidade mais particular, pelo menos uma das fontes de carbono é um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média (por exemplo, óleo de coco), uma das fontes de carbono é um óleo contendo triglicerídeos de cadeia longa (por exemplo, óleo vegetal tal como óleo de canola) e pelo menos duas fontes de carbono são adoçantes não refinados (por exemplo, melaços, xarope de sorgo, xarope de beterraba sacarina).

[0039] A fonte de nitrogênio pode ser sulfato de amônio, fosfato de amônio, ureia, extrato de levedura, extrato de carne, peptona, e licor de infusão de milho. Em uma modalidade particular , a fonte de nitrogênio é NaNO3. Ainda em uma outra modalidade, o nitrogênio pode estar presente na quantidade de cerca de 5-20 g/L.

[0040] A fonte de fósforo pode, em uma particular modalidade, ser H3PO4 ou K2HPO4. Ainda em uma outra modalidade particular, o dito fósforo está presente na quantidade de cerca de 1-15 g/L.

[0041] O íon de magnésio, em uma modalidade particular, pode ser MgSO4*7H2O e/ou MgCl2. Em uma modalidade particular, o magnésio está presente na quantidade de cerca de 0,2-2 g/L.

[0042] O potássio pode ser KCl e/ou KOH. Em uma modalidade particular, o potássio está presente na quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 2 g/L.

[0043] O sódio pode ser NaCl, NaNO3, e NaOH. Em uma modalidade particular, o dito íon de sódio está presente na quantidade de cerca de 1-15 g/L.

[0044] O cloreto pode ser KCl e NaCl. Em uma modalidade particular, o dito íon de cloreto está presente na quantidade de cerca de 0,1 – 1 g/L.

[0045] O enxofre pode ser H2SO4. Em uma modalidade particular, o dito íon enxofre está presente na quantidade de cerca de 0,1-1 g/L.

[0046] As fontes de enxofre e cloreto podem ser derivadas da corrente de despejo de camada aquosa, ou também referida como a fase líquida aquosa ou fase aquosa de um caldo de fermentação clarificado tratado com ácido obtenível usando procedimentos descritos na patente US 9.884.883. Em uma específica modalidade, os ramnolipídeos precipitam de solução a partir de um caldo de fermentação clarificado tratado com ácido e forma uma fase sólida e uma fase líquida oleosa no fundo e uma fase líquida aquosa é gerada na parte superior do vaso usado para esta etapa. A fase líquida aquosa é removida usando procedimentos conhecidos na técnica e em uma específica modalidade usando métodos mostrados acima (por exemplo, filtração, ou centrifugação ou deposição combinada com decantação). A camada aquosa mencionada acima é uma fonte de enxofre ou cloreto (dependendo do tipo de ácido usado durante este ajuste de pH de cerca de 1,5 a 2,5, preferencialmente, cerca de 2,05 a cerca de 2,15 e é uma fonte de micronutrientes.

[0047] O meio de cultura ainda pode compreender um emulsificante. Em uma modalidade particular, o emulsificante pode incluir mas não é limitado a goma arábica, goma guar, e ramnolipídeos. Ainda em uma outra modalidade particular, a razão de emulsificante para fonte de carbono no dito meio de cultura está entre cerca de 0,1% a cerca de 20% peso/peso. Ainda em uma outra modalidade particular, o dito emulsificante pode estar presente na quantidade de cerca de 0,1-2% em peso.

[0048] Em uma modalidade particular, o meio de cultura ou fermentação é esterilizado usando métodos conhecidos na técnica. Estes métodos podem ser baseados em filtração, baseados em calor, baseados em química ou baseados em radiação de luz ultravioleta. Em uma modalidade particular, o tratamento baseado em calor pode ser via esterilização térmica úmida, particularmente autoclavagem.

