CN105189740A - 工程化微生物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了破囊壶菌和破囊壶菌属以及相关的方法和试剂，包括来自破囊壶菌或破囊壶菌属和/或在破囊壶菌或破囊壶菌属中操作的工程化的调节序列和基因、可用于工程化微生物如破囊壶菌的选择性标记、用于诱变微生物的手段、由诱变产生的菌株、以及与在微生物中产生特定化合物相关的方法和组合物。

Description

工程化微生物
相关申请的交叉引用
本申请要求在2013年3月13日提交的临时专利申请号61/779,257的优先权，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
序列表
根据37CFR§1.52(e)(5)，本说明书参考序列表(在2012年7月16日创建的名称为“Sequence_Listing.txt”，并且为128千字节)。所述序列表的全部内容以引用的方式并入本文。
背景
多不饱和脂肪酸(PUFA)长期以来被认为对健康具有有益影响。营养补充剂的主要来源是来自具有高浓度PUFA的鱼类物种(如鳀鱼、沙丁鱼、鲑鱼、鲱鱼、鲭鱼和金枪鱼)的油。然而，来源缺乏可靠性并且从鱼类分离得到的PUFA的品质和/或数量具有可变性，这意味着对PUFA的替代来源仍存在需要。
破囊壶菌(Thraustochytrid)是具有产生有用产物的能力的水生真核微生物，所述有用产物包括PUFA和抗氧化剂(Carmona等，Biosci.Biotechnol.Biochem.67(4):884-888,2003)。这些生物体存在于全世界范围内的海洋和河口中。破囊壶菌能够使用广泛的碳源和氮源用于生长，从而表明使用廉价营养物进行工业培养的潜力。
概述
本公开涵盖了提供PUFA和其他有用的化合物和试剂的来源的组合物、方法和试剂盒。本公开涵盖了如下认识：不论通过传统诱变或以另外的方式而基因改变的破囊壶菌可以提供有用的PUFA和其他化合物和试剂的来源。
本公开提供了用于基因工程化破囊壶菌的系统以及用于各种用途(例如产生PUFA和/或产生生物燃料)的基因工程化的破囊壶菌。
本文提供了分离的核酸分子，其包括破囊壶菌或破囊壶菌属(Thraustochytrium)基因或基因元件，如破囊壶菌或破囊壶菌属启动子或终止子。所提供的分离的核酸分子中的示例性启动子包括，但不限于微管蛋白启动子(例如，与SEQIDNO:6或SEQIDNO:10具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸序列)、Δ5延长酶启动子(例如，与SEQIDNO:19具有至少80％序列同一性的核酸序列)、Δ4去饱和酶启动子(例如，与SEQIDNO:24具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸序列)、Δ12去饱和酶启动子(例如，与SEQIDNO:69具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸序列)和Δ5去饱和酶启动子(例如，与SEQIDNO:71具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸序列)。所提供的分离的核酸分子中的示例性终止子包括，但不限于微管蛋白终止子(例如，与SEQIDNO:14或SEQIDNO:18具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸序列)。任选地，分离的核酸分子是与SEQIDNO:70具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的Δ12去饱和酶序列。任选地，分离的核酸分子是在严格条件下与由SEQIDNO:70编码的核酸杂交的分子。任选地，分离的核酸分子是与SEQIDNO:72具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的Δ5去饱和酶序列。任选地，分离的核酸分子是在严格条件下与由SEQIDNO:72编码的核酸杂交的分子。
还提供了分离的多肽分子，其具有在破囊壶菌或破囊壶菌属基因元件中编码的氨基酸序列。任选地，分离的多肽是Δ5延长酶、Δ4去饱和酶或Δ12去饱和酶。任选地，分离的多肽是由与SEQIDNO:70具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸序列编码的Δ12去饱和酶。
提供了分离的核酸分子，其包括可操作地连接至破囊壶菌或破囊壶菌属基因启动子和破囊壶菌或破囊壶菌属基因终止子的异源序列。任选地，异源序列编码多肽。任选地，所提供的分离的核酸分子进一步包括博来霉素(zeocin)抗性基因。
因此，提供了包括可操作地连接至基因启动子的破囊壶菌或破囊壶菌属基因的分离的核酸分子。任选地，基因启动子是异源基因启动子。任选地，基因启动子是异源破囊壶菌或破囊壶菌属基因启动子。例如，包含破囊壶菌或破囊壶菌属Δ5延长酶、Δ5去饱和酶或Δ4去饱和酶的分离的核酸分子可以可操作地连接至破囊壶菌或破囊壶菌属Δ12去饱和酶启动子。任选地，基因启动子对于可操作地连接至其上的基因是外源的。任选地，基因启动子对于可操作地连接至其上的基因是内源的。
提供了宿主细胞，其包括如本文所描述的一种或多种所提供的分离的核酸、重组核酸或异源构建体。任选地，宿主细胞是除了破囊壶菌或破囊壶菌属以外的微生物。
提供了诱变微生物(例如，破囊壶菌或破囊壶菌属)的细胞的方法。方法包括以下步骤：在培养基上培养微生物的细胞，所述培养基包含博来霉素并且博来霉素浓度能杀死60％-80％的细胞；并且分离在培养中存活下来的细胞亚群，从而诱变微生物的细胞。进一步提供了诱变微生物(例如，破囊壶菌或破囊壶菌属)的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基上培养微生物的细胞；使细胞暴露于紫外或微波辐射或其组合中，以使得60％-80％的细胞被破坏；并且分离在培养中存活下来的细胞亚群，从而诱变微生物的细胞。任选地，方法包括多轮突变和分离。可以通过同源重组、诱导型启动子、敲入和敲低方法和本领域中的其他分子手段来将突变引导至特定基因。
提供了含有对一个或多个基因进行一种或多种修饰的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，所述一个或多个基因编码涉及破囊壶菌或破囊壶菌属的PUFA生物合成途径的酶多肽或酶多肽复合物的一部分。任选地，当在可比条件下培养修饰的细胞和参考细胞时，与参考破囊壶菌或破囊壶菌属细胞相比，修饰增加或减少了修饰的细胞对一种或多种PUFA的产生。任选地，酶多肽或酶多肽复合物选自由以下组成的组：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶以及聚酮PUFA合酶(PKS)。任选地，一种或多种PUFA选自由以下组成的组：α-亚麻酸(“ALA”)、花生四烯酸(“ARA”)、二十二碳六烯酸(“DHA”)、二十二碳五烯酸(“DPA”)、二十碳五烯酸(“EPA”)、γ-亚麻酸(“GLA”)以及亚油酸(“LA”)。任选地，酶或酶复合物选自由以下组成的组：聚酮PUFA合酶(PKS)、Δ9去饱和酶、延长酶以及ω-3去饱和酶。
提供了用于转化破囊壶菌或破囊壶菌属的方法。方法包括以下步骤：(a)提供感受态破囊壶菌或破囊壶菌属细胞；(b)将重组核酸递送到感受态破囊壶菌或破囊壶菌属细胞中，其中重组核酸包含选择性标记；并且(c)在含有选择剂的培养基中培养感受态破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，所述选择剂在没有选择性标记的情况下减少细胞的生长。任选地，选择性标记是抗生素抗性基因。任选地，选择剂是抗生素。例如，抗生素可以是博来霉素。任选地，博来霉素以大于50μg/mL(例如约100μg/mL-1000μg/mL)的浓度存在。任选地，博来霉素以近似500μg/mL的浓度存在。任选地，减少培养基中的盐的量以避免博来霉素降解。
在所提供的用于转化破囊壶菌或破囊壶菌属细胞的方法中，重组核酸进一步包括不同于选择性标记的基因表达盒。
任选地，所提供的用于转化破囊壶菌或破囊壶菌属细胞的方法进一步包括分离含有选择性标记的感受态破囊壶菌或破囊壶菌属细胞的步骤。
任选地，递送步骤包括生物射弹递送(biolisticdelivery)涂覆有重组核酸的颗粒。例如，包含金、钨或玻璃珠粒的颗粒可以用于生物射弹递送中。
任选地，培养基含有在较低盐浓度与较高盐浓度之间的盐水平。任选地，较低浓度是约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L、约12g/L、约15g/L、约17g/L、约18g/L、约19g/L或约20g/L。任选地，较高盐浓度是约20g/L、约22g/L、约25g/L、约27g/L、约30g/L、约32g/L、约35g/L、约37g/L、约40g/L、约45g/L、约50g/L、约55g/L、约60g/L、约65g/L或约70g/L。任选地，盐浓度是在约3g/L与约70g/L之间；在约5g/L与约60g/L之间；在10g/L与约40g/L的盐之间(例如在约15g/L与约35g/L的盐之间，或在约18g/L与约35g/L的盐之间；或在约9g/L与约18g/L之间)。任选地，盐是选自由以下组成的组的盐或包括选自由以下组成的组的盐：钠盐(例如，海盐、氯化钠、食盐、硫酸钠等)、钾盐以及其组合。任选地，盐是非氯化物盐或包括非氯化物盐。任选地，盐是非氯化钠盐或包括非氯化钠盐。
提供了用于遗传转化的感受态破囊壶菌或破囊壶菌属细胞。
提供了用重组核酸转化的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞。
提供了培养破囊壶菌或破囊壶菌属细胞的方法。方法包括：在第一组条件下使包含破囊壶菌或破囊壶菌属细胞的培养物生长，在所述第一组条件下生物质增加(并且任选地，其他特征也增加或减少)；将第一组培养条件转变成第二组条件，在所述第二组条件中脂质生产率增加，其中转变包括以下步骤中的一种或多种：(a)使氧浓度从第一氧浓度降低至第二氧浓度；(b)使C:N比率从第一C:N比率增加至第二C:N比率；(c)使温度从第一温度降低至第二温度；以及其组合。
提供了提供PUFA的方法。方法包括：提供与参考破囊壶菌或破囊壶菌属细胞相比被修饰的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，其中修饰的细胞含有一种或多种遗传修饰，当在可比条件下培养修饰的细胞和参考细胞时，与参考细胞相比所述一种或多种遗传修饰增加了修饰的细胞对一种或多种PUFA的产生；并且在足以实现一种或多种PUFA产生的条件下和时间内培养修饰的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞。
任选地，提供步骤包括提供含有至少一种工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属启动子的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞。
任选地，提供步骤包括提供含有至少一种工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属终止子的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞。
任选地，提供步骤包括提供相对于参考破囊壶菌或破囊壶菌属细胞被修饰的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，其中修饰的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞含有至少一种表达的异源多肽。任选地，至少一种异源蛋白质由可操作地与工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属启动子、工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属终止子或两者连接的基因表达。任选地，至少一种异源多肽包含至少一种异源PUFA生物合成多肽。
遗传修饰可以包括至少一种使PUFA生物合成多肽的表达或活性增加的核苷酸突变。任选地，其表达或活性增加的PUFA生物合成多肽是内源PUFA产生多肽。任选地，其表达或活性增加的PUFA产生多肽是异源PUFA生物合成多肽。
提供了表达异源PUFA产生多肽的工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞。
提供了工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，当在可比条件下培养工程化的细胞和非工程化的细胞时，所述工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞产生比非工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞高至少36％水平的至少一种PUFA。
提供了包括至少一种PUFA和以下的一种或多种组分的组合物：含有抗生素抗性基因的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞或是含有抗生素抗性基因的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞的子代。任选地，抗生素抗性基因是博来霉素抗性基因。
提供了包括至少一种PUFA和以下的一种或多种组分的组合物：(a)在培养基中或在培养基上培养的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，所述培养基包含博来霉素并且博来霉素浓度能杀死60％-80％的细胞；或(b)在培养基中或在培养基上培养的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞的子代，所述培养基包含博来霉素并且博来霉素浓度能杀死60％-80％的细胞。
将抗体多肽提供给本文所描述的一种或多种分离的多肽。任选地，将抗体多肽提供给编码破囊壶菌或破囊壶菌属Δ12去饱和酶的分离的多肽。任选地，抗体多肽具有约(KA)为109M-1、108M-1、107M-1、106M-1、105M-1或104M-1的亲和常数。任选地，抗体多肽具有在近似1010-109M-1、108-109M-1、107-108M-1、106-107M-1、105-106M-1或104-105M-1范围内的亲和常数(KA)。任选地，抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或抗原结合片段。
本文提供了分离的核酸分子，其包括选自由以下组成的组的核酸序列：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及(e)具有与SEQIDNO:70的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。任选地，分离的核酸分子被操作地连接至启动子。任选地，启动子对于分离的核酸分子是异源的。任选地，核酸来源于微生物。任选地，微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属(Schizochytrium)、椭圆壶菌属(Oblongichytrium)、橙黄壶菌属(Aurantiochytrium)和破囊壶菌属。任选地，微生物是ONC-T18。
本文提供了分离的核酸分子，其包括选自由以下组成的组的核酸序列：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:72所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)编码具有Δ5去饱和酶活性的多肽的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及(e)具有与SEQIDNO:72的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。任选地，核酸分子被操作地连接至启动子。任选地，启动子对于分离的核酸分子是异源的。任选地，核酸来源于微生物。任选地，微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。任选地，微生物是ONC-T18。
提供了分离的核酸分子，其包括选自由以下组成的组的核酸序列：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:69所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)调节Δ12去饱和酶转录的(a)的所述核酸的补体；以及(c)具有与SEQIDNO:69的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。任选地，分离的核酸分子被操作地连接至异源核酸序列。任选地，核酸分子被操作地连接至编码酶多肽或酶多肽复合物的一部分的多核苷酸，所述酶多肽或酶多肽复合物的一部分具有选自由以下组成的组的活性：去饱和酶活性、延长酶活性、脂肪酸合酶活性和聚酮多不饱和脂肪酸合酶(PKS)活性。任选地，活性是去饱和酶活性。任选地，去饱和酶活性是Δ5去饱和酶活性。任选地，核酸来源于微生物。任选地，微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。任选地，微生物是ONC-T18。