[0049] Em uma modalidade, o meio de cultura (por exemplo, meio de fermentação) pode ser esterilizado através de um dos procedimentos acima. Em uma outra modalidade, os meios de fermentação podem ser esterilizados através de mais de um dos procedimentos mostrados acima e estas esterilizações podem estar em qualquer ordem. Ele pode ser esterilizado na fermentação durante o primeiro ciclo de fermentação mas pode ser esterilizado em um outro vaso em ciclos subsequentes. Composição micronutriente

[0050] Como notado acima, o dito método ainda pode compreender adição de uma solução ou composição micronutriente. O dito micronutriente pode ser um traço de Fe, Mn, Zn, Cu, Na. Em uma modalidade particular, o dito micronutriente é um sal de Fe, Mn, Zn, Na ou Cu. Em uma modalidade mais particular a dita composição micronutriente compreende sais de Fe, Mn, Zn, Na e Cu. A composição pode ser esterilizada por filtração.

[0051] Em modalidades particulares, o dito sal de Cu é pelo menos um de CuCL12*2H2O e CuSO4*5H2O e pode estar presente na quantidade de cerca de 0,5-3g/L de solução micronutriente; o dito sal de Mn é pelo menos um de MnSO4*H2O e MnCl2*4H2O e pode estar presente na quantidade de cerca de 0,1-2 g/L de solução micronutriente; o dito sal de Zn é ZnSO4*7H2O ou ZnCh e pode estar presente na quantidade de cerca de 0,5-3 g/L de solução micronutriente; o dito sal de Fe é pelo menos um de FeCl3*6H2O ou FeSC”4 e pode estar presente na quantidade de cerca de 0,1-1 g/L de solução micronutriente; o dito sal de sódio é Na3C6H5O7●2H2O e pode estar presente na quantidade de cerca de 1-5 g/L de solução micronutriente.

EXEMPLOS Exemplo 1: Fermentação semicontínua de óleo de soja 6% de ramnolipídeos com aditivo de melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurados e goma arábica como um emulsificante

[0052] A fermentação de ramnolipídeos é realizada em um vaso fermentador de 10 L (Labfors 5, Infors HT, Switzerland) com volume de trabalho de 7,5 L. Os meios de fermentação contêm óleo emulsificado e solução nutriente em um balanço de água deionizada (DI). Primeiro, 1,5 L de óleo de soja emulsificado 8% com goma Arábica 0,8% usada como emulsificante é preparado usando um misturador de cozinha. Com adição de melaços (melaços de mel de cana livre de enxofre, Golden Barrel, USA), melaços são adicionados no óleo emulsificado em 1%, 0,5% ou 0,25% peso/volume antes de esterilização em uma autoclave a 1212oC por 50 minutos. Após resfriamento para 37oC, solução nutriente filtrada esterilizada em 0,2 micron contendo 9,69 g/L de H3PO4 85%, 5,21 g/L de NaOH, 1 g/L MgSO4*7H2O, 1 g/L de KCl e 15 g/L de NaNO3 é adicionada. Todos os compostos químicos são pelo menos 99% de pureza exceto H3PO4 85%. H2SO4 é usado para ajustar o pH dos meios de fermentação para 6,3 antes de inoculação com cultura R4 2,5% obtida de Exemplo 3 de pedido de patente US No.

1561 1045, depositado em 1 de junho de 2017.

[0053] A Fermentação é conduzida a 37oC, 0,14 vvm de taxa de alimentação de ar e 300-650 rpm de velocidade de agitação para manter o oxigênio dissolvido (DO) pelo menos 15%. Quando a velocidade de agitação atinge 650 rpm mas % de DO está ainda abaixo de 15%, oxigênio puro é adicionado junto com ar para manter constante a taxa de fluxo de gás total (0,14 vvm). Aproximadamente 20% de composição de elementos em microtraços preparados de acordo com um Exemplo 2 listado em pedido de patente US 15/146 508, publicado como US 2016 0326561 é continuamente adicionada no fermentador em 80 mL/dia usando uma bomba peristáltica. Antiespumante baseado em silício (Snapsil FD30, BRB, Netherlands) é automaticamente adicionado para diminuir a espuma durante a fermentação. A fermentação ocorre sem controle de pH a menos que o pH exceda 7,9. Neste ponto, H2SO4 25% é automaticamente adicionado para controlar o pH em 7,9.