本文提供了分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核酸序列：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:71所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)调节Δ5去饱和酶转录的(a)的所述核酸的补体；以及(c)具有与SEQIDNO:71的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。任选地，分离的核酸分子被操作地连接至异源核酸序列。任选地，核酸分子被操作地连接至编码酶多肽或酶多肽复合物的一部分的多核苷酸，所述酶多肽或酶多肽复合物的一部分具有选自由以下组成的组的活性：去饱和酶活性、延长酶活性、脂肪酸合酶活性和聚酮多不饱和脂肪酸合酶(PKS)活性。任选地，活性是去饱和酶活性。任选地，去饱和酶活性是Δ12去饱和酶活性。任选地，核酸来源于微生物。任选地，微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。任选地，微生物是ONC-T18。
提供了由SEQIDNO:70和SEQIDNO:72的核酸序列编码的多肽。
提供了包含SEQIDNO:69-72的核酸序列的所有或部分的载体。
还提供了工程化的微生物，其中微生物表达选自由以下组成的组的异源核酸序列：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及(e)具有与SEQIDNO:70的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。任选地，微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。任选地，微生物是ONC-T18。任选地，异源核酸序列被操作地连接至异源启动子。任选地，异源启动子与SEQIDNO:71至少90％相同。任选地，异源启动子选自由以下组成的组：细菌启动子、酵母启动子、真核病毒启动子或从微藻类分离的启动子元件。任选地，异源核酸序列被过表达。任选地，通过表达载体将异源核酸序列引入到细胞中。任选地，将表达载体引入到具有至少一种另外的异源多核苷酸的微生物中，所述异源多核苷酸编码涉及多不饱和脂肪酸生物合成的酶多肽或酶多肽的一部分。任选地，至少一种另外的异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，微生物的总脂肪含量增加至少10％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，微生物的总脂肪含量增加至少20％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，微生物的总脂肪含量增加至少50％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，微生物的总脂肪含量增加至少100％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少10％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少20％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少50％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少100％。
提供了工程化的微生物，其中微生物表达至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸，所述多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸被操作地连接至选自由以下组成的组的异源启动子：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:69所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)调节Δ12去饱和酶转录的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；以及(d)具有与SEQIDNO:69的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。任选地，至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸对于微生物是内源的。任选地，至少一种内源性多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸通过同源重组被操作地连接至异源启动子。任选地，至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸对于微生物是外源的。任选地，至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。任选地，工程化的微生物进一步过表达选自由以下组成的组的核酸序列：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及(e)具有与SEQIDNO:70的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。
提供了用于产生多不饱和脂肪酸的方法。方法包括提供工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，其中工程化的细胞表达选自由以下组成的组的异源核酸分子：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；和(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及(e)具有与SEQIDNO:70的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子，其中当在可比条件下培养工程化的细胞和参考细胞时，与参考细胞相比，异源表达改变了工程化的细胞对一种或多种多不饱和脂肪酸的产生；并且在足以实现一种或多种多不饱和脂肪酸的产生的条件下和时间内培养工程化的细胞。任选地，一种或多种多不饱和脂肪酸选自由以下组成的组：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸和/或亚麻酸。任选地，方法进一步包括表达至少一种异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少10％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少20％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少50％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少100％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少10％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少20％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少50％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少100％。任选地，异源核酸分子被过表达。
还提供了用于产生多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括提供工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，其中工程化的细胞表达至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸，所述多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸被操作地连接至选自由以下组成的组的异源启动子：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:69所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)调节Δ12去饱和酶转录的(a)的所述核酸的补体；(c)具有与SEQIDNO:69的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子，其中当在可比条件下培养工程化的细胞和参考细胞时，与参考细胞相比，异源启动子与至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸的操作地连接改变了工程化的细胞对一种或多种多不饱和脂肪酸的产生；并且在足以实现一种或多种多不饱和脂肪酸的产生的条件下和时间内培养工程化的细胞。任选地，一种或多种多不饱和脂肪酸选自由以下组成的组：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸和/或亚麻酸。任选地，方法进一步包括表达至少一种异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少10％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少20％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少50％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少100％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少10％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少20％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少50％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少100％。任选地，编码酶多肽和酶多肽复合物的一部分的至少一种异源多核苷酸被过表达。任选地，至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
本文提供了由本文所公开的方法产生的多不饱和脂肪酸组合物。
提供了工程化的微生物，其中微生物表达选自由以下组成的组的异源核酸序列：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:72所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)编码具有Δ5去饱和酶活性的多肽的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；和(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及(e)具有与SEQIDNO:72的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。任选地，微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。任选地，微生物是ONC-T18。任选地，异源核酸序列被操作地连接至异源启动子。异源启动子可以与SEQIDNO:71至少90％相同。任选地，异源启动子选自由以下组成的组：细菌启动子、酵母启动子、真核病毒启动子或从微藻类分离的启动子元件。任选地，异源核酸序列被过表达。任选地，通过表达载体将异源核酸序列引入到细胞中。任选地，将表达载体引入到具有至少一种另外的异源多核苷酸的微生物中，所述异源多核苷酸编码涉及多不饱和脂肪酸生物合成的酶多肽或酶多肽的一部分。任选地，至少一种另外的异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少10％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少20％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少50％。任选地，相对于无异源核酸序列存在下的含量，细胞的总脂肪含量增加至少100％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少10％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少20％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少50％。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少100％。
提供了工程化的微生物，其中微生物表达至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸，所述多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸被操作地连接至选自由以下组成的组的异源启动子：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:71所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)调节Δ5去饱和酶转录的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；以及(d)具有与SEQIDNO:71的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。任选地，至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸对于微生物是内源的。任选地，至少一种内源性多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸通过同源重组被操作地连接至异源启动子。任选地，至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸对于微生物是外源的。任选地，至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。任选地，工程化的微生物进一步过表达选自由以下组成的组的核酸序列：(a)在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交的核酸分子；(b)编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽的(a)的所述核酸的补体；(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的核酸分子不同的核酸分子；和(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及(e)具有与SEQIDNO:70的核酸序列至少90％相同的序列的核酸分子。
在以下所附附图和说明书中阐述了一个或多个实施方案的细节。其他特征、目标和优势将从说明书和附图并且从权利要求书中显而易见。所有引用的专利、专利申请和参考资料(包括属于公共序列数据库条目的参考资料)出于所有目的以引用的方式整体并入。
附图简述
图1示出了破囊壶菌属种ONC-T18(“ONC-T18”，ATCC登记号：PTA-6245；国际专利申请号PCT/IB2006/003977，所述国际专利申请的全部内容以引用的方式并入本文)中的PUFA的生物合成途径的表示。FAS：脂肪酸合酶；EL：延长酶；Δ12：Δ12去饱和酶；Δ9：Δ9去饱和酶；Δ8：Δ8去饱和酶；Δ6：Δ6去饱和酶；Δ5：Δ5去饱和酶；Δ4：Δ4去饱和酶；ω3：ω-3去饱和酶；C14:0：肉豆蔻酸；C16:0：棕榈酸；C16:1n-7：棕榈油酸；C18:0：硬脂酸；C18:1n-7：顺式-十八碳烯酸；C18:1n-9：油酸；C18:2n-6(LA)：亚油酸；C18:3n-3(ALA)：α-亚麻酸；C18:3n-6(GLA)：γ-亚麻酸；C18:4n-3(STA)：十八碳四烯酸；C20:2n-6(EDA)：二十碳二烯酸；C20:3n-6(DGLA)：二高-γ-亚麻酸；C20:4n-3(ETA)：二十碳四烯酸；C20:3n-3(ETE)：二十碳四烯酸；C20:4n-6(ARA)：花生四烯酸；C20:5n-3(EPA)：二十碳五烯酸；C22:4n-6(DTA)：二十二碳四烯酸；C22:5n-3(DPA)：二十二碳五烯酸；C22:5n-6：二十二碳五烯酸；C22:6n-3(DHA)：二十二碳六烯酸；以及PKS：聚酮PUFA合酶。指代ω-6PUFA生物合成途径并且指代ω-3PUFA生物合成途径。
图2是产生基因表达载体pd4DPZ1的示意性表示。
图3是产生基因表达载体pd5EPZ1的示意性表示。
图4是产生基因表达载体pd5EPrsGFP1以及由所述方法产生的中间质粒的构建体的示意性表示。
图5是产生基因表达载体p341PZ40T的示意性图示。
图6是产生基因表达载体p341PZ347T的示意性图示。
图7是产生基因表达载体p341PZ713T的示意性图示。
图8是产生基因表达载体p701PZ40T的示意性图示。
图9是产生基因表达载体p341PsmRsGFP40T的示意性图示。
图10是产生基因表达载体pD4DPZ18S以及由所述方法产生的中间质粒的构建体的示意性图示。
图11是产生基因表达载体p341PZ5EpEx和由所述方法产生的中间质粒的构建体的示意性表示。
图12图示了在生长培养基ONC-T18-GM0板中，在各种盐度下抗生素博来霉素对ONC-T18的生长和菌落数目的影响。结果表明ONC-T18在ONC-T18-GM0培养基中在较高盐度(例如35g/L人工海盐)下比在较低盐度(例如8.5g/L人工海盐)下生长得更快并且产生更多菌落。在中等盐度(例如18g/L人工海盐)下，在ONC-T18-GM0琼脂板中，浓度为30μg/mL的博来霉素能完全地抑制ONC-T18的生长。
图13图示了在所转化的博来霉素抗性的菌株中检测博来霉素抗性基因的转基因。利用PCR技术使用博来霉素抗性基因特异性引物从每个转化体菌株的基因组DNA扩增博来霉素基因特异性DNA片段。
图14A和图14B图示了转化的单细胞来源的菌株的生长速率。使用10μL移液管尖端从每个菌落中挑选在博来霉素ONC-T18-GM0琼脂板上已转化三次的博来霉素抗性菌株的接种物并且重新悬浮在200μLPCR管中的50μL无菌水中。将1μL细胞悬浮液点样于含有18g/L或35g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板(15g/L琼脂)上。在接种后的第1天、第3天、第5天、第7天和第9天测量点样的菌落的直径。
图15图示了野生型和各种转化的ONC-T18菌株在含有浓度为0μg/L至5000μg/L的博来霉素的生长培养基(ONC-T18-GM0)的琼脂板中的生长速率。将1μL细胞悬浮液点样于ONC-T18-GM0琼脂板上并且每日测量菌落的直径。
图16图示了野生型和各种转化的ONC-T18菌株在含有浓度为18g/L或35g/L的人工海盐的液体生长培养基(ONC-T18-GM0)中的生物质生产率。结果显示在较低盐度下，所测试的所有菌株都产生比在较高盐度下要多的生物质。
图17A、图17B、图17C和图17D图示了生长在具有各种盐度的液体ONC-T18-GM0培养基中的转化菌株的脂肪酸分布和总脂质生产率。
这个图示出ble转基因在所转化的ONC-T18菌株中的稳定性。
图18示出了在具有或不具有博来霉素的琼脂板上的野生型ONC-T18菌株和转化的ONC-T18菌株的比较。
定义
亲和力：如本领域中所知，“亲和力”是特定配体(例如抗体)结合其配偶体(partner)(例如，与其配偶体非共价缔合)的紧密度和/或所述特定配体从其配偶体解离的速率或频率的量度。如本领域中所知，可以利用任何各种技术来确定亲和力。亲和力可以用来表示特异性结合的量度。
抗体：如本文所使用，术语“抗体”是指由一种或多种大致上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽组成的多肽。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链通常分类为κ或λ。重链通常分类为γ、μ、α、δ或ε，其反过来分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体主要由两个相同对的多肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每个链的N-端定义主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别指这些轻链和重链。抗体可以是对特定抗原具有特异性的。抗体或它的抗原可以是分析物或结合配偶体。抗体作为完整的免疫球蛋白或作为许多由各种肽酶消化产生的良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫键下方消化抗体以产生F(ab)’2，F(ab)’2是Fab的二聚体，其自身是通过二硫键连接至VH-CH1的轻链。F(ab)’2可以在温和条件下还原以断裂铰链区中的二硫键从而使(Fab’)2二聚体转化成Fab’单体。Fab’单体基本上是具有铰链区的一部分的Fab(参见FundamentalImmunology,W.E.Paul编,RavenPress,N.Y.(1993)的其他抗体片段的更详细描述)。虽然各种抗体片段按照完整抗体的消化来定义，但本领域的普通技术人员应了解所述Fab'片段可以通过化学或利用重组DNA方法来重新合成。因此，如本文所使用的术语“抗体”还包括通过修饰全抗体而产生的或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段。
近似：如本文所使用，当应用到一种或多种感兴趣的值时，术语“近似”或“约”是指类似于规定的参考值的值。术语“近似”或“约”是指例如处于规定参考值的任一方向上(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小之内的数值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文明显可见(除了其中所述数字将超过可能值的100％)。
感受态：如本文对于细胞所使用的术语“感受态”是指细胞吸收细胞外遗传物质的能力。细胞可以是天然感受态的和/或人工诱导(例如，在实验室中)成感受态的。当通过具体方法例如具体转化方法引入细胞外遗传物质时，感受态细胞能够吸收细胞外遗传物质。例如，细胞可以对于一种转化方法为感受态的，但对于另一种方法却并不是如此。或者或另外，细胞可以对于多于一种转化方法为感受态的。感受态细胞可以获自任何各种来源。例如，它们可以从自然界分离，在实验室中制备，和/或从市场上购得。细胞的感受态可以是暂时的或永久的。
组分：术语“组分”当在本文中对于细胞使用时意指细胞的任何部分，如细胞中所含的结构、结构的一部分、大分子复合物和/或分子，包括但不限于细胞膜、细胞壁、细胞核、细胞溶质、遗传物质(例如染色体)、细胞器或任何前面提到的组分中所含的生物分子的任何部分。通常在细胞中含有的细胞器可以取决于细胞类型而不同。例如，一些细胞器仅存在于真核细胞中。一些细胞器仅存在于植物细胞中，并且一些细胞器仅存在于动物细胞中。细胞器的类型的非限制性实例为细胞核、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、溶酶体、空泡、高尔基体、内质网、核糖体以及中心体。细胞中所含的生物分子的非限制性实例包括，但不限于核酸(例如DNA和/或RNA)、多肽(例如蛋白质)、核蛋白复合物、脂质和磷脂。一些细胞可以含有外源遗传物质(例如通过人的手引入到细胞中的物质)。所述外源物质包括在这个定义内。一些细胞可以具有细胞外组分，如细胞外囊、鞭毛或菌毛(伞毛)。这些细胞外组分也包括在这个定义内。
同时表达：如本文所使用，术语“同时表达”或“组合的”是指其中编码PUFA生物合成酶多肽或酶多肽复合物的一部分(例如Δ12去饱和酶和Δ5延长酶)的两种或更多种PUFA生物合成多核苷酸以不少于最低数量经过一个时间间隔被共同表达的事件，即它们编码的多肽以不可忽略的数量共同存在。时间间隔可以是数分钟(例如至少1分钟、1-30分钟、30-60分钟)、数小时(例如至少1小时、1-2小时、2-6小时、6-12小时、12-24小时)、数天(例如至少1天、1-2天、2-4天、4-7天等)、数周(例如至少1、2或3周)等。因此，两种或更多种PUFA生物合成多核苷酸可以但不一定作为单个表达盒(即由相同启动子驱动)的一部分同时或共同施用，或同时转化到一个或多个质粒上的宿主细胞中。此外，两种或更多种PUFA生物合成多核苷酸可以但不一定在彼此的短时间(例如，间隔小于1小时、小于30分钟、小于10分钟、近似5分钟)内被依次转化到宿主细胞中。两种或更多种PUFA生物合成多核苷酸可以在所述时间间隔内被施用以便被认为在大致上相同的时间内被施用。当同时施用时，引起具体生物反应所需要的由两种或更多种PUFA生物合成多核苷酸编码的酶多肽或酶多肽复合物的一部分的有效量可以小于当单独施用多核苷酸时每种的有效浓度。多种PUFA生物合成多核苷酸的作用可以但不一定是相加的或协同的。PUFA生物合成多核苷酸可以被转化多次。
协调表达：如本文所使用，术语“协调表达”是指工程化编码PUFA生物合成酶多肽或酶多肽复合物的一部分(例如Δ12去饱和酶和Δ5延长酶)的至少两种PUFA生物合成多核苷酸的表达，以使得所述多核苷酸被同时、在大致上相同的时间内或逐步地表达，以使得一种PUFA生物合成多核苷酸的表达以时间的方式跟随另一种PUFA生物合成多核苷酸表达。协调表达可以通过将至少两种PUFA生物合成多核苷酸操作地连接至相同的调节序列或启动子来实现。例如，相同的外源启动子可以用来表达至少两种不同的多核苷酸序列，或操作地连接自然控制一种PUFA生物合成基因的表达的内源启动子以便控制另一种PUFA生物合成基因的表达。举例来说，来自Δ12去饱和酶的启动子被操作地连接至编码Δ5去饱和酶的多核苷酸(外源的或内源的)，以使得宿主细胞在相同时间内源地表达它的Δ12去饱和酶和异源地表达Δ5去饱和酶。协调表达可以通过诱导型启动子系统来实现。协调表达还包括工程化的系统，其中将至少一种第一PUFA生物合成多核苷酸表达的增加与至少一种第二PUFA生物合成多核苷酸表达的减少组合。表达的协调减少可以同时、在大致上相同的时间内或逐步地发生，以使得所述减少以时间的方式跟随另一种多核苷酸表达的增加。
工程化：一般来说，术语“工程化”是指通过人的手来操纵的方面。例如，当不按自然界中的顺序连接在一起的两个或更多个序列通过人的手来操纵而在工程化的多核苷酸中彼此直接连接时，多核苷酸被认为是“工程化”的。例如，工程化的多核苷酸可以包括存在于自然界中与第一编码序列操作性结合，但不与第二编码序列操作性结合的调节序列，所述调节序列通过人的手来连接以便使其与第二编码序列操作地结合。举例来说，破囊壶菌属Δ4或Δ5去饱和酶启动子连接至编码除了破囊壶菌属Δ4或Δ5去饱和酶多肽以外的多肽的核酸。同等地，如果已对细胞或生物体进行操纵以使其遗传信息发生改变(例如，引入先前不存在的新遗传物质，例如通过转化、交配、体细胞杂交或其他机制来实现；或先前存在的遗传物质发生改变或被移除，例如通过取代或缺失突变或通过交配方案来实现)，那么所述细胞或生物体被认为是“工程化”的。举例来说，外源破囊壶菌属Δ12去饱和酶基因被引入到宿主细胞中并在宿主细胞内表达。如同常见作法，并且本领域技术人员应了解，工程化的多核苷酸或细胞的子代通常仍被称为“工程化”的，即使对先前实体进行实际操纵也是如此。
内源的：如本文所使用的术语“内源的”是指对宿主细胞是天然的核酸序列。
外源的：如本文所使用的术语“内源的”是指在宿主细胞中不是天然(即来自不同生物体)的核酸序列。
遗传修饰：如本文所使用的术语“遗传修饰”是指通过使用基因工程化由人的手进行操纵。术语“遗传修饰”涵盖对细胞遗传物质进行的任何类型的改变，包括对细胞遗传物质的核苷酸(例如DNA或RNA)序列的改变和对细胞遗传物质的化学修饰(例如，可以影响基因座表达的修饰，如甲基化)。以这种方式操纵的细胞或生物体被认为是“遗传修饰”的或“转基因”的。例如，如本文所使用的术语“转基因细胞”是指其DNA含有最初不存在于非转基因细胞中的外源核酸的细胞。转基因细胞可以来源于转化的细胞或由转化的细胞再生或来源于转基因细胞。示例性转基因细胞包括但不限于转基因破囊壶菌或破囊壶菌属细胞，以及被工程化以表达一种或多种破囊壶菌或破囊壶菌属多核苷酸序列的转基因非破囊壶菌或非破囊壶菌属细胞。转基因细胞通常表达赋予细胞不同于相同菌株的天然非转基因细胞的特征的DNA序列。转基因细胞的子代通常也被认为是转基因的。
异源的：如本文所使用的术语“异源的”是指核酸(例如包括调节序列和/或基因的核酸)或多肽，是指人工引入到细胞中和/或不是天然存在于其所存在的细胞中的核酸或多肽。异源核酸可以具有与天然存在于细胞中的核酸相同的核苷酸序列。例如，破囊壶菌宿主细胞被工程化以包括具有破囊壶菌或破囊壶菌属调节序列的核酸。在具体的实例中，内源破囊壶菌或破囊壶菌属调节序列可操作地连接至在天然条件下不涉及调节序列的基因。尽管破囊壶菌或破囊壶菌属调节序列可以天然地存在于宿主细胞中，但根据本公开所引入的核酸是异源的。异源核酸可以具有不同于天然存在于细胞中的任何核酸的核苷酸序列。对具体细胞是异源的核酸具有与天然存在于来源生物体中的核酸相同的核酸序列，所述来源生物体不同于将异源核酸引入到其中的细胞。如本文所使用的“异源的”还可以指天然存在于宿主细胞中但在一定条件下或一定时间内(例如生长条件、发育阶段、细胞周期阶段等)会被引起表达的基因、蛋白质、多核苷酸或多肽，在所述条件和时间过程中，基因、蛋白质、多核苷酸或多肽通常不能被表达。同样地，如本文所使用的“异源的”还可以指在一定时间内或在一定条件下，下调或抑制基因、蛋白质、多核苷酸或多肽的表达，在所述时间和条件过程中，基因、蛋白质、多核苷酸或多肽通常被表达。
宿主细胞：如本文所使用，“宿主细胞”是根据本公开操纵的细胞。例如，操纵宿主细胞以使得增加其产生的一种或多种PUFA(例如，通过PUFA增加修饰)。如本文所使用的“修饰的宿主细胞”是与另外的相同亲代细胞相比和/或与具体参考细胞(例如野生型细胞)相比，根据本公开来修饰、工程化或操纵的任何宿主细胞。修饰的宿主细胞具有至少一种(并且任选地多于一种)修饰，与亲代或参考细胞相比，所述修饰引起由修饰的宿主细胞产生的PUFA或其他细胞物质增加(例如至少一种PUFA增加修饰)。
引入：如本文对于将核酸引入到细胞或生物体中所用的术语“引入”意在具有其最广泛的含义并且涵盖例如通过转化方法(例如氯化钙介导的转化、电穿孔、粒子轰击)引入，并且还涵盖通过包括转导、缀合和交配的其他方法引入。任选地，利用载体来将核酸引入到细胞或生物体中。
分离的：如本文所使用的术语“分离的”意指相对于细胞或生物体中的序列或多肽大致上分开的或纯化的，其中核酸是天然存在的并且包括通过标准纯化技术纯化的核酸以及通过重组技术或化学合成制备的核酸。所述术语包括来源于分离的核酸的cDNA分子和来源于分离的核酸的其他人工产生的核酸或其部分，其编码与分离的核酸大致上相同的遗传信息。术语“大致上相同的遗传信息”是指核酸序列与本文所描述的核酸具有至少80％序列同一性和/或是本文所描述的分离的核酸的保守取代的变体。
微藻类：在本领域中，微藻类被公认为代表多样化的一组生物体。出于本文件的目的，术语微藻类将被用来描述来源于水环境和/或陆地环境(一些蓝藻细菌是居住在陆地/土壤)的单细胞微生物。水环境从海洋环境延伸至淡水湖和河流，并且还包括含盐的环境如江口和河口。微藻类可以是光合作用的；任选地，微藻类是异养的。微藻类可以具有真核生物性质或具有原核生物性质。微藻类可以是非运动性的或运动性的。
可操作地连接：如本文所使用，可互换地使用的术语“可操作地连接”或“可操作地偶联”是指两个核酸序列之间的关系，其中核酸序列之一的表达是通过另一个核酸序列来控制、调节或调整。例如，可操作地连接至第二核酸序列的核酸序列直接或间接地共价连接至所述第二序列，虽然任何有效的三维结合是可以接受的。单一核酸序列可以可操作地连接至多个其他序列。例如，单一启动子可以引导多个RNA种类的转录。
多肽：如本文所使用的术语“多肽”一般具有其在技术上公认的具有至少三个氨基酸的聚合物的含义。然而，所述术语也用于指特定功能类别的多肽，例如像去饱和酶、延长酶等。对于每个所述类别，本公开提供了所述多肽的已知序列的数个实例。然而，本领域的普通技术人员应了解，术语“多肽”意在足够普遍地不仅涵盖具有本文中(或在本文所提到的参考资料或数据库中)所列出的完整序列的多肽，而且还涵盖代表所述完整多肽的功能性片段(即保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域的普通技术人员了解到，蛋白质序列一般容许在不破坏活性的情况下有一些取代。因此，保留活性并且与相同类别的另一种多肽共有至少约30％-40％总序列同一性，常常大于约50％、60％、70％或80％，并且进一步通常在一个或多个高度保守区中包括至少一个具有更高同一性，常常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的区，通常涵盖至少3-4个并且常常高达20个或更多个氨基酸的任何多肽涵盖在如本文所使用的相关术语“多肽”之内。本领域普通技术人员可以通过分析本文所描述的各种多肽的序列来确定具有相似性和/或同一性的其他区。正如本领域普通技术人员所知，各种策略是已知的，并且用于执行氨基酸或核苷酸序列的比较以便评估同一性和/或相似性程度的工具是可利用的。这些策略包括例如手动比对、计算机辅助的序列比对和其组合。许多用于执行序列比对的算法(所述算法一般由计算机实施)是广泛可用的，或可以由本领域技术人员来产生。代表性的算法包括例如Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.,1981,2:482)；Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.,1970,48:443)；Pearson和Lipman的搜索相似性的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),1988,85:2444)；和/或这些算法的计算机化实施(例如，WisconsinGenetics软件包发布7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.)。容易获得的合并这些算法的计算机程序包括例如BLASTN、BLASTP、GappedBLAST、PILEUP、CLUSTALW等。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用相应程序的默认参数。或者，实践者可以取决于他的或她的实验要求和/或其他要求而使用非默认参数(参见例如，网址：URLwww.ncbi.nlm.nih.gov)。
PUFA生物合成途径：“PUFA生物合成途径”是产生PUFA和/或PUFA前体的生物合成途径。
PUFA生物合成基因：如本文所使用的术语“PUFA生物合成基因”或“多不饱和脂肪酸生物合成基因”是指编码一种或多种PUFA生物合成多肽的DNA或RNA多核苷酸或核酸。
PUFA生物合成多肽：如本文所使用的术语“PUFA生物合成多肽”或“多不饱和脂肪酸多肽”是指涉及PUFA产生的多肽，所述PUFA如但不限于：α亚麻酸(“ALA”)、花生四烯酸(“ARA”)、二十二碳六烯酸(“DHA”)、二十二碳五烯酸(“DPA”)、二十碳五烯酸(“EPA”)、γ-亚麻酸(“GLA”)、亚油酸(“LA”)和/或亚麻酸。PUFA生物合成多肽包含可在最终产生PUFA的合成途径中催化特定步骤的酶。PUFA生物合成多肽可以是脂肪酸合酶。PUFA生物合成多肽可以催化脂肪酸的延长。PUFA生物合成多肽可以催化脂肪酸的去饱和。术语“PUFA生物合成多肽”还可以涵盖本身不会催化合成反应，但可调节有此作用的其他多肽的表达和/或活性的多肽。PUFA生物合成多肽包括例如脂肪酸合酶多肽、延长酶多肽、Δ9去饱和酶多肽、Δ12去饱和酶多肽、Δ6去饱和酶多肽、Δ8去饱和酶多肽、Δ5去饱和酶多肽、Δ4去饱和酶多肽和ω3去饱和酶多肽。