[0054] Após a fermentação ser completada, cerca de 77% de caldo de fermentação (5,8 L) é retirado enquanto mantendo % de DO em 15% (isto é, agitação e alimentação de gás ainda existem) usando uma bomba. 5,8 L recentemente esterilizados de meios de cultura de óleo emulsificado 8% preparados em um recipiente separado como mencionado no primeiro parágrafo deste exemplo são alimentados no fermentador como um novo estoque de alimentação. Este método chamado "Retirar e Encher (DF)” é mostrado em pedido de patente US 15/146 508, publicado como US2016 0326561. O primeiro de caldo de fermentação 77% removido do fermentador após inoculação é referido como batelada DF0. Subsequentemente, o seguinte caldo de fermentação sendo retirado do fermentador após o DF0 é chamado DF1 e assim por diante.

[0055] Uma tendência de pH sobre o curso de fermentação para

DF1 (nenhum melaço), DF5, 6 e 7 (0,5% de adição de melaços) mostrada em Figura 1 demonstra um padrão de 3fases de mudanças de pH. Primeiro, o pH aumenta rapidamente no início da fermentação. Segundo, o pH permanece estável ou diminui levemente antes de atingir a 3a fase na qual o pH novamente aumenta. A 2a fase é encurtada com adição de melaços. Na 3a fase, o pH aumenta rapidamente junto com um aumento em % de DO enquanto a agitação e fluxo de ar permanecem constantes o que indica que a fermentação está completa. Sobrenadante claro sem camada de óleo na parte superior é obtido após o caldo de fermentação removido ser centrifugado em 9500 rpm por 10 minutos ou 14000 rpm em 5 minutos. O sobrenadante de RL claro obtido de cada DF é então esterilizado e centrifugado novamente para obter caldo clarificado (CB) que é filtrado em 0,2 mícron antes de ser diluído com água DI pelo menos 100-200 vezes dependendo da concentração de partida do material. As amostras diluídas são então injetadas em HPLC-ELSD (detalhes de metodologia mostrados no Exemplo 2) para quantificação de ramnolipídeos.

[0056] Os resultados de fermentação com várias concentrações de adição de melaços são mostrados na Tabela 2. A fermentação foi continuamente corrida por 18 dias com este método de "retirar e encher” gerando acima de 65 L de caldo de fermentação usando um vaso fermentador de 10 L sem desligar o mesmo. Os resultados na Tabela 2 mostram claramente que a adição de melaços encurta o tempo de fermentação, principalmente durante a 2a fase de mudança de pH (Figura 1) rendendo maiores produtividades de RL comparadas àquelas sem melaços, independente de concentração de melaços. Isto também pode ser devido a um aumento em massa de células bacterianas mostrado em coluna g CDW/L (g de peso seco de células / L).

Tabela 2: Performance de fermentação de RL com óleo de soja 6% com e sem melaços DF# % de adição Tempo de RL (g/L) Produtividade g CDW/L % de consumo de melaços fermentação (h) de RL (g/L/h) de óleo de soja DF0* 0% 76 75 1,0 16 90% DF1 0% 50 67 1,3 17 92% DF2 1% 38 72 1,9 32 96% DF3 1% 34 69 2,0 37 94% DF4 1% 36 69 1,9 37 95% DF5 0,50% 28 59 2,1 36 94% DF6 0,50% 28 60 2,2 31 93% DF7 0,50% 28 63 2,2 36 94% DF8 0,25% 33 63 1,9 28 91% DF9 0,25% 34 62 1,8 25 93% DF10 0,25% 34 65 1,9 22 95% * 8% de óleo de soja foram usados. Exemplo 2: Quantificação e estrutura de análises de ramnolipídeos

[0057] Um sistema de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) Agilent 1260 Infinity equipado com detetor de dispersão de luz evaporativa 1290 Infinity (ELSD) e uma coluna de fase reversa, Pinnacle DB C18 (100 x 2,1 mm, 3micra parte #9414312) por Restek é usado para quantificar a concentração de ramnolipídeos nas amostras. A temperatura de coluna é mantida constante a 40oC. O volume de injeção de amostra é de 25 microlitros. A fase móvel contém um volume igual de acetato de amônio 5mM e acetonitrila em 25 mL / minuto. As temperaturas nebulizada e de evaporador estão em 40oC com 1,7 SLM de nitrogênio. A concentração de RL é calculada usando o fator de diluição e a concentração conhecida dos padrões (isto é, as curvas de calibração de di-ramnolipídeos puros e mono-ramnolipídeos puros) obtidos em casa usando uma cromatografia de camada fina.

[0058] A estrutura de ramnolipídeos é analisada usando um módulo de separações Waters Corporation 2695 conectado a um espectrômetro de massa Waters ZQ2000 single quadrupole com ionização de eletrospray (LC/MS). A coluna MS é a mesma como aquela usada na instalação de HPLC. Volume de injeção é de 5 microlitros. Fases móveis consistem em acetato de amônio 5mM (A) e acetonitrila (B). A taxa de fluxo é de 0,2mL / minuto tendo A = 60% (B = 40%) por 2 minutos então gradiente para 100% de B em 15 minutos onde é mantido para o restante do tratamento LC. As amostras são mantidas a 4oC e a temperatura de coluna é mantida constante a 40oC. As condições de LC/MS para detecção de ramnolipídeos são listadas na Tabela 3 abaixo. Tabela 3: As condições de LC/MS Parâmetro Fixação Capilar (kV) 3,2 Cone (V) Per íon Extrator (V) 5 Temp. de fonte (°C) 100 Temp. de dessolvatação (°C) 300 Gás de dessolvatação (L hr-1) 250 Gás de cone (L hr-1) 50 Exemplo 3: Fermentação semicontínua de RL de óleo de soja 7,8% e melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurado 0,5% com ramnolipídeos como um emulsificante

[0059] As condições de fermentação, composições de meios e nutriente são as mesmas como mostradas em Exemplo 1 exceto que ramnolipídeo purificado produzido a partir de Exemplo 1 é usado como um emulsificante. O estoque de alimentação é óleo de soja 7,8% com melaços de mel de cana de açúcar não sulfurado 0,5%. O ramnolipídeo sulfurado purificado é adicionado aos meios de cultura como um emulsificante no início com os meios de cultura recentemente esterilizados.

[0060] A concentração de ramnolipídeo (RL) e produtividade são mostradas na Tabela 4. Uma vez que RL é adicionado nos meios no início como um emulsificante em 0,5% para DF0 e 0,1% para DF1- DF3, aquelas quantidades são subtraídas e a real concentração de RL produzida a partir da fermentação é reportada como RL ajustado (g/L).

[0061] Tabela 4: Performance de fermentação de RL com óleo de soja 7,8% e melaços 0,5% Batelada % de RL como um RL ajustado Fermentação Produtividade de % de C em emulsificante (g/L) (h) RL (g/L/h) óleo para C em RL DF0 0,5% 78 44 1,8 80% DF1 0,1% 90 35 2,6 92% DF2 0,1% 93 34 2,7 95% DF3 0,1% 80 33 2,4 82%

[0062] É conveniente notar que a fermentação será mais longa para DF0 uma vez que o micro-organismo precisa tempo para ajuste ao novo ambiente a partir de frasco de agitação contendo caldo LB para o fermentador contendo óleo de soja. Toda a produtividade de RL de DF0 mostrada é inferior àquela obtida de DF1+. Isto também é uma vantagem do método de fermentação semicontínuo uma vez que a produtividade de RL e eficiência de método de fermentação aumentam após a primeira inoculação (DF0). Método de fermentação em batelada sofrerá deste retardo toda vez que a nova batelada se inicia uma vez que a fermentação tem de começar do início (isto é, inoculação nova para cada batelada).