PUFA修饰：如本文所使用的术语“PUFA修饰”是指增加或减少宿主细胞产生至少一种PUFA的对所述宿主细胞所作的修饰。一些修饰需要PUFA增加修饰；即产生增加引起一种或多种PUFA的水平比野生型高至少1％-1000％，例如比将修饰引入到其中的亲代细胞和/或比具体参考细胞(例如野生型细胞)高约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％。一些修饰需要PUFA减少修饰；即产生减少引起一种或多种PUFA的水平比野生型低至少1％-1000％，例如比将修饰引入到其中的亲代细胞和/或比具体参考细胞(例如野生型细胞)低约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％。举例来说，一种或多种PUFA的产生可以减少，而至少一种其他PUFA的产生增加。因此，PUFA增加修饰可以增加一种或多种PUFA生物合成多肽的表达或活性。举另一个实例说明，PUFA增加修饰可以降低一种或多种会干扰PUFA生物合成多肽的表达或活性(包括例如通过与PUFA生物合成多肽竞争接近底物)的多肽的表达或活性。任选地，某些PUFA生物合成多肽的表达增加和其他PUFA生物合成多肽的表达减少的组合被工程化以便定制宿主细胞的PUFA产生分布。任选地，PUFA增加修饰包括将异源核酸引入到宿主细胞中。PUFA增加修饰可以增加细胞中的脂肪酸总水平。任选地，PUFA增加修饰增加细胞中的一种或多种特定PUFA的总水平，并且或并不增加细胞中的脂肪酸总水平。任选地，PUFA增加修饰增加包括但不限于ALA、ARA、DHA、DPA、EPA、GLA和/或LA的PUFA的水平。任选地，PUFA增加修饰通过相对于特定的一种或多种PUFA减少其他一种或多种PUFA的水平来相对于细胞中的一种或多种其他PUFA增加一种或多种特定PUFA的水平。PUFA修饰可以涵盖增加和/或减少多种PUFA的水平。
PUFA产生分布：术语“PUFA产生分布”当在本文使用时是指在给定的一组条件下由宿主细胞产生的脂肪酸的总数。PUFA产生分布可以由细胞产生的多不饱和脂肪酸的任何组合或范围组成。PUFA产生分布可以或可以不包括由参考细胞产生的多不饱和脂肪酸。PUFA产生分布由PUFA生物合成途径产生。因此，PUFA产生分布可以通过PUFA修饰来改变、减少或增加。例如，PUFA产生分布可以被工程化以使得宿主细胞产生大于总脂肪酸含量的0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、10.0％、20％、40％或更多的特定PUFA。修饰PUFA产生分布的一般方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号7,247,461，所述专利以引用的方式并入本文)。
子代：术语“子代”当在本文对于细胞使用时意指由另一个细胞(“亲代细胞”)(例如通过细胞分裂或出芽)产生的细胞，以使得“子代细胞”含有亲代细胞的至少一些遗传物质。子代细胞可以含有亲代细胞的所有遗传物质。任选地，子代细胞并不含有亲代细胞的所有遗传物质。任选地，子代细胞含有除亲代细胞的遗传物质以外的一些遗传物质。另外的遗传物质可以对细胞的菌株或种类是异源的。术语“子代”意指不仅涵盖亲代细胞的直接子代(例如由亲代细胞单次分裂或出芽而产生的细胞)，而且涵盖亲代细胞的所有间接子代(例如由亲代细胞多于一次的分裂或出芽循环而产生的细胞)。因此，给定的亲代细胞可以具有许多细胞子代，即使所述细胞在每次分裂或出芽循环中仅产生有限数目的(例如两个)细胞也是如此。术语“子代”也意指涵盖通过人的手经历一次或多次操纵(例如被遗传操纵或被基因工程化)的细胞。因此，例如，当亲代细胞系被遗传操纵或基因工程化时，由此产生的所有细胞被认为是所述细胞系的子代。那些子代的所有子代也被认为是亲代细胞系的子代，以此类推。
启动子或启动子元件：如本文所所用，术语“启动子”、“启动子元件”和“调节序列”是指可调节可操作地连接至启动子的所选多核苷酸序列的表达并且影响细胞中的所选多核苷酸序列的表达的多核苷酸。如本文所使用的术语“破囊壶菌属启动子”是指在破囊壶菌属细胞中起作用的启动子。如本文所使用的术语“破囊壶菌启动子”是指在破囊壶菌细胞中起作用的启动子。在一些实施方案中，启动子元件是编码序列的非翻译区(UTR)5’或包括编码序列的非翻译区(UTR)5’。5’UTR形成mRNA转录物的一部分并且因此是真核生物体中蛋白质表达的主要部分。转录之后，5’UTR可以在转录水平和翻译水平上调节蛋白质表达。常见的5’UTR调节结构包括核糖开关和上游的开放阅读框(uORF)。在核糖开关中，mRNA二级结构形成能够结合细胞代谢物或蛋白质的适体。响应于结合适体和/或响应于相关的mRNA二级结构变化，确认刺激、压制或引起相关开放阅读框的交替剪接。存在于微藻类中的已知实例包括对甲硫氨酸响应的METE核糖开关和对硫胺素响应的Thi4核糖开关。
参考细胞：如本文所使用的短语“参考细胞”是指出于比较目的相对于至少一个特征是正常的细胞。例如，用于与基因工程化的细胞作比较的参考细胞可以是未被基因工程化的细胞。参考细胞可以不含遗传修饰或可以是野生型菌株的细胞。任选地，参考细胞含有特征在于与其相比较的具体菌株的一些遗传修饰，但不含有特征在于与其相比较的具体菌株的一种或多种遗传修饰。例如，这样的参考细胞将可用于评价其不含有的一种或多种遗传修饰的作用。因此，例如，术语“参考破囊壶菌属细胞”(或“参考破囊壶菌细胞”)意指与其相比较的细胞相同或类似的菌株的破囊壶菌属细胞(或破囊壶菌细胞)，所不同的是参考破囊壶菌属细胞(或参考破囊壶菌细胞)缺乏与参考破囊壶菌属细胞(或参考破囊壶菌细胞)相比较的破囊壶菌属细胞(或破囊壶菌细胞)的一种或多种特征(例如一种或多种遗传修饰)。参考细胞还可以是任何种类的宿主细胞，所不同的是参考宿主细胞缺乏工程化的宿主细胞的一种或多种特征(例如转化到宿主细胞中的具体破囊壶菌或破囊壶菌属基因)。
选择性标记：如本文所使用的短语“选择性标记”是指编码允许选择的产物(蛋白质)的核苷酸序列(例如基因)，或基因产物(例如蛋白质)本身。术语“选择性标记”在本文中是如同本领域中对其普遍理解的那样来使用并且是指在细胞或生物体内的存在可在某些限定的培养条件(选择性条件)下赋予细胞或生物体显著的生长或存活优势或劣势的标记。例如，所述条件可以是存在或不存在特定化合物或特定环境条件，如增加的温度、增加的辐射、在无标记时存在毒性化合物等。存在或不存在这样一种或多种化合物或一种或多种环境条件被称为“选择性条件”或“数个选择性条件”。“生长优势”意指相对于另外的相同细胞或生物体活力增强(例如具有生长优势的细胞或生物体相对于另外的相同细胞，平均具有增加的寿命)、增殖速率增加(在本文中也称为“生长速率”)或两者。一般来说，相较于缺乏生长优势的另外的相同细胞群体，具有生长优势的细胞群体将展现较少的死亡或不能存活的细胞和/或较大的细胞增殖速率。尽管通常选择性标记将赋予细胞生长优势，但是某些选择性标记赋予细胞生长劣势，例如它们使细胞对某些化合物或环境条件的有害效应比不表达标记的另外的相同细胞更加敏感。抗生素抗性标记是一类能用于选择表达标记的细胞的选择性标记的非限制性实例。在适当浓度的抗生素(选择性条件)存在下，这样的标记赋予表达标记的细胞生长优势。因此，表达抗生素抗性标记的细胞能够在抗生素存在下存活和/或增殖，而不表达抗生素抗性标记的细胞不能在抗生素存在下存活和/或无法增殖。例如，常用于植物细胞中的这种类型的选择性标记是NPTII蛋白质，其编码提供针对抗生素卡那霉素(kanamycin)的抗性的蛋白质。更广泛地，选择性标记被归类为选择性化合物或抗生素和营养的或营养缺陷的标记。
选择性标记的实例包括常见的细菌抗生素，如但不限于氨苄青霉素(ampicillin)、卡那霉素和氯霉素(chloramphenicol)，以及已知的在微藻类中起作用的选择性化合物；实例包括rrnS和AadA(氨基糖苷类3’-腺苷酰转移酶)，rrnS和AadA可以从大肠杆菌(E.coli)质粒R538-1中分离出来，并且在大肠杆菌和一些微藻类中分别赋予壮观霉素(spectinomycin)和链霉素(streptomycin)抗性(Hollingshead和Vapnek1985；Meslet-Cladière和Vallon2011)。另一个实例是23SRNA蛋白质rrnL，rrnL赋予红霉素(erythromycin)抗性(Newman,Boynton等1990；Roffey,Golbeck等1991)。另一个实例是Ble，Ble是赋予博来霉素抗性的从印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichushindustanus)中分离出来的富含GC的基因(Stevens,Purton等1996)。Aph7是又一个实例，Aph7是赋予潮霉素B(hygromycinB)抗性的来源于吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的氨基糖苷磷酸转移酶基因(Berthold,Schmitt等2002)。另外的实例包括：AphVIII，来源于龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)的VIII型氨基糖苷3’-磷酸转移酶，AphVIII在大肠杆菌和一些微藻类中赋予巴龙霉素(Paromycin)抗性(Sizova,Lapina等1996；Sizova,Fuhrmann等2001)；Nat&Sat-1，其编码来自诺尔丝链霉菌(Streptomycesnoursei)的诺尔丝菌素(nourseothricin)乙酰转移酶和来自大肠杆菌的链丝菌素(streptothricin)乙酰转移酶，Nat&Sat-1赋予诺尔丝菌素抗性(Zaslavskaia,Lippmeier等2000)；Neo，赋予氨基糖苷类抗性的氨基糖苷3’-磷酸转移酶；卡那霉素、新霉素(neomycin)和类似物G418(Hasnain,Manavathu等1985)；以及Cry1，赋予吐根碱(emetine)抗性的核糖体蛋白S14(Nelson,Savereide等1994)。其他选择性标记包括营养标记，也被称为自养标记或营养缺陷标记。这些包括基于光合生物体内的光合活性的恢复而施加选择的光能自养标记。光能自养标记包括：AtpB、TscA、PetB、NifH、psaA和psaB(Boynton,Gillham等1988；Goldschmidt-Clermont1991；Kindle,Richards等1991；Redding,MacMillan等1998；Cheng,Day等2005)。替代的或另外的营养标记包括：ARG7，其编码精氨基琥珀酸裂解酶，这是精氨酸生物合成中的关键步骤(Debuchy,Purton等1989)；NIT1，其编码为氮代谢所必需的硝酸还原酶(Fernández,Schnell等1989)；THI10，其是硫胺素生物合成所必需的(Ferris1995)；以及NIC1，其催化烟酰胺生物合成中的重要步骤(Ferris1995)。所述标记一般是在生物合成途径中起作用以产生细胞生长或存活所需要的化合物的酶。一般来说，在非选择性条件下，所需化合物存在于环境中或通过替代途径在细胞中产生。在选择性条件下，需要其中涉及标记的生物合成途径起作用以产生化合物。
选择剂：如本文所使用的短语“选择剂”是指可对细胞或细胞群体引入选择性压力以有利于或对抗具有选择性标记的细胞或细胞群体的试剂。例如，选择剂是抗生素并且选择性标记是抗生素抗性基因。任选地，博来霉素被用作选择剂。
来源生物体：如本文所使用的“来源生物体”是天然地含有或产生根据本公开待引入到接受细胞或宿主细胞中的多核苷酸、多肽或其他化合物(例如异源核酸)的生物体。相关考虑因素可以包括例如，潜在来源和宿主生物体在进化中如何密切相关、或来源生物体与从其中选择其他相关核酸和/或多肽的序列的其他来源生物体如何相关。当多个不同的异源核酸待引入到宿主细胞中和/或由宿主细胞表达时，不同序列可以来自不同来源生物体，或来自相同来源生物体。举例来说，各个多肽可以代表具有复杂蛋白质活性的各个亚基，和/或可以为与其他多肽协同作用以便实现本公开的目标所需。任选地，可能将会希望这样的多肽来自相同的来源生物体，和/或是充分相关的以在宿主细胞中共同表达时适当地起作用。这样的多肽可以来自不同、甚至不相关的来源生物体。将进一步了解到，在异源多肽待在宿主细胞中表达时，可能希望利用编码多肽的核酸序列，所述多肽已被调整以适应宿主细胞的密码子偏好性和/或使编码序列与在宿主细胞中具有活性的调节元件连接。例如，当宿主细胞是破囊壶菌属细胞时，将会常常希望改变编码给定多肽的基因序列，以使得其更接近地符合这种细胞的密码子偏好性。任选地，对编码给定多肽的基因序列进行优化，甚至当这样的基因序列来源于宿主细胞本身(并且因此不是异源的)时也如此。例如，编码感兴趣的多肽的基因序列可以没有被密码子优化用于在给定宿主细胞中表达，即使这样的基因序列是从宿主细胞菌株中分离出来也是如此。可以对基因序列进行进一步优化以考虑到宿主细胞的密码子偏好性。本领域普通技术人员将会知道宿主细胞密码子偏好性并且将能够采用本文所公开的方法和组合物来优化给定多肽在宿主细胞中的表达。
底物：如本文所使用描述酶的底物的“底物”是指可以通过酶的活性来修饰的任何实体。
终止子：如本文所使用，术语“终止子”是指阻止用于成熟的靶标的表达(例如添加polyA尾)的或给予可操作地连接至细胞中的终止子的所选多核苷酸序列mRNA稳定性的多核苷酸。终止子序列可以在基因中处于终止密码子的下游。如本文所使用的术语“破囊壶菌属终止子”是指在破囊壶菌属细胞中起作用的终止子。如本文所使用的术语“破囊壶菌终止子”是指在破囊壶菌细胞中起作用的终止子。
破囊壶菌：如本文所使用的术语“破囊壶菌”是指破囊壶菌目的任何成员，其包括破囊壶菌科的成员。被描述为破囊壶菌的菌株包括以下生物体：目：破囊壶菌目；科：破囊壶菌科；属：破囊壶菌属(种类：属种，阿迪门多(arudimentale)、金黄色(aureum)、碧席考拉(benthicola)、格罗波(globosum)、金尼(kinnei)、动孢(motivum)、多基底增殖(multirudimentale)、厚皮(pachydermum)、普罗弗(proliferum)、罗斯(roseum)、斯托特(striatum))、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种类：属种，埃摩拜迪(amoeboidea)、科格尼斯(kerguelensis)、米钮塔(minuta)、普罗弗达(profunda)、雷迪安(radiate)、塞仑(sailens)、赛卡瑞那(sarkariana)、斯佐凯(schizochytrops)、维格斯(visurgensis)、优克尼斯(yorkensis))、裂殖壶菌属(Schizochytrium)(种类：属种，黄金石斛(aggregatum)、黎姆萘瑟(limnaceum)、芒格(mangrovei)、迷你藻(minutum)、欧托(octosporum))、日本壶菌属(Japonochytrium)(种类：属种，包括麦尼(marinum))、不动壶菌属(Aplanochytrium)(种类：属种，海罗迪(haliotidis)、科格仑斯(kerguelensisi)、普罗弗达(profunda)、斯托凯(stocchinoi))、阿尔托尼氏壶菌属(Althornia)(种类：属种，克劳迪(crouchii))或埃氏壶菌属(Elina)(种类：属种，玛瑞萨(marisalba)、欣诺瑞弗卡(sinorifica))。在吾肯氏壶菌属内描述的种类将会被认为是破囊壶菌属的成员。被描述为在破囊壶菌属内的菌株与被描述为处于裂殖壶菌属内的菌株拥有共同特性，并且也可以被描述为处于裂殖壶菌属内。例如，在分类学的分类中，ONC-T18可以被认为在破囊壶菌属内，而在其他分类中，它可以被描述为在裂殖壶菌属内，因为它包含指示两种属的特性。
转化：如本文所使用的术语“转化”是指将外源或异源核酸分子(例如载体或重组核酸分子)引入到接受细胞或微生物中的方法。外源或异源核酸分子可以或可以不被整合到(即共价连接至)构成宿主细胞或微生物基因组的染色体DNA中。例如，外源或异源多核苷酸可以维持在附加型元件(例如质粒)上。或者或另外，外源或异源多核苷酸可以变得整合到染色体中以使得其通过染色体复制由子细胞遗传。用于转化的方法包括但不限于磷酸钙沉淀；Ca2+处理；接受细胞与含有重组核酸的细菌原生质体融合；用含有重组核酸的脂质体处理接受细胞；DEAE葡聚糖；使用聚乙二醇(PEG)进行的融合；电穿孔；磁穿孔(magnetoporation)；生物射弹递送；逆转录病毒感染；脂转染；和直接将DNA微量注射到细胞中。任选地，外源或异源核酸通过与另一种细胞交配而引入到一种细胞中。例如，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中，细胞彼此交配。
转化的：如对于细胞所使用的术语“转化的”是指已对细胞进行如本文所述的“转化”，以使得细胞携带外源或异源遗传物质(例如重组核酸)。术语“转化的”也可以或替代地用来指微生物、微生物菌株、组织、生物体等。
详述
如本文所述，本公开提供了与产生PUFA和/或修饰破囊壶菌相关的各种试剂和方法。总体上，本公开涉及修饰破囊壶菌宿主细胞，并且具体地涉及工程化破囊壶菌，具体地涉及增加或定制所述破囊壶菌对感兴趣的化合物(例如，PUFA)的产生。本公开涵盖了鉴定某些破囊壶菌和破囊壶菌属种遗传调节元件和基因，以及开发诱变破囊壶菌或破囊壶菌属的方法。本公开进一步提供了工程化的破囊壶菌和破囊壶菌属种菌株，以及由其产生并且使用其产生的产物。本公开还提供了工程化具有破囊壶菌基因的非破囊壶菌宿主细胞，以便引发、增加或定制宿主细胞中的PUFA产生。更详细地讨论了这些和其他方面的具体方面的某些细节。
破囊壶菌可以在细胞脂滴中产生和累积更多量的ω-3(n-3)PUFA和ω-6(n-6)PUFA。一些破囊壶菌通过两个途径产生PUFA：聚酮合酶样(PUFA合酶)途径(常见于海洋细菌)和也常见于真核生物的去饱和酶/延长酶(所谓的“标准”)途径。在这些途径中的许多各个基因和关键合成接点是已知的(参见，例如图1)。然而，涉及这些途径以产生特定的、所希望的最终产物和具有某些范围的特定PUFA的总脂肪酸组合物的代谢工程化的有效可能性仍未确定。
宿主细胞
如上所述，本公开提供了用于操纵宿主细胞的试剂和方法。
一般来说，可以与任何适当的宿主细胞一起使用所鉴定的试剂(例如调节元件、载体、选择性标记、诱变剂等)和方法(包括例如诱变方法)。已经阅读本公开和手边具有所述试剂的普通技术人员将能够容易地鉴定其中所述元件是活性的适当的宿主细胞。
可以用于所提供的方法、组合物和试剂盒中的宿主细胞包括微藻类。可以使用的微藻类包括但不限于东方曲壳藻(AchnanthesOrientalis)、阿格门氏藻属(Agmenellum)、透明苗形藻(Amphiprorahyaline)、咖啡形双眉藻(Amphoracoffeiformis)、咖啡形双眉藻线形变种(Amphoracoffeiformislinea)、咖啡形双眉藻斑点变种(Amphoracoffeiformispunctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(Amphoracoffeiformistaylori)、咖啡形双眉藻细薄变种(Amphoracoffeiformistenuis)、优美双眉藻(Amphoradelicatissima)、优美双眉藻头状变种(Amphoradelicatissimacapitata)、双眉藻属(Amphorasp.)、鱼腥藻属(Anabaena)、多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、镰形纤维藻(Ankistrodesmusfalcatus)、黄金色藻(Boekeloviahooglandii)、波氏藻属(Borodinellasp.)、布朗尼葡萄藻(Botryococcusbraunii)、苏台德葡萄藻(Botryococcussudeticus)、小型片球藻(Bracteococcusminor)、中核片球藻(Bracteococcusmedionucleatus)、四鞭藻属(Carteria)、纤细角毛藻(Chaetocerosgracilis)、牟勒氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、牟勒氏角毛藻亚盐变种(Chaetocerosmuellerisubsalsum)、角毛藻属(Chaetocerossp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、蒙氏衣藻(Chlamydomonasemoewusi)、极地雪藻(Chlamydomonasnivalis)、尾裸藻(Chlamydomonascaudate)、无石肖小球藻(Chlorellaanitrata)、南极洲小球藻(Chlorellaantarctica)、黄绿小球藻(Chlorellaaureoviridis)、念球菌小球藻(Chlorellacandida)、囊状小球藻(Chlorellacapsulate)、干燥小球藻(Chlorelladesiccate)、捕圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、浮水小球藻(Chlorellaemersonii)、淡褐小球藻(Chlorellafusca)、淡褐小球藻空腔变种(Chlorellafuscavar.vacuolata)、谷氏小球藻(Chlorellaglucotropha)、水溪小球藻(Chlorellainfusionum)、水溪小球藻栖海岸变种(ChlorellaInfusionumvar.actophila)、水溪小球藻增大变种(Chlorellainfusionumvar.auxenophila)、凯氏小球藻(ChlorellaKessleri)、分叶小球藻(Chlorellalobophora)(菌株SAG37.88)、黄绿小球藻(Chlorellaluteoviridis)、黄绿小球藻金绿变种(Chlorellaluteoviridisvar.aureoviridis)、黄绿小球藻淡黄变种(Chlorellaluteoviridisvar.lutescens)、红藻小球藻(Chlorellaminiata)、极微小球藻(Chlorellaminutissima)、突变小球藻(Chlorellamutabilis)、夜间小球藻(Chlorellanocturna)、卵圆形小球藻(Chlorellaovalis)、小形小球藻(Chlorellaparva)、嗜光小球藻(Chlorellaphotophila)、普氏小球藻(Chlorellapringsheimii)、原始小球藻酸居变种(Chlorellaprotothecoidesvar.acidicola)、规则小球藻(Chlorellaregularis)、规则小球藻极小变种(Chlorellaregularisvar.minima)、规则小球藻伞状变种(Chlorellaregularisvar.umbricata)、瑞氏小球藻(Chlorellareisiglii)、嗜糖小球藻(Chlorellasaccharophila)、海洋小球藻捕圆变种(Chlorellasaccharophilavar.ellipsoidea)、海水小球藻(Chlorellasalina)、单纯小球藻(Chlorellasimplex)、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)、小球藻属(Chlorellasp.)、球抱小球藻(Chlorellasphaerica)、斯蒂格小球藻(Chlorellastigmatophora)、变种小球藻(Chlorellavariabilis)、万尼氏小球藻(Chlorellavanniellii)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、普通小球藻粗皮变型(Chlorellavulgarisf.tertia)、普通小球藻自养变体(Chlorellavulgarisvar.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(Chlorellavulgarisvar.viridis)、普通小球藻普通变种(Chlorellavulgarisvar.vulgaris)、普通小球藻普通变种粗皮变型(Chlorellavulgarisvar.vulgarisf.tertia)、普通小球藻普通变种绿色变型(Chlorellavulgarisvar.vulgarisf.Viridis)、黄色小球藻(Chlorellaxanthella)、左氏小球藻(Chlorellazofingiensis)、他伯氏小球藻(Chlorellatrebouxioides)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、水溪绿球藻(ChlorococcumInfusionum)、绿球藻属(ChlorococcumSp.)、绿梭藻属(Chlorogonium)、蓝隐藻属(Chroomonassp.)、金球藻属(Chrysosphaerasp.)、胶球藻C-169(CoccomyxasubellipsoideaC-169)、球隹丐板藻属(Cricosphaerasp.)、寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、隐藻属(Cryptomonassp.)、隐秘小环藻(Cyclotellacryptica)、梅尼小环藻(Cyclotellameneghiniana)、小环藻属(Cyclotellasp.)、杜氏藻属(Dunaliellasp.)、拜尔代维勒杜氏藻(Dunaliellabardawil)、Dunaliellabioculata、颗粒状杜氏藻(Dunaliellagranulate)、海生杜氏藻(Dunaliellamaritime)、微小杜氏藻(Dunaliellaminuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliellaparva)、Dunaliellapeircei、DunaliellaPrimolecta、盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)、陆生杜氏藻(Dunaliellaterricola)、Dunaliellatertiolecta、绿色杜氏藻(Dunaliellaviridis)、Dunaliellatertiolecta、绿色独球藻(Eremosphaeraviridis)、独球藻属(Eremosphaerasp.)、后棘藻属(Ellipsoidonsp.)、裸藻(Euglena)、披剌藻属(Franceiasp.)、克罗脆杆藻(Fragilariacrotonensis)、脆杆藻属(Fragilariasp.)、蓝鼓藻属(Gleocapsasp.)、丽丝藻属(Gloeothamnionsp.)、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)、膜胞藻属(Hymenomonassp.)、等鞭金藻(Lsochrysisaff.galbana)、球等鞭金藻(Lsochrysisgalbana)、鱗孔藻属(Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、微星藻属(Micractinium)、微胞藻(Micromonas)、细小微胞藻(Micromonaspusilla)、微小单针藻(Monoraphidiumminutum)、单针藻属(Monoraphidiumsp.)、侏囊菌属(Nannochlorissp.)、盐生微绿球藻(Nannochloropsissalina)、微绿球藻属(Nannochloropsissp.)、截形舟形藻(Naviculaacceptata)、毕氏舟形藻(Naviculabiskanterae)、特氏舟形藻(Naviculapseudotenelloides)、具膜舟形藻(Naviculapelliculosa)、腐生舟形藻(Naviculasaprophila)、舟形藻属(Naviculasp.)、肾鞭藻属(Nephrochlorissp.)、肾藻属(Nephroselmissp.)、普通菱形藻(Nitschiacommunis)、亚历山大菱形藻(Nitzschiaalexandrina)、普通菱形藻(Nitzschiacommunis)、细端菱形藻(Nitzschiadissipata)、碎片菱形藻(Nitzschiafrustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschiahantzschiana)、平庸菱形藻(Nitzschiainconspicua)、中型菱形藻(Nitzschiaintermedia)、小头菱形藻(Nitzschiamicrocephala)、微小菱形藻(Nitzschiapusilla)、微小菱形藻捕圆变种(Nitzschiapusillaelliptica)、微小菱形藻莫纳变种(Nitzschiapusillamonoensis)、四边形菱形藻(Nitzschiaquadrangular)、菱形藻属(Nitzschiasp.)、念珠藻属(Nostocsp.)、点状念珠藻(NostocPunctiforme)、掠鞭藻属(Ochromonassp.)、小卵囊藻(Oocystisparva)、卵泡藻(Oocystispusilla)、卵囊藻属(Oocystissp.)、沼泽颤藻(Oscillatorialimnetica)、颤藻属(Oscillatoriasp.)、拟短形颤藻(Oscillatoriasubbrevis)、真核微藻(Osterococcus)、鞭毛真核微藻(Osterococcuslucimarinus)、海洋真核微藻(Osterococcustauri)、凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri)、嗜酸帕氏藻(Pascheriaacidophila)、巴夫藻属(Pavlovasp.)、噬菌体属(Phagus)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricomutum)、席藻属(Phormidium)、扁藻属(Platymonassp.)、颗石藻(Pleurochrysiscarterae)、齿状纹石藻(Pleurochrysisdentate)、颗石藻属(PleurochrysisSp.)、原绿球藻(Prochlorococcusmarinus)、威克海姆原壁藻(Protothecawickerhamii)、大型无绿藻(Protothecastagnora)、波多黎各原壁藻(Protothecaportoricensis)、桑椹型无绿藻(Protothecamoriformis)、饶氏原藻(Protothecazopfii)、水生假小球藻(Pseudochlorellaaquatica)、塔胞藻属(Pyramimonassp.)、桑葚藻属(Pyrobotrys)、不透明红球菌(Rhodococcusopacus)、金藻(Sarcinoidchrysophyte)、被甲栅藻(Scenedesmusarmatus)、蓝藻属(Scynechocystissp.)、聚蓝球藻(Scynechococcus)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)、裂丝藻属(Stichococcussp.)、集球藻属(Synechococcussp.)、四角藻属(Tetraedron)、假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)、四爿藻属(Tetraselmissp.)、瑞典四爿藻(Tetraselmissuecica)、威氏海链藻(ThalassiosiraweissfIogii)、弗里德里恰氏绿毛藻(ViridiellaFridericiana)和团藻(Volvoxcarteri)。
宿主细胞可以是真菌。宿主细胞真菌的非限制性实例包括可适用于代谢工程化的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和产油酵母(oleaginousyeast)(例如隐球酵母(Cryptococcuscurvatus)、特瑞可拉斯隐球酵母(Cryptococcusterricolus)、假丝酵母(Candidasp.)、油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、产油油脂酵母(Lipomyceslipofer)、产脂拟内抱霉(Endomycopsisvernalis)、粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、瘦弱红酵母(Rhodotorulagracilis)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica))。另外的真菌包括被孢霉属(Mortierella)、酒色被孢霉(Mortierellavinacea)、高山被孢霉(Mortierellaalpine)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、淡紫青霉(Pennicilliumiilacinum)、汉逊酵母属(Hensenulo)、毛壳菌属(Chaetomium)、枝孢菌属(Cladosporium)、樟绒枝霉(Malbranchea)、根霉菌属(Rhizopus)和腐霉属(Pythium)。
任选地，根据本公开使用的宿主细胞是破囊壶菌细胞。任选地，宿主细胞是破囊壶菌目的成员。任选地，宿主细胞是破囊壶菌科亚纲的成员。任选地，宿主细胞是选自由以下组成的组的属的成员：破囊壶菌属、吾肯氏壶菌属、裂殖壶菌属、橙黄壶菌属、不动壶菌属、葡萄串壶菌属(Botryochytrium)、日本壶菌属、椭圆壶菌属、帕里蒂氏壶菌属(Parietichytrium)和葫芦状壶菌属(Sicyoidochytrium)。任选地，宿主细胞不属于裂殖壶菌属。
根据本公开使用的宿主细胞包括破囊壶菌属的成员。任选地，宿主细胞是来自以下种类之一的破囊壶菌属细胞：聚合破囊壶菌(Thraustochytriumaggregatum)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytriumaureum)、盖氏破囊壶菌(Thraustochytriumgaertnerium)、金尼破囊壶菌(Thraustochytriumkinnei)、动孢破囊壶菌(Thraustochytriummotivum)、多基底增殖破囊壶菌(Thraustochytriummultirudimentale)、厚皮破囊壶菌(Thraustochytriumpachydermum)、罗斯破囊壶菌(Thraustochytriumroseum)、破囊壶菌属种1.3A4.1、破囊壶菌属种ATCC26185、破囊壶菌属种BL13、破囊壶菌属种BL14、破囊壶菌属种BL2、破囊壶菌属种BL3、破囊壶菌属种BL4、破囊壶菌属种BL5、破囊壶菌属种BL6、破囊壶菌属种BL7、破囊壶菌属种BL8、破囊壶菌属种BL9、破囊壶菌属种BP3.2.2、破囊壶菌属种BP3.3.3、破囊壶菌属种caudivorum、破囊壶菌属种CHN-1、破囊壶菌属种FJN-10、破囊壶菌属种HK1、破囊壶菌属种HK10、破囊壶菌属种HK5、破囊壶菌属种HK8、破囊壶菌属种HK8a、破囊壶菌属种KK17-3、破囊壶菌属种KL1、破囊壶菌属种KL2、破囊壶菌属种KL2a、破囊壶菌属种ONC-T18、破囊壶菌属种PJA10.2、破囊壶菌属种TR1.4、破囊壶菌属种TRR2、纹状破囊壶菌(Thraustochytriumstriatum)或威瑟氏吾肯氏破囊壶菌(Thraustochytriumvisurgense)。
根据本公开使用的宿主细胞还包括裂殖壶菌属的成员。任选地，宿主细胞是来自以下种类之一的破囊壶菌属细胞：蛞蝓裂殖壶菌(Schizochytriumlimacinum)、红树林裂殖壶菌(Schizochytriummangrovei)、小裂殖壶菌(Schizochytriumminutum)、裂殖壶菌属种(ATCC20111)、裂殖壶菌属种(ATCC20888)、裂殖壶菌属种BR2.1.2、裂殖壶菌属种BUCAAA032、裂殖壶菌属种BUCAAA093、裂殖壶菌属种BUCACD152、裂殖壶菌属种BUCARA021、裂殖壶菌属种BUCHAO113、裂殖壶菌属种BURABQ133、裂殖壶菌属种BURARM801、裂殖壶菌属种BURARM802、裂殖壶菌属种FJU-512、裂殖壶菌属种KH105、裂殖壶菌属种KR-5、裂殖壶菌属种PJ10.4、裂殖壶菌属种SEK210、裂殖壶菌属种SEK345、裂殖壶菌属种SEK346、裂殖壶菌属种SR21或裂殖壶菌属种TIO01。