[0063] % de conversão de carbono é calculada baseada na quantidade de carbono contida em óleo de soja convertido a carbono em ramnolipídeos. Os resultados de LC/MS mostraram que as amostras de ramnolipídeo contêm predominantemente mono- e di-

ramnose com caudas C10-C10 e C10-C12. Baseado neste resultado, a conversão de carbono calculada a partir de óleo de soja para produção de ramnolipídeo é maior que 80%. Exemplo 4: Fermentação semicontínua de RL de óleo de milho 8,8% com melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurado 0,5%

[0064] As condições de fermentação, meios e composições nutrientes são as mesmas como mostradas no Exemplo 1 exceto que ramnolipídeo purificado produzido a partir do Exemplo1 é usado como um emulsificante e 7,5 mL de elementos em microtraços são adicionados diariamente. O estoque de alimentação de carbono é óleo de milho 8,8% com melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurado 0,5% e o ramnolipídeo purificado é adicionado em meios de cultura como um emulsificante no início de DFO somente em 0,1%. Nenhum ramnolipídeo é adicionado como um emulsificante para DF1-DF5. Tabela 5: Desempenho de fermentação de RL com óleo de milho 8,8% e melaços 0,5% Batelada Rl ajustado Tempo de Produtividade de % de mono RL (g/L) fermentação (h) RL (g/L/h) DF1 106 46 2,3 55% DF2 93 45 2,1 54% DF3 106 51 2,1 58% DF4* 82 40 2,1 53% DF5 97 49 2,0 60%

[0065] *óleo de milho 7,8% é usado.

[0066] A produtividade de RL obtida da fermentação de óleo de milho é tão boa como aquelas de óleo de óleo de soja. A produtividade de RL está na faixa de 2-2,3 g de RL/L/h. Exemplo 5: Experimentos de frasco de agitação com xaropes de beterraba sacarina e sorgo em várias concentrações

[0067] O experimento de frasco de agitação é realizado a 37oC, 250 rpm usando um MaxQ 8000Stackable Orbital Shakers (Thermo Scientific) em frascos defletores erlenmeyer de pirex de 250 mL. Cada frasco conteve 40 mL de meio de cultura contendo óleo de soja 8% com composição nutriente idêntica à descrita no Exemplo 1mas sem elementos em microtraços. Os frascos defletores são autoclavados a 121oC por 20 minutos e resfriados para temperatura ambiente antes de inoculação em 2,5% v/v com cultura de P. aeruginosa. As amostras são coletadas em 68, 92 e 116 h usando pipetas esterilizadas. As amostras são centrifugadas em 14.000 rpm por 5 minutos para obter sobrenadante claro (nenhuma camada de óleo) que é então esterilizado e filtrado em 0,2 mícron antes de diluição para análise de concentração de RL usando o FIPLC/ELSD.

[0068] A amostra sem sobrenadante claro (isto é, com camada de óleo na parte superior) é representada como "nenhum CB” significando que a mesma não foi submetida a HPLC devido a uma concentração muito alta de óleo na amostra. Os resultados mostrados na Tabela 6 mostram claramente que a produção de ramnolipídeos também é aperfeiçoada pela adição de xarope de beterraba sacarina e xarope de sorgo. Tabela 6: Concentrações de ramnolipídeos com xaropes de beterraba sacarina e sorgo Frasco Nenhum Xarope de beterraba sacarina Xarope de sorgo (h) aditivo 0,50% 1% 1,50% 0,50% 1% 1,50% 68 Nenhum CB Nenhum CB Nenhum CB Nenhum CB Nenhum CB Nenhum CB 74 92 Nenhum CB 72 84 80 Nenhum CB 90 103 116 56 71 77 80 88 85 91 Exemplo 6: Fermentação em bateladas de RL com óleo de soja 8% e melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurado 0,5%

[0069] As condições de fermentação, meios e composições nutrientes são as mesmas como mostradas no Exemplo 4 exceto que esta é uma fermentação em batelada significando que a fermentação é iniciada com inoculação R4 (tempo = 0) e uma vez a fermentação seja completada, a fermentação é interrompida e limpa. O estoque de alimentação de carbono é óleo de soja 8% com melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurados 0,5%. O ramnolipídeo purificado é adicionado em meios de cultura como um emulsificante em 0,1% com os meios de cultura esterilizados recentemente.

[0070] A fermentação leva 44 horas para completar. A concentração de ramnolipídeos (RL) é obtida em 88 g/L em 44 h e assim a produtividade de RL é de 1,9 g/L/h comparada a 1 g/L/h obtida em DF0 mostrada em Exemplo 1 sem adição de melaços. Exemplo 7: Fermentação semicontínua de RL de óleo de coco 8% e melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurados 0,5% com ramnolipídeos como um emulsificante

[0071] As condições de fermentação, meios e composições nutrientes são as mesmas como mostradas no Exemplo 3 exceto que o estoque de alimentação de carbono é óleo de coco 8%. Nenhum ramnolipídeo é adicionado como um emulsificante para DF1-DF4 uma vez que ele é gerado de DF0. O tempo de fermentação é consistente em 32-36 h com adição de melaços 0,5%. Tabela 8: Desempenho de fermentação com óleo de coco 8% e melaços 0,5% Batelada RL (g/L) Tempo de Produtividade de % de Mono RL Fermentação (h) RL (g/L/h) DF0 68 38 1,8 66% DF1 75 33 2,2 63% DF2 74 33 2,3 64% DF3 74 32 2,3 62% DF4 75 36 2,1 61% Exemplo 8: Fermentação de RL de óleo de coco 8% com combinação de aditivos açúcares

[0072] As condições de fermentação, meios e composições nutrientes são as mesmas como mostradas em Exemplo 7 exceto que os aditivos açúcares são melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurados, xarope de sorgo e xarope de beterraba sacarina. Tabela 9: Desempenho de fermentação de RL com óleo de coco 8% e vários aditivos açúcares açúcar RL Tempo de Produtividade % de (g/L) Fermentação de RL (g/L/h) Mono (h) RL Nenhum açúcar 91 88 1,0 57% 0,25%Melaços+ 0,25% sorgo 79 33 2,4 63% 0,25% Melaços + 0,25% beterraba 80 35 2,3 60% sacarina 0,25% beterraba sacarina + 0,25% 82 57 1,4 56% Sorgo 0,5% beterraba sacarina + 0,5% 81 41 2,0 59% sorgo Exemplo 9: Fermentação RL de óleos triglicerídeos de cadeia média e longa com melaços de mel de cana-de-açúcar não sulfurados 0,5%

[0073] As condições de fermentação, meios e composições nutrientes são as mesmas como mostradas em Exemplo 7, exceto que óleos de coco 4% e de canola 4% representando óleos triglicerídeos de cadeia média e longa, respectivamente, são usados como um estoque de alimentação com melaços 0,5%. A fermentação é completada em 32 horas com concentração de RL de 88 g/L e assim, a produtividade de RL está em 2,8 g/L/h. Referências

1. Müller, M.M., et al., Rhamnolipids—Next generation surfactants? Journal of Biotechnology, 2012. 162(4): p. 366-380.

2. Sekhon Randhawa, K.K. and P.K.S.M. Rahman, Rhamnolipid biosurfactants—past, present, and future scenario of global market. Frontiers in Microbiology, 2014. 5: p. 454.