任选地，宿主细胞是破囊壶菌属种ONC-T18细胞。ONC-T18是最初从加拿大新斯科舍省芬迪湾阿德沃基特港(AdvocateHarbor,BayofFundy,NovaScotia,Canada)的盐沼草叶子中分离出来的海洋破囊壶菌。ONC-T18描述于美国专利公布2009/0117194中，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。任选地，破囊壶菌属细胞具有与SEQIDNO:68至少97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高(例如包括100％)相同的18srRNA序列。任选地，宿主细胞是来自以ATCC菌株登记号PTA-6245保藏的细胞的破囊壶菌属种ONC-T18细胞。
工程化微生物
本公开尤其提供了用于操纵微生物如破囊壶菌的基因、调节元件、核酸构建体、选择性标记、诱变方法和转化方法。本文所提供的工具可以单独使用并且以各种组合形式使用以实施任何希望的遗传修饰。例如所提供的转化方法用来引入编码一个或多个基因的核酸分子。核酸分子可以包括本文所提供的编码PUFA生物合成多肽的基因以及启动子、终止子或选择性标记序列或其组合。任选地，所提供的诱变方法用来产生具有所希望的性质的菌株(例如破囊壶菌菌株)。所述菌株也可以被转化(例如用包括本文所提供的一个或多个调节元件的核酸)。
在PUFA合成途径中编码各种酶的一种或多种基因可以被转化到宿主细胞中，以便定制宿主细胞和它的子代的PUFA产生分布。通过选择所希望的外源基因的组合，内源基因可操作地连接至异源启动子，并且外源基因可操作地连接至内源启动子。本文所公开的合成途径可以被操纵以实现特定或优选表达一种或多种预先确定的PUFA。例如，如果希望优化用于生物燃料的PUFA产生分布，则本领域的技术人员可以使用本文所公开的多核苷酸、方法和宿主细胞来可操作地连接来自Δ12去饱和酶基因的异源启动子以驱动内源或外源的Δ5去饱和酶的表达，从而将PUFA产生定制为ARA和EPA。
任何多个遗传修饰可以被工程化以实现所希望的PUFA产生或产生分布。本文所公开的一种或多种核酸序列可以被过表达，例如以便抑制或阻止具有大于18个碳的碳链并且去饱和大于1的PUFA的合成。本文所公开的基因调节元件可以被可操作地连接至一个或多个异源或内源基因，以便以依赖时间或依赖条件的方式定制基因的激活。能够操纵的基因的非限制性实例包括控制通向PUFA途径的碳流量的脂肪酸合酶、以特定的链长度的方式催化脂肪酸生物合成的终止的硫酯酶和控制合成所希望的化合物的终止步骤的延长酶和/或去饱和酶。
一般来说，本文所公开的多核苷酸作为允许合理工程化PUFA生物合成途径以产生各种产物的一系列工具而起作用。换句话说，本文所公开的多核苷酸可以被相互交换，并且它们的表达可以多种组合的任一种按时间控制或同步化。本领域的技术人员将能够相应地使用本文所公开的工具，仅需要另外掌握待操纵的生物合成途径(参见，例如图1)和检测、测量和/或分离所希望的最终产物的手段。例如，在细胞生长和脂肪酸产生的两个时期过程中，去饱和酶启动子(例如SEQIDNO.69的Δ12去饱和酶启动子)或其可操作的片段可以被可操作地连接至脂肪酸合酶(FAS)1型基因以增加脂肪酸生物合成。
任选地，PUFA产生分布(包括所有的脂肪酸生物合成途径和所产生的产物)可以被定制以产生预先确定的组合物，所述组合物包含至少两种在规定范围或优化用于具体用途(例如生物燃料生产)的范围内的脂肪酸产物。例如，通常希望使生物燃料中的长链多不饱和脂肪酸(“LCPUFA”；例如DHA)水平最小化。通过操纵本文所公开的PUFA生物合成多肽和它们对应的核酸序列，任选地结合指出的培养条件，是有可能产生其中LCPUFA水平小于总脂肪酸含量的近似25％的脂肪酸油组合物。任选地，产生具有小于总脂肪酸含量的近似20％、15％、10％、5％和1％的LCPUFA水平的脂肪酸油组合物。任选地，LCPUFA具有至少约20个、至少约22个、至少约24个、至少约26个、至少约28个或至少约30个碳原子。任选地，LCPUFA为二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。
如贯穿本文所讨论，所提供的生物体可以涵盖表达基因的遗传修饰。然而，任选地，微生物被工程化以降低编码另一种PUFA生物合成多肽的基因表达。例如，破囊壶菌或破囊壶菌属可以被工程化以降低延长酶或去饱和酶的表达。任选地，破囊壶菌或破囊壶菌属可以被工程化具有降低或消除的Δ12去饱和酶表达。降低微生物中的基因表达的方法在本领域中是熟知的；例如敲除或等位基因互换构建体和反义RNA。
任选地，来自一种破囊壶菌或破囊壶菌属PUFA生物合成基因的调节元件(例如，一种或多种启动子)可操作地连接异源PUFA生物合成基因，以便定制所述基因的表达。对于表达，可以定制表达以匹配指数增长过程中的特定基因的基础表达水平或协调基因表达的近似同等的水平。
任选地，多于一种PUFA生物合成基因在工程化的微生物中被同时地或共同地表达以便定制PUFA产生分布。可以从任何数量的表达载体中表达基因。例如，每个基因可包含各自在各个质粒上的表达载体。或者，为了减少质粒的数量，可以将PUFA生物合成基因置于三个质粒、两个质粒或单个质粒上。具有多个表达盒的质粒载体是本领域中熟知的。可以将编码脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ4去饱和酶、聚酮PUFA合酶(PKS)、Δ5去饱和酶和Δ12去饱和酶的任何组合的基因置于一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个质粒上。也可以使用多顺反子的表达构建体和基于操纵子的表达构建体。
因此，提供了工程化的微生物，其可来源于或创建于任何前面提到的宿主种类，包括裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。工程化的微生物表达一种或多种异源核酸，所述异源核酸相对于宿主细胞或野生型种类改变或定制工程化的微生物中的PUFA生物合成。任选地，以本文所公开的一种方式或多种方式工程化ONC-T18。例如，PUFA生物合成多核苷酸被异源地表达以使得改变一种或多种PUFA的产生(即相对于无异源多核苷酸存在下的水平发生增加或减少)。任选地，异源表达是过表达。任选地，通过将多核苷酸序列操作地连接至启动子而使编码酶多肽和酶多肽复合物的一部分的内源或外源多核苷酸序列被异源地表达。任选地，启动子对于微生物是外源的。任选地，启动子对于微生物是内源的，但被操作地连接异源(即不同的)PUFA生物合成多核苷酸。其可在通常不能表达酶多肽或酶多肽复合物的一部分的某一时间或一定条件下引起由PUFA生物合成多核苷酸编码的酶多肽或酶多肽复合物的一部分表达。异源启动子可以是例如本领域技术人员已知的公认的启动子，如细菌的乳糖操纵子的Lac启动子、细菌的阿拉伯糖诱导型启动子pBAD或细菌的四环素调节的Tet启动子。或者或另外，所使用的启动子可以是如本领域技术人员所知的存在于真核生物系统中的那些，如TDH3、ADH1、TPI1、ACT1、GPD或PGI或半乳糖诱导型启动子GAL1、GAL7和GAL10。可以被本领域技术人员采用的调节元件包括存在于微藻类中的那些，实例包括：Rbcs2，Rbcs2是提供组成型高水平表达的核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Stevens,Purton等1996)；PsaD，PsaD是允许可以被核蛋白Nac2调节的高水平组成型表达的光合系统I亚单元D的启动子(Fischer和Rochaix2001)；PsbA，PsbA是光合系统II基因PsbA和5’UTR的启动子。这些调节元件产生高水平的重组蛋白累积(Manuell,Beligni等2007；Surzycki,Greenham等2009)。或者或另外，调节元件包括热激蛋白70A增强子元件Hsp70A，Hsp70A减少核转化体中的基因沉默并且通常与Rbcs2启动子组合采用(Schroda,等2000)。或者或另外，可以采用天然蛋白质的调节序列来驱动异源基因的表达。这种天然蛋白质的调节序列的实例可以包括脂肪酸生物合成蛋白质的启动子，包括由于氮胁迫而诱导的那些启动子。具体实例或启动子包括Δ12去饱和酶的调节序列(例如SEQIDNO:69)、Δ15去饱和酶的调节序列(例如SEQIDNO:71)、Δ4去饱和酶的调节序列和Δ5延长酶的调节序列。或者或另外的启动子可以包括响应于生物过程条件中的经济上可行的变化而诱导的那些启动子。所述变化可以包括通过降低搅拌速率而诱导缺氧或厌氧反应，例如，相关的调节元件将包括驱动碳酸酐酶的表达、有机碳和/或氮的变化或消耗的那些调节元件。启动子可以是组成型或诱导型。
虽然核酸调节序列或启动子可以增加其操作地连接到的多核苷酸的表达，但异源调节序列或启动子也可以降低其连接到的多核苷酸的表达。这种作用可以取决于生长阶段或条件。例如，如果Δ5去饱和酶的调节序列被操作地连接以控制PKS基因簇的表达，PKS复合物的表达将在指数增长时期过程中并且也在微生物不在生长或以降低的速率生长时的脂肪酸产生过程中显著降低。
任选地，仅使用本文所公开的调节序列的具体启动子元件。例如，可以使用本领域技术人员已知的分析工具在硅片上鉴定SEQIDNO:69的Δ12去饱和酶的具体多核苷酸启动子元件。(参见例如D.J.Studholme&R.Dixon,2003,Domainarchitecturesofsigma54-dependenttranscriptionalactivators,J.Bacteriol,185:1757-67；R.Münch等,2005,Bioinformatics200521:4187-4189；L.Gordon等,2003,Bioinformatics19:1964-71；J.M.Carlson等,2007,Nucl.AcidsRes.35:W259-W264；冷泉港实验室的转录调节元件数据库；生物信息瑞士研究所的真核生物启动子数据库。)然后可以使用标准基因工程化技术(例如PCR、限制性消化/连接和在报告构建中排列元件以评价对在各种条件、生长期等下表达报告基因的影响)，将这些启动子元件分离和重排并且相应地优化表达。任选地，来自不同调节序列(例如Δ5去饱和酶和Δ12去饱和酶)的多核苷酸启动子元件可以被组合成杂交启动子元件，以便以不可预期的但可确定的方式驱动基因表达。
一些工程化的微生物可以包括操作地连接不同PUFA生物合成多核苷酸的异源启动子的多种组合。任选地，编码涉及PUFA生物合成的酶多肽和酶多肽复合物的一部分的至少另外的异源多核苷酸被转化到微生物中。任选地，另外的异源多核苷酸包括脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。-
可以根据本领域中已知的方法将异源核酸序列和启动子引入到宿主细胞或工程化的微生物中。可以将序列置于一个或多个表达盒或表达载体中，并且引入到一个或多个质粒上的细胞中。可以使用常规技术(例如电穿孔和基于阳离子脂质的技术)将异源序列转化到细胞中。将异源序列转化到宿主细胞中的另外的技术包括醋酸锂转化、原生质球法、原生质体融合、脂质转染、转染、转导、结合、感染等。可以如本文中的实例所公开的方法构建表达载体。
可以将一个或多个异源(外源或内源)启动子序列引入到细胞中并且通过同源重组将其操作地连接至选择的内源PUFA生物合成多核苷酸。内源PUFA生物合成多核苷酸可以在染色体外位于质粒上或被整合到(即共价连接至)构成宿主细胞基因组的染色体DNA中。
由于以上所讨论的修饰，以预先确定的方式影响工程化的微生物的PUFA产生分布和总脂肪酸含量。因此，相对于无异源核酸序列或启动子存在下的含量，工程化的微生物可以具有增加至少10％、20％、50％、100％或更多的细胞的总脂肪酸含量。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少。相对于无异源核酸序列或启动子的表达存在下的所述脂肪酸的含量，C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的水平可以减少至少10％、20％、50％、100％或更多。
PUFA生物合成多核苷酸的异源表达可以影响工程化的宿主细胞中的总PUFA产生分布。例如，本文所公开的任一种PUFA生物合成多核苷酸的异源表达可以增加宿主细胞的总脂肪酸含量，并且具体地增加具有四个或更多个双键的PUFA的含量。例如，本文所公开的多核苷酸的过表达和任选地同时的和协调的表达可以增加具有四个或更多个双键的PUFA(例如DHA、DPA、ARA)的产生，以使得宿主细胞产生的具有多于四个双键的PUFA量大于总脂肪酸含量的0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、10.0％、20％、40％或更多。
基因表达
本公开涵盖了用于工程化微生物的组合物和方法。任选地，本公开提供了用于工程化破囊壶菌(例如，破囊壶菌属)的组合物和方法。“工程化”细胞包括已被修饰(例如通过引入外源核酸)的细胞以及其保留所述修饰的子代。
本公开提供了包括来自破囊壶菌或破囊壶菌属的调节序列的核酸。真核生物中的基因表达常常需要种类特异性的或在密切相关的生物体中起作用的调节序列。来自破囊壶菌或破囊壶菌属的调节序列的可用性允许感兴趣的基因在破囊壶菌中表达。任选地，调节序列包括启动子序列和终止子序列。
PUFA生物合成肽和它们对应的多核苷酸可以在任何宿主细胞中被转化和表达。例如，破囊壶菌或破囊壶菌属去饱和酶(例如SEQIDNO.70的Δ12去饱和酶)和/或延长酶(例如Δ5延长酶)可以在酿酒酵母中被表达以增加油酸向亚油酸的转化(参见，例如图1)和/或EPA向二十二碳五烯酸的转化，从而定制PUFA产生。任选地，显性阴性的破囊壶菌或破囊壶菌属去饱和酶可以被转化到非破囊壶菌或破囊壶菌属宿主细胞中以引起油酸的累积。可以通过本文所公开的诱变方法来产生显性阴性的PUFA生物合成肽。
提供了包括破囊壶菌或破囊壶菌属启动子的分离的核酸。任选地，本文所提供的核酸包括破囊壶菌属Δ4去饱和酶基因启动子。示例性Δ4去饱和酶基因启动子的序列示于SEQIDNO:24中。任选地，本文所提供的核酸包括破囊壶菌属Δ5延长酶基因启动子。示例性Δ5延长酶基因启动子的序列示于SEQIDNO:19中。破囊壶菌属Δ5延长酶基因启动子在破囊壶菌(例如破囊壶菌属)中是强启动子。任选地，本文所提供的核酸包括破囊壶菌或破囊壶菌属微管蛋白基因启动子。示例性破囊壶菌属微管蛋白基因启动子的序列示于SEQIDNO:6和SEQIDNO:10中。任选地，本文所提供的核酸包括破囊壶菌属Δ12去饱和酶基因启动子。示例性Δ12去饱和酶基因启动子的序列示于SEQIDNO:69中。任选地，本文所提供的核酸包括破囊壶菌Δ5去饱和酶基因启动子。示例性Δ5去饱和酶基因启动子的序列示于SEQIDNO:71中。本文所提供的用于使用的核酸可以与以上所述的SEQID具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
本申请还提供了包括破囊壶菌或破囊壶菌属基因的分离的核酸。任选地，本文所提供的基因包括破囊壶菌属Δ12去饱和酶基因。示例性Δ12去饱和酶基因的序列示于SEQIDNO:70中。任选地，Δ12去饱和酶基因可以与SEQIDNO:70具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。任选地，Δ12去饱和酶基因是破囊壶菌属种ONC-T18Δ12去饱和酶。任选地，本文所提供的基因包括破囊壶菌属Δ5去饱和酶基因。示例性Δ5去饱和酶基因的序列示于SEQIDNO:72中。任选地，Δ5去饱和酶基因可以与SEQIDNO:72具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。任选地，Δ5去饱和酶基因是破囊壶菌属种ONC-T18Δ5去饱和酶。
可以通过其与对应的核酸序列杂交时的条件来描述分离的核酸分子。例如，提供了在严格条件下与对应于SEQIDNO:70或SEQIDNO:72的核酸序列杂交的分离的核酸分子。杂交的严格性由杂交步骤和洗涤步骤的任一种或这两种的温度和盐浓度控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可以涉及在低于Tm(一半分子从它们的杂交配偶体中解离的熔解温度)的近似12℃-25℃的温度下在高离子强度溶液(6XSSC或6XSSPE)中杂交，接着在选择以使得洗涤温度为低于Tm约5℃至20℃的温度和盐浓度的组合下洗涤。温度和盐条件在初步实验中凭经验容易被确定，在所述初步实验中固定在滤膜上的参考DNA样品与感兴趣的标记的核酸杂交，然后在具有不同严格性的条件下洗涤。对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交，杂交温度通常是更高的。可以根据上所述以实现严格性的方法或根据本领域中所已知的方法使用条件(Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989；Kunkel等MethodsEnzymol.1987:154:367,1987)。对于DNA:DNA杂交的优选的严格杂交条件可以是在6XSSC或6XSSPE中在约68℃(在水溶液中)下，接着在68℃下洗涤。如果希望，杂交和洗涤的严格性可以根据所希望的互补性程度降低而相应地降低，并且进一步取决于其中搜索可变性的任何区域的G-C或A-T富集度。同样地，如本领域中所已知的，如果希望，杂交和洗涤的严格性可以根据所希望的互补性程度增加而相应地增加，并且进一步取决于其中希望高同源性的任何区域的G-C或A-T富集度。
任选地，本文所提供的包括破囊壶菌或破囊壶菌属启动子的分离的核酸是一种盒子，例如表达盒。任选地，本文所提供的包括破囊壶菌或破囊壶菌属启动子的分离的核酸是一种载体，例如表达载体。