3. Wittgens, A., et al., Growth independent rhamnolipid production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440.

Microbial Cell Factories, 2011. 10(1): p. 1-18.

4. Banat, I.M., et al., Cost effective technologies and renewable substrates for biosurfactants’ production. Frontiers in Microbiology,

2014. 5: p. 697.

5. Kaskatepe, B. and S. Yildiz, Rhamnolipid Biosurfactants Produced by Pseudomonas Species. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2016. 59.

6. Desai, R.M.P.a.A.J., Biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa GS3 from molasses. Letters in Applied Microbiology, 1997. 25: p. 91–94.

7. Onbasli D., A.B., Biosurfactant production in sugar beet molasses by some Pseudomonas spp. J Environ Biol. , 2009. 30(1): p. 161-163.

8. Gudiña, E.J., et al., Valorization of agro-industrial wastes towards the production of rhamnolipids. Bioresource Technology, 2016. 212: p. 144-150.

9. Rashedi, H., et al., Environmental importance of rhamnolipid production from molasses as a carbon source. International Journal of Environmental Science & Technology, 2005. 2(1): p. 59-62.

10. Giani, C., et al. Pseudomonas aeruginosa and its use in a process for the biotechnological preparation of L-rhamnose. US5501966 A, 1996.

11. Li, A.-h., et al., Rhamnolipid Production by Pseudomonas Aeruginosa GIM 32 Using Different Substrates Including Molasses Distillery Wastewater. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011. 163(5): p. 600-611.

12. Gong, Z., Y. Peng, and Q. Wang, Rhamnolipid production, characterization and fermentation scale-up by Pseudomonas aeruginosa with plant oils. Biotechnology Letters, 2015. 37(10): p. 2033-2038.

13. Zhu, L., et al., Enhanced rhamnolipids production by

Pseudomonas aeruginosa based on a pH stage-controlled fed-batch fermentation process.

Bioresource Technology, 2012. 117: p. 208-213.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método semicontínuo para produção de uma pluralidade de fermentações compreendendo um ou mais ramnolipídeos (RL), caracterizado por compreender: (a) cultura de um micro-organismo produzindo ramnolipídeo em meio de cultura compreendendo pelo menos duas fontes de carbono, em que pelo menos uma fonte de carbono é um adoçante e pelo menos uma fonte de carbono é um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média ou longa, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de magnésio, pelo menos uma fonte de potássio, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de cloreto, e pelo menos uma fonte de sódio e opcionalmente na presença de um emulsificante por pelo menos 1 dia para obter um primeiro meio de fermentação compreendendo ramnolipídeo compreendendo um ou mais ramnolipídeos (RL) e pelo menos um micro-organismo produzindo ramnolipídeo; (b) remoção de pelo menos cerca de 70% de dito primeiro meio de fermentação obtido na etapa (a); (c) substituição de dito primeiro meio de fermentação removido em (b) com meio de cultura tendo a composição mostrada em etapa (a); (d) repetição de etapas (a)-(c) pelo menos uma vez para obter um subsequente meio de fermentação compreendendo ramnolipídeos e pelo menos um micro-organismo produzindo ramnolipídeo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dita etapa de cultura (a) render pelo menos cerca de 1,7 g de RL/L/h e/ou o dito Método render pelo menos cerca de 40 g RL/L.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2,

caracterizado por dito micro-organismo produzindo ramnolipídeo ser cultivado em etapa (a) por cerca de 1 a cerca de 4 dias.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ainda compreender adição de uma composição compreendendo um ou mais micronutrientes em uma concentração de não mais que 20 mg/L de solução micronutriente ao dito meio de cultura em etapa (a) em 0,1% v/v de volume de fermentação total por dia.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por dito meio de fermentação ser removido em etapa (b) durante agitação e enquanto mantendo fluxo de ar.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por dito meio de fermentação ser removido em etapa (b) durante agitação e enquanto mantendo fluxo de ar com ar enriquecido com oxigênio.