本文提供了被工程化以包括破囊壶菌或破囊壶菌属基因或基因启动子的细胞。任选地，破囊壶菌或破囊壶菌属细胞被工程化以包括破囊壶菌或破囊壶菌属启动子，例如破囊壶菌属Δ4去饱和酶基因启动子、破囊壶菌属Δ5延长酶基因启动子、破囊壶菌属Δ12延伸酶基因启动子、破囊壶菌属Δ5去饱和酶基因启动子或破囊壶菌属微管蛋白基因启动子。
本文提供了宿主细胞，其被工程化以表达编码PUFA生物合成多肽的一种或多种破囊壶菌或破囊壶菌属基因。任选地，仅表达单个基因以便影响宿主细胞中的PUFA生物合成。基因可以是主调节子(例如Δ12去饱和酶)，所述主调节子的过表达会增加总脂肪酸水平并且具体地多不饱和脂肪酸水平。任选地，通过相对于参考细胞中的表达水平的近似2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍或更高的水平来过表达编码一种或多种PUFA生物合成肽的基因。表达水平可以通过本领域技术人员熟知的方法来确定，包括蛋白质印迹、RNA印迹、rtPCR和实时PCR。任选地，协调多个基因的表达来操纵通向一个或多个PUFA生物合成途径的碳流量。可以被操纵的基因包括：Δ12-去饱和酶、Δ9-去饱和酶、Δ8-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶、Δ6-延长酶、Δ5-延长酶、脂肪酸合酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
由于本文所讨论的修饰，以预先确定的方式影响宿主细胞和工程化的微生物的PUFA产生分布和总脂肪酸含量。这些影响可以通过过表达一种或多种PUFA生物合成基因或多核苷酸(例如本文所公开的核酸序列)来实现。任选地，通过过表达编码PUFA生物合成酶或酶多肽(例如Δ12去饱和酶)的至少一种多核苷酸而同时减少编码PUFA生物合成酶或酶多肽(例如PKS)的不同多核苷酸的表达来定制PUFA产生。如本文所讨论，在一些实施方案中通过使用内源或外源启动子的过表达和/或通过协调地或按时间地表达PUFA生物合成多核苷酸的组以引导通向生物合成途径的碳流量从而达到所希望的结果来实现这些影响。因此，本文提供了相对于无异源核酸序列或启动子存在下的含量，能够使宿主细胞的总脂肪酸含量增加至少10％、20％、50％、100％或更多的表达盒和载体。任选地，相对于无异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少。因此，本文提供了相对于无异源核酸序列或启动子的表达存在下的所述脂肪酸的含量，能够使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的水平减少至少10％、20％、50％、100％或更多的表达盒和载体。
提供了包括破囊壶菌或破囊壶菌属基因终止子的分离的核酸。任选地，本文所提供的核酸包括破囊壶菌或破囊壶菌属微管蛋白基因终止子。示例性破囊壶菌属微管蛋白基因终止子的序列示于SEQIDNO:14和SEQIDNO:18中。
任选地，本文所提供的包括破囊壶菌或破囊壶菌属基因和调节序列的分离的核酸包括一种盒子，例如表达盒。任选，本文所提供的包括破囊壶菌或破囊壶菌属基因的分离的核酸是一种载体，例如表达载体。所使用的重组表达载体包括能够在原核细胞和真核细胞中表达的载体。例如，本文所公开的破囊壶菌或破囊壶菌属基因可以在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如杆状病毒)和酵母(参见例如Romanos,M.A.,等(1992)"Foreigngeneexpressioninyeast:areview",Yeast8:423-488；vandenHondel,C.A.M.J.J.等(1991)于MoreGeneManipulationsinFungi中的"Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi",J.W.Bennet&L.L.Lasure编,第396-428页:AcademicPress:SanDiego；以及vandenHondel,C.A.M.J.J.,&Punt,P.J.(1991)于AppliedMolecularGeneticsofFungi中的"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi,Peberdy,J.F.等编，第1-28页,CambridgeUniversityPress:Cambridge)中表达。在各种宿主细胞中基因表达的方法和用于所述表达的适当的载体是本领域中已知的。(参见例如GeneExpressionSystems,Fernandez,J.和Hoeffler,J.P.编,AcademicPress:SanDiego,第1版(1998))。可以通过同时转化多个表达载体将多个表达盒引入到宿主细胞中，各表达盒包含本文所公开的不同基因或在不同调节元件控制下的相同基因。另外或替代地，多个表达盒可以被放置在单个表达载体或载体内。
提供了包括一个或多个基因调节元件的分离的核酸。任选地，所包括的基因调节元件有助于诱导型基因调节。可以与所提供的核酸组合采用的诱导型系统的非限制性实例包括四环素诱导型系统、乙醇诱导型系统和化学诱导型基因表达系统。(参见例如Park和(2005)；Li等(2005)；以及Jepson等(1998)，所述文献各自的全部内容以引用的方式并入本文)。
本文所提供的具有调节序列的核酸可以可操作地连接至异源序列，如编码异源多肽的基因。例如，提供了通常包含可操作地连接至异源核酸序列的破囊壶菌或破囊壶菌属基因启动子的基因表达盒，所述异源核酸序列可操作地连接至破囊壶菌或破囊壶菌属基因终止子。在一个非限制性实例中，基因盒包含可操作连接至编码破囊壶菌属Δ5去饱和酶的多核苷酸的破囊壶菌属Δ12去饱和酶基因启动子。任选地，异源核酸序列包含基因中的至少部分的编码序列，例如异源核酸序列编码基因产物如多肽或RNA。任选地，所提供的基因表达盒进一步包括选择标记(例如博来霉素抗性基因如Shble，或本文所讨论的任何其他选择标记)。任选地，所提供的基因表达盒进一步包括报告基因(例如荧光蛋白(GFP、YFP、RFP)、荧光素酶、mCherry、GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶和β-半乳糖苷酶)。
本文所公开的核酸序列可以可操作地连接至非破囊壶菌启动子序列。实例可以包括存在于细菌中的启动子如Lac、pBAD、Tet；酵母启动子如TDH3、ADH1、TPI1、ACT1、GPD、PGI、GAL1、GAL7和GAL10。真核病毒启动子如SV40，或另外地启动子元件可以从微藻类中分离出来，例如Rbcs2、PsaD、Nac2、PsbA、PspD、FcpA和Hsp70A。包括各种启动子的许多调节控制元件在多样化的种类中是有活化性的。因此，本文所公开的基因启动子可以用来驱动来自本文所描述的任何宿主细胞或在本文所描述的任何宿主细胞中的脂肪酸生物合成基因的表达。同样地，从本文所描述的宿主细胞中分离出来的特异性和组成型有活性的启动子可以用来驱动本文所公开的任何破囊壶菌或破囊壶菌属基因的表达。
如本文所描述，破囊壶菌或破囊壶菌属基因启动子可以可操作地连接至异源核酸序列以驱动所述序列的表达。任选地，基因启动子可操作偶联或连接至表达盒或基因表达载体内的核酸序列。任选地，基因启动子被插入(例如通过同源重组)到宿主细胞基因组内的适当位置中，以便驱动宿主细胞内的PUFA生物合成基因的表达。先前已经在微藻类如普通小球藻(Dawson,Burlingame等1997)和微绿球藻属中证实了同源重组，这两者都证实了有效的同源重组(Kilian,Benemann等2011)。任选地，可以通过非同源重组来实现可操作地偶联。非同源重组在微藻类中是常见的并且不同于同源重组，因为整合到宿主细胞基因组DNA中是独立于DNA序列相似性的。非同源重组提供了转化的细胞群体内的一系列基因表达性质的优势，从而允许定制的和优化的基因表达。微藻类中的非同源重组先前被描述于例如莱茵衣藻(Kindle1990)、团藻(Hallmann和Sumper1994；Schiedlmeier、Schmitt等1994)、三角褐指藻(Apt、Grossman等1996)、假微型海链藻(Poulsen、Chesley等2006)中，所述文献以引用的方式并入本文。
任选地，基因启动子和核酸序列都从破囊壶菌或破囊壶菌属中分离出来。任选地，核酸序列编码PUFA生物合成肽。任选地，破囊壶菌或破囊壶菌属基因启动子和它们可操作地偶联到的核酸序列被转化到破囊壶菌或破囊壶菌属宿主细胞中。基因启动子和/或它可操作地偶联或连接到的核酸序列可以对于宿主细胞是外源的。可以通过将基因置于异源启动子的控制下来影响破囊壶菌或破囊壶菌属去饱和酶基因的表达。异源启动子引起基因在PUFA生物合成途径内不同于它的正常时间或顺序的表达模式而表达。因此，异源启动子可以优化或协调任何PUFA生物合成多肽的表达以操纵通向生物合成途径的碳流量和引导碳转化成特定的最终产物(例如ARA、DHA或EPA)。
破囊壶菌或破囊壶菌属基因启动子可以可操作地连接至分离的破囊壶菌或破囊壶菌属PUFA生物合成途径基因。PUFA生物合成基因启动子可以通过生长阶段、培养条件和底物可用性来影响。一般来说，每一个启动子和/或基因可以独立地起作用，从而允许使用标准分子生物学技术移除或包括每一个；因此提供了优化用于产生特定PUFA或产生具有优化的组分范围的总脂肪酸的工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属菌株。例如，提供了产生含有小于25％、小于20％、小于15％、小于10％和小于5％的长链PUFA组分的油组合物的工程化的菌株。
任选地，Δ12去饱和酶启动子被用来驱动Δ5去饱和酶的表达。任选地，Δ12去饱和酶启动子被用来驱动脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)的表达。任选地，Δ5去饱和酶启动子被用来驱动负责DHA产生的基因或基因簇的表达。例如，Δ5去饱和酶启动子被用来驱动脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ4去饱和酶、Δ12去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)的表达。
任选地，遗传修饰减少一种或多种PUFA生物合成多肽的表达。可以通过本领域中已知的任何手段来完成这种表达的减少，所述手段包括减少转录、翻译、活化或所希望的PUFA多肽的可用性。例如，将基因置于异源启动子的控制下会减少破囊壶菌或破囊壶菌属去饱和酶基因的表达。如本文所讨论，异源启动子引起基因在PUFA生物合成途径内不同于它的正常时间或顺序的表达模式而表达。当遗传修饰减少一种或多种PUFA生物合成肽的表达时，减少的表达可以停止或减缓进入不希望的最终产物的碳流量。例如，减少破囊壶菌或破囊壶菌属去饱和酶基因的表达以阻止或抑制长链多不饱和脂肪酸的合成。任选地，在标准延长/去饱和途径中减少破囊壶菌或破囊壶菌属Δ12去饱和酶基因(例如SEQIDNO.:70)的表达以抑制具有大于18个碳(C18)的和大于1的去饱和(C18:1)的碳链的脂肪酸的合成。这种修饰的影响为减少C18:2和C:22PUFA的PUFA产生分布。所述修饰的影响可以用于生产希望低百分数的C18:2和C:22PUFA的生物燃料。
本文所公开的任何遗传操纵也可以与PUFA合成的次级效应子的工程化组合。例如，调节基因(如用于诱导物、阻遏物、转录因子、稳定剂、转运蛋白的基因或调节PUFA生物合成途径的一种或多种基因的表达的任何基因)可以被引入到宿主细胞中，以便以预先确定的方式影响PUFA合成。
本文所描述的任何遗传修饰可以与现在已知的或以后开发的任何其他修饰组合。例如，破囊壶菌或破囊壶菌属去饱和酶基因(例如Δ12去饱和酶)的过表达或减少的表达可以与对PKS途径或硫酯酶的修饰组合。另外的遗传修饰的非限制性实例包括：酰基-辅酶A脱氢酶、酰基-ACP(酰基载体蛋白)去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰-辅酶A羧化酶、酰基-辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂肪氧合酶、三酰基甘油脂酶、丙二烯氧合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延长酶或其组合。
分子生物学和DNA操纵程序一般可以根据Sambrook等或Ausubel等(SambrookJ、FritschEF、ManiatisT(编).1989.MolecularCloning.ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress:NewYork；AusubelFM、BrentR、KingstonRE、MooreDD、SeidmanJG、SmithJA、StruhlK(编).1998.CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley:NewYork)来进行。
诱变
本公开提供了用于诱变微生物的试剂和/或方法，以及通过诱变产生的菌株和/或细胞。例如，如本文所描述，已经发现抗生素如博莱霉素(bleomycin)、腐草霉素(phleomycin)和/或他利霉素(tallysomycin)可以用来诱变微生物。用于微生物如破囊壶菌(例如破囊壶菌属)的所述有效诱变剂的可用性允许开发具有所希望的特征的菌株。具体来说，本公开证实了博来霉素(腐草霉素D1)可以用来诱变微生物如破囊壶菌(例如破囊壶菌属)。
抗生素博来霉素是来自轮枝链霉菌(Streptomycesverticillus)突变体的培养肉汤的碱性水溶性铜螯合的糖肽(InvivoGen,SanDiego,CA,USA)。博来霉素是抗生素的腐草霉素组的成员，所述抗生素是广泛用作对抗淋巴瘤、头颈部癌和睾丸癌的有效抗肿瘤剂的糖肽(Umezawa等,Newantibiotics,bleomycinAandB,JournalofAntibiot.,(1966)19:200–209；Sikic等,BleomycinChemotherapy,AcademicPress,Orlando,Florida,(1985))。通常认为，这些抗生素的分子作用模式与其通过插入其平面的含联噻唑的部分来结合DNA并且裂解DNA从而产生引起细胞死亡的单链断链或双链断链的能力相关(Povirk等,NucleicAcidsResearch,(1977)4:3573-3580)。由于其针对广谱细胞类型的毒性，这组抗生素被用作用于阳性选择的药物。本公开涵盖以下发现：博来霉素是可用于工业微生物菌株改良的诱变剂。另外，在本文中显示，在博来霉素杀死大多数处理过的细胞的某些浓度下，存活细胞具有增加的突变频率。产生具有突变频率增加的细胞的能力允许更容易地选择和分离诱变的菌株。
还提供了用于诱变破囊壶菌细胞的系统和/或方法。任选地，提供了用于诱变选自由以下组成的组的细胞的系统和方法：破囊壶菌属细胞、吾肯氏壶菌属细胞、裂殖壶菌属细胞、橙黄壶菌属细胞、不动壶菌属细胞、葡萄串壶菌属细胞、日本壶菌属细胞、椭圆壶菌属细胞、帕里蒂氏壶菌属细胞、葫芦状壶菌属细胞、被孢霉属真菌、异养生长的藻类(例如隐甲藻属的种类)。任选地，提供了用于诱变ONC-T18的系统和/或试剂。
任选地，通过施加至包含相关抗生素(例如博来霉素)的适合的固体培养基(例如琼脂培养基)中来诱变微生物，其中抗生素是以在其展现完全或接近完全地抑制细胞生长的浓度以下的浓度存在。用于这些方法的微生物并不携带博来霉素抗性基因(例如Shble)。任选地，抗生素(例如博来霉素)以在其杀死至少85％、90％、95％或100％的所述类型的细胞的浓度以下的浓度用于诱变。任选地，抗生素(例如博来霉素)以在其杀死30％、40％、50％或60％的所述类型的细胞的浓度以上的浓度用于诱变。任选地，抗生素(例如博来霉素)被用于突变。任选地，抗生素以其使暴露于其的细胞中的突变频率增加超过针对所述细胞所观测到的自发突变频率的浓度和条件下使用。任选地，抗生素以其抑制所述类型的细胞生长或杀死60％-80％的所述类型的细胞的浓度和条件下使用。
ONC-T18细胞对浓度为100ug/mL的博来霉素具有高度敏感性(参见实施例3)。因此，博来霉素可以低于100g/mL(例如90g/mL、85g/mL、80g/mL、75g/mL、70g/mL、65g/mL、60g/mL、55g/mL、50g/mL、45g/mL、40g/mL、35g/mL或30g/mL)的浓度用于诱变。任选地，博来霉素以约50g/mL的浓度用于诱变。任选地，其中使用博来霉素诱变细胞的培养基具有18g/L或更小的盐浓度。相对于在较低浓度下或在无诱变剂存在下生长的细胞，诱变的细胞可以显示形态变化。举例来说，诱变的细胞可以显示生长速率、颜色和/或总脂质量或特定脂质量发生改变。
任选地，将细胞(例如破囊壶菌或破囊壶菌属细胞)展布在含有浓度为1-1000μg/mL的抗生素(例如博来霉素)的固体培养基上。任选地，将细胞展布在包含浓度为约100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、1g/mL、5g/mL或更高的抗生素(例如博来霉素)的固体培养基上。分离在这些条件下在至少4天(例如5天、6天、7天、8天、9天或10天)之后出现的菌落。可以测试所分离的细胞由诱变产生的所希望的特征。例如，可以将来自诱变的菌落的细胞与参考细胞(例如亲代细胞)比较以检测如生物质和/或脂质生产率的特征的变化。
提供了通过抗生素(例如博来霉素)诱变来分离的微生物(例如破囊壶菌或破囊壶菌属)。任选地，通过抗生素(例如博来霉素)诱变来分离的微生物菌株(例如破囊壶菌属菌株)产生比亲代或参考菌株多至少10％、20％、30％、40％、50％的总脂质。任选地，通过博来霉素诱变来分离的破囊壶菌菌株产生比亲代菌株多至少10％、20％、30％、40％、50％的ALA、ARA、DHA、DPA、EPA、GLA和/或LA或其组合。任选地，通过博来霉素诱变来分离的破囊壶菌菌株产生比亲代菌株多至少10％、20％、30％、40％、50％的ARA、DHA、EPA或其组合。
通过博来霉素诱变来分离的ONC-T18的一种具体菌株产生比其亲代菌株多约36％的DHA。
选择
提供了用于选择微生物如破囊壶菌(例如破囊壶菌属)的方法。所述方法可以与例如如本文所描述的转化方法结合和/或作为例如如本文所描述的转化方法的一部分来使用，以便对微生物进行遗传操纵。