7. Método de acordo com qualquer uma de reivindicações 1 a 6, caracterizado por não haver etapa de sedimentação entre as etapas (a) e (b).

8. Método para produção de um ou mais ramnolipídeos, caracterizado por compreender cultura de um micro-organismo produzindo ramnolipídeo em meio de cultura compreendendo pelo menos duas fontes de carbono, em que a dita fonte de carbono é um adoçante e um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média ou cadeia longa, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de magnésio, pelo menos uma fonte de potássio, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de cloreto, pelo menos uma fonte de sódio e opcionalmente um emulsificante, por pelo menos 1 dia para obter um título de ramnolipídeo de pelo menos cerca de 40 g/L e/ou em uma taxa de pelo menos cerca de 1,5 g de RL/L/h e opcionalmente isolando o dito um ou mais ramnolipídeos a partir do dito meio de cultura.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por dito meio de cultura ser livre de micronutriente.

10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por dita cultura ser realizada usando um Método de fermentação semicontínuo, um Método de fermentação de batelada ou Método de fermentação de alimentação - batelada.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por cultura ser realizada usando o Método de fermentação semicontínuo de acordo com a reivindicação 1.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado por dito micro-organismo de produção de ramnolipídeo ser um micro-organismo Pseudomonas.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por dito meio de cultura compreender entre cerca de 0,1% a cerca de 2,0% em peso de cada adoçante peso/volume no dito meio de cultura e/ou entre cerca de 3-15% em peso de cada óleo no dito meio de cultura.

14. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado por dito adoçante ser um adoçante não refinado e/ou dito óleo ser um óleo vegetal.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por dito adoçante não refinado ser derivado de seiva, uma ou mais raízes, fruto, uma ou mais sementes, uma ou mais árvores, ou um ou mais animais.

16. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado por dito adoçante ser pelo menos um de melaços, xarope de arroz, cevada ou malte, néctar, xarope de yacon, xarope de beterraba sacarina, xarope de sorgo e/ou dito óleo ser pelo menos um de óleo de soja, óleo de açafrão, óleo de amendoim, óleo de semente de cânhamo, óleo jatropha, gordura de coco, óleo de cabaça, óleo de linhaça, óleo de milho, óleo de semente de papoula, óleo de enótera, óleo de oliva, óleo de núcleo de palma, óleo de palma, óleo de semente de colza, óleo de sésamo, óleo de girassol, óleo de semente de uva, óleo de noz, óleo de germe de trigo, óleo de coco ou óleo de triglicerídeo de cadeia média.

17. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado por dito micro-organismo de produção de ramnolipídeo ser cultivado em um meio de cultura compreendendo pelo menos três fontes de carbono, em que pelo menos duas das fontes de carbono ser adoçantes e pelo menos uma fonte de carbono ser um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média ou longa.

18. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado por dito micro-organismo produzindo ramnolipídeo ser cultivado em um meio de cultura compreendendo pelo menos três fontes de carbono, em que pelo menos duas das fontes de carbono ser adoçantes não refinados e pelo menos uma fonte de carbono ser um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média.

19. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado por dito micro-organismo produzindo ramnolipídeo ser cultivado em um meio de cultura compreendendo pelo menos quatro fontes de carbono, em que pelo menos duas das fontes de carbono ser óleos contendo triglicerídeos de cadeia média ou longa e pelo menos duas fontes de carbono ser adoçantes.

20. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado por dito micro-organismo produzindo ramnolipídeo ser cultivado em um meio de cultura compreendendo pelo menos quatro fontes de carbono, em que pelo menos uma das fontes de carbono é um óleo contendo triglicerídeos de cadeia média, uma das fontes de carbono ser um óleo contendo triglicerídeos de cadeia longa e pelo menos duas fontes de carbono ser adoçantes não refinados.