一般来说，在所提供的选择方法中，选择剂被用来有利于具有适用于选择剂的选择性标记的微生物的生长超过不具有选择性标记的微生物。通常，选择剂抑制、减少和/或减缓不具有选择标记的微生物的生长。在选择过程中，通常在如本文所描述的生长培养基中培养微生物，除了生长培养基补充有选择剂(“选择培养基”)。
任选地，在选择培养基中培养微生物持续足以允许培养物变得主要包含具有选择标记的细胞的一段时间。即，在选择培养基中生长过程中，不具有选择标记的细胞没有生长并且在培养物中被具有选择标记的细胞超越。任选地，在选择培养基中培养微生物持续1至15天、1至12天、或1至9天之间的时间。任选地，在选择培养基中培养微生物持续长于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天和/或短于50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11或10天的一段时间。任选地，在选择培养基中培养微生物持续约3天与约5天、或约5天与约10天之间的时间。任选地，微生物在选择之后保持在选择培养基中。任选地，将微生物转移至不具有选择剂的培养基中持续至少一段时间，例如在恢复期(recoveryphase)过程中。
任选地，在细胞已经在选择培养基中生长一段时间之后移除选择性标记。选择性标记的移除可以在细胞在选择培养基中生长一段时间之后立即进行，在细胞在不具有选择剂的培养基中生长的过程中的“恢复时期”之后或稍后(例如在细胞已经被储存一段时间之后，在细胞已经被冷冻并且然后融化之后)进行。对细胞进行遗传工程化以使得所引入的遗传元件(例如选择性标记)可以稍后被移除的方法是本领域中熟知的。所述方法通常使用重组酶多肽，所述重组酶多肽通常识别特定的核苷酸序列(“识别位点”或“识别序列”)。例如，选择性标记可以被工程化到具有侧接选择性标记的特定重组酶的识别位点的破囊壶菌或破囊壶菌属细胞中。当希望缺失选择性标记时，细胞可以暴露于适当的重组酶(即识别侧接选择性标记的识别位点的重组酶)中，所述重组酶在识别位点上进行同源重组反应，从而引起识别位点之间的核酸序列的缺失或倒位。
任选地，选择剂是抗生素或包括抗生素，并且选择标记是抗生素的抗性基因或包括抗生素的抗性基因。
任选地，使用选择剂的组合和/或使用选择标记的组合。
任选地，微生物通过施加至包含博来霉素的适合的培养基中而经历选择，其中博来霉素以高于阈值浓度的浓度存在。
阈值浓度可以近似对应于博来霉素展现完全或接近完全地抑制不含有博来霉素抗性基因的细胞的生长的浓度。任选地，阈值浓度为博来霉素杀死至少85％、90％或100％的不含有博来霉素抗性基因的所述类型的细胞的浓度或高于所述浓度。任选地，阈值浓度可以根据培养条件(例如盐浓度、培养基类型、培养温度、液体或固体培养物等)而改变。任选地，阈值浓度高于50μg/mL。任选地，阈值浓度为60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL、160μg/mL、170μg/mL、180μg/mL、190μg/mL或200μg/mL或高于60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL、160μg/mL、170μg/mL、180μg/mL、190μg/mL或200μg/mL。任选地，阈值浓度为约100μg/mL或高于约100μg/mL。
抗生素抗性基因可以是腐草霉素、博莱霉素和/或他利霉素抗性基因或可以包括腐草霉素、博莱霉素和/或他利霉素抗性基因。任选地，抗生素抗性基因是来自印度斯坦链异壁菌(S.hidustanus)的基因(例如ble基因)或包括来自印度斯坦链异壁菌的基因(例如ble基因)。
在选择过程中使用的培养基的盐浓度可以不同于在无选择下用于培养微生物的培养基中通常使用的盐浓度。任选地，在选择过程中使用的培养基中的盐浓度近似与在无选择下用于培养微生物的培养基中通常使用的盐浓度相同。任选地，盐浓度是在约10g/L与约40g/L之间，在约15g/L与约35g/L之间，和/或在约18g/L与约35g/L之间。任选地，盐浓度为约18g/L。任选地，盐浓度为约35g/L。
任选地，当培养基的盐浓度为约18g/L时使用30μg/mL或高于30μg/mL的博来霉素浓度。任选地，当培养基的盐浓度为约35g/L时使用100μg/mL或高于100μg/mL的博来霉素浓度。
在选择过程中使用的适合的培养基可以是固体培养基。当使用固体培养基时，可以将微生物展布(例如使用接种环、细胞展布器、珠粒或其他用于展布的机制)在固体培养基的平面表面上以使得可以允许单细胞菌落生长。
可以对单细胞菌落进行挑选并且培养以获得较多和/或充分的数量来用于分析(例如转基因分析、生长特征分析、脂质分布分析等)和/或产生如本文所描述的化合物。或者或另外，由此获得的单细胞菌落和/或培养物可以被储存(例如通过在适当的冷冻培养基中冷冻)以供稍后使用。
转化
提供了用于转化破囊壶菌(例如破囊壶菌属)细胞的方法。所述方法通常包括以下步骤：提供感受态破囊壶菌细胞；将异源(例如重组或工程化的)核酸递送到感受态细胞中，其中重组核酸包含选择性标记；并且在含有选择剂的培养基中培养感受态细胞，所述选择剂在无选择性标记存在下减少细胞生长。
本公开提供了用于遗传转化的感受态破囊壶菌细胞。任选地，感受态细胞属于菌株ONC-T18。所述感受态细胞可以通过任何各种方法来提供，所述方法的非限制性实例更详细地描述于实施例5中。在制备感受态细胞的方法如实施例5中所描述的方法)中，感受态细胞通过使用来自破囊壶菌或破囊壶菌属的所希望的菌株的接种物对固体或液体培养基进行接种并且允许细胞生长，在必要时供应新鲜的培养基来获得。感受态细胞的制备通常涉及在液体培养基中的一个或多个生长时期，接着离心细胞，并且将细胞重新悬浮于无菌液体中达到所希望的细胞密度。感受态细胞可以在实验需要时新鲜制备，和/或可以对其进行制备并且然后加以储存(例如冷冻)以供将来使用。
任选地，细胞在烧瓶(例如体积为250mL、500mL或1L)中生长。
任选地，细胞在富含氮源的培养基中生长。举例来说，细胞在具有高水平蛋白胨的培养基中生长。任选地，细胞在包含至少5-25g/L的蛋白胨(或其他氮源)的培养基中生长。
任选地，细胞在高水平的溶解氧中生长。任选地，在生长过程中，例如以约100rpm至约500rpm、或约125rpm至约400rpm、或约150rpm至约300rpm来搅动细胞。
任选地，在营养繁殖过程中或在旺盛的营养繁殖过程中诱变细胞。任选地，在游动孢子阶段过程中并不诱变细胞。
异源(例如重组、合成(无论以化学方式或以生物学方式)和/或工程化，其中其核酸序列通过人的手来选择)核酸可以是DNA、RNA、RNA:DNA杂交体或其任何适合的衍生物。任选地，重组核酸作为载体的一部分来递送。任何各种载体可以适于根据本公开的方法来使用，所述载体包括但不限于质粒、粘粒、BAC(细菌人工染色体)、YAC(酵母人工染色体)和病毒载体。异源DNA可以是化学合成的多核苷酸或可以包括化学合成的多核苷酸。任选地，异源DNA可以包含酶促合成的多核苷酸。任选地，异源DNA是聚合酶链反应(“PCR”)产物或包括聚合酶链反应(“PCR”)产物。
重组或工程化的核酸通常包含用于如本文所描述的选择方法中的选择标记。通常，选择标记包含允许基因产物表达的基因表达盒，当存在于细胞中时，所述基因表达盒允许细胞在含有如本文所描述的阈值浓度或高于所述阈值浓度的选择剂的选择培养基中生长。例如，当抗生素用作选择剂时，选择标记可以包括用于表达对应的抗生素抗性基因的基因表达盒。
重组或工程化的核酸可以进一步包括用于表达一种或多种希望的基因产物的一个或多个另外的基因表达盒。代表性的一种或多种希望的基因产物可以包括例如具有商业价值的多肽，和/或可以对于合成具有商业价值的一种或多种下游产物(例如像PUFA的化合物)来说重要的多肽(例如酶多肽或其他生物合成途径组分)。或者或另外，希望的基因产物可以赋予微生物某些希望的特征(例如在特定的一组条件下生长的适合性；在大规模生产方法中生长的适合性等)。或者或另外，希望的基因产物可以是允许标记已经转化的细胞的产物。或者或另外，细胞被工程化以产生升高水平的一种或多种生物燃料、药物、疫苗、抗体、脂质、消退素、神经保护素、药物化合物、多肽等。
本文已经描述了通常含于基因表达盒中的元件，例如驱动基因表达的启动子或其他基因调节元件、待表达的基因以及在待转化的微生物中起作用的终止子序列。待表达的基因可以被称为“转基因”。转基因可以是异源基因，例如通常不存在于微生物中的基因。选择标记和另外的基因表达盒的任一种或这两种可以包括这样的异源基因。
因此，适于根据本公开的方法来使用的载体包括基因表达载体。
任选地，将一种重组核酸递送到微生物中。例如，可以使用包含重组核酸的一种质粒构建体来转化微生物。
任选地，将多于一种重组核酸递送到微生物中。例如，可以将质粒构建体的组合(每个质粒构建体包含重组核酸)递送到微生物中。任选地，选择剂和选择标记的组合被用来选择所希望的重组核酸的组合的存在。
用于将遗传物质(例如包含重组核酸的遗传物质)引入到细胞中的任何各种方法可以适于根据本公开的转化方法来使用。引入方法包括但不限于磷酸钙沉淀；Ca2+处理；接受细胞与含有重组核酸的细菌原生质体融合；用含有重组核酸的脂质体处理接受细胞；DEAE葡聚糖；使用聚乙二醇(PEG)进行的融合；电穿孔；磁穿孔；生物射弹递送；逆转录病毒感染；脂转染；和直接将DNA微量注射到细胞中。
可以使用生物射弹递送方法(也称为“基因炮击(genecannon)”、“粒子轰击”和“微抛射”方法)。生物射弹装置使涂覆有重组核酸的颗粒加速至足以穿透细胞膜(和/或细胞壁，如果存在)的速度。任选地，颗粒包含金颗粒或由金颗粒组成。用于生物射弹递送遗传物质的方法是本领域中已知的，并且用于进行所述生物射弹递送的设备和试剂可从市面上购得。参见例如，Sanford等,Part.Sci.Technol.5:27(1987)；Sanford,J.C.,TrendsBiotech.6:299(1988)；Sanford,J.C.,Physiol.Plant79:206(1990)；以及Klein等,Biotechnology10:268(1992)，所述文献各自的全部内容以引用的方式并入本文。
任选地，如本领域普通技术人员将已知并且了解的那样，使用如土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、原生质体转化等方法来递送核酸。
如本文在“选择”部分中所描述，在递送异源(例如重组或工程化的)核酸之后，在含有选择剂的培养基中培养细胞，所述选择剂在无选择性标记存在下减少细胞生长。所选择的细胞(例如展现存在选择性标记并且因此存在重组核酸)可以被储存、分析和/或在希望时以更多数量生长。
任选地，对转化的细胞进行一种或多种分析以确认重组核酸的存在。例如，可以使用PCR分析来确认作为重组核酸的一部分的遗传元件(例如转基因和/或选择性标记)的存在。
工程化的菌株
本公开尤其提供了能够操纵某些微生物如破囊壶菌的基因、调节序列、核酸构建体、转化方法、诱变方法和遗传选择方法。本文所提供的组合物和方法可以在任何多种应用中用来工程化微生物(例如破囊壶菌)。如本文所述，本文所提供的基因、调节序列、核酸构建体和选择性标记可以用来在生物体中表达任何感兴趣的多肽，在所述生物体中序列和/或选择性标记是可操作的(例如在破囊壶菌中)。任选地，表达来自不同生物体的多肽。任选地，表达(例如，过表达)来自宿主细胞的多肽。
微生物可以被工程化以使感兴趣的化合物的产生增加。任选地，微生物被工程化以使脂肪酸、抗氧化剂、消退素和/或保护素的产生增加。或者或另外，细胞被工程化以产生升高水平的一种或多种生物燃料、药物、疫苗、抗体、脂质、消退素、神经保护素、药物化合物、多肽等。
本公开提供了被工程化以具有定制的PUFA产生分布的破囊壶菌微生物(例如破囊壶菌属)。即，提供了工程化的破囊壶菌细胞，其包括至少一种PUFA增加修饰和/或至少一种PUFA减少修饰、其组合和具有特定范围的特定脂肪酸的PUFA组合物。任选地，所述微生物被工程化以使至少一种PUFA生物合成多肽的表达改变(例如增加或减少)。
如图1中所描绘，ONC-T18中的PUFA生物合成涉及由脂肪酸合酶(FAS)酶复合物产生脂肪酸如肉豆蔻酸(C14:0)和硬脂酸(C18:0)，接着在所述脂肪酸上进行一系列酶促反应。每个这些反应通常通过去饱和酶(其移除氢原子以形成碳-碳双键)或延长酶(其通过向脂肪酸的羧酸末端添加两个碳原子来延长脂肪酸)来催化。聚酮PUFA合酶(PKS)复合物还在ONC-T18中产生DHA。ONC-T18中的PUFA生物合成似乎具有至少两个交叉的生物合成途径：ω-6PUFA生物合成途径和ω-3PUFA生物合成途径。ω-6脂肪酸向ω-3脂肪酸的转化可以通过ω-3去饱和酶来催化。因此，如图1中所描绘，在途径中的不同点处产生各种脂肪酸。可以通过本文所提供的基因、调节序列和选择性标记来操纵这些点的任何组合或所有组合。
可以调节编码酶多肽的一个或多个基因在途径中的表达，以便在希望时增加特定PUFA和/或其他脂肪酸的产生。例如，可以下调FAS基因的表达以增加PUFA的产生。下调Δ5延长酶、Δ4去饱和酶、Δ12去饱和酶和/或任何PKS基因的表达可以增加EPA产生和/或PUFA产生。下调任一种PKS基因的表达可以增加ARA产生。上调任何PKS基因的表达可以增加DHA产生。上调Δ5去饱和酶基因的表达可以增加ARA和EPA产生。上调Δ12去饱和酶基因可以减少C12-C18饱和的或单一不饱和的脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和油酸)，从而增加总脂肪。对应地，减少或消除表达将会增加C12-C18饱和的和单一不饱和的脂肪酸的浓度，而显著地减少C18-C22多饱和脂肪酸(例如亚油酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸)以及下游的n-3PUFA和n-6PUFA的水平。
任选地，调节编码酶多肽的一个或多个基因在途径中的表达以便产生生物燃料。例如，下调任何PKS、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、延长酶和ω-3去饱和酶基因的表达和/或上调FAS基因表达可以增加用作生物燃料原料的短链脂质的产生。如果希望优化用于生物燃料的PUFA产生分布，则本领域的技术人员可以使用本文所公开的多核苷酸、方法和宿主细胞来可操作地连接来自Δ12去饱和酶基因的异源启动子以驱动内源或外源的Δ5去饱和酶的表达，从而将PUFA产生定制为ARA和EPA。任选地，PUFA产生分布(包括所有的脂肪酸生物合成途径和所产生的产物)可以被定制以产生预先确定的组合物，所述组合物包含至少两种在规定范围或优化用于具体用途(例如生物燃料生产)的范围内的脂肪酸产物。例如，通常希望使生物燃料中的长链多不饱和脂肪酸(“LCPUFA”；例如DHA)水平最小化。通过操纵本文所公开的PUFA生物合成多肽和它们对应的核酸序列，任选地结合指出的培养条件，是有可能产生其中LCPUFA水平小于总脂肪酸含量的近似25％的脂肪酸油组合物。任选地，产生具有小于总脂肪酸含量的近似20％、15％、10％、5％和1％的LCPUFA水平的脂肪酸油组合物。任选地，LCPUFA具有至少约20个、至少约22个、至少约24个、至少约26个、至少约28个或至少约30个碳原子。任选地，LCPUFA为二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。
途径组分的基因表达的改变(例如下调或上调)可以例如通过同源或非同源重组通过产生基因敲除来实现。通常，使用包括但不限于生物射弹抛射型DNA递送的任何各种技术将线性化DNA构建体引入到细胞中。任选地，同源重组在ONC-T18中的频率大于约30％、40％、50％或更高。
任选地，途径组分的基因表达的改变(例如下调或上调)通过诱变一个或多个基因靶标来实现。诱变可以通过以下手段来进行：化学处理(例如新霉素处理)、微波或UV辐射、定点诱变、易错PCR、基因置换(例如通过同源重组)或本领域技术人员已知的其他手段。
本文所提供的工程化的微生物可以产生大于约4.0g/L培养基的包含n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂质级分。任选地，本文所提供的微生物可以产生大于约20.0g/L培养基的包含n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂质组合物。任选地，微生物可以产生大于约14.0g/L培养基的包含n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂质组合物。任选地，微生物可以产生约1.5g/L至约5.0g/L(例如约4.6g/L)的n-3DHA、约0.5g/L至约1.5g/L(例如约0.22g/L)的n-3EPA以及约0.5g/L至约1.5g/L的n-6DPA。任选地，本文所提供的工程化的微生物可以产生高达至约120g/L产率的包含n-3DHA、EPA、n-6DPA或ARA的脂质组合物，这对应于大于约75％的总脂质。任选地，本文所提供的工程化的微生物可以产生高达至约128g/L产率的包含短链脂肪酸(通常C12-C18脂肪酸)的脂质组合物，这对应于大于约80％的总脂质。此外，微生物可以产生大于300mg/g或甚至800mg/g细胞生物质的包含肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸以及二十二碳五烯酸的脂质级分。任选地，微生物也可以产生细胞生物质内的总脂肪酸含量为301mg/g至800mg/g(等于7700mg/L至20,209mg/L)的级分，所述级分包含44.3mg/g与57mg/g之间的肉豆蔻酸(等于1134.5mg/L至1458.1mg/L)、0.5mg/g至0.65mg/g的肉豆蔻脑酸(等于13.3mg/L至16.63mg/L)、33.5mg/g至34.6mg/g的十五烷酸(等于856.9mg/L至885.1mg/L)、121.9mg/g至165.1mg/g的棕榈酸(等于3118.2mg/L至4923.3mg/L)、7.9mg/g至28.5mg/g的棕榈烯酸(等于202.1mg/L至729mg/L)、4.38mg/g至5.9mg/g的硬脂酸(等于112mg/L至151mg/L)、6.94mg/g至9.9mg/g的油酸(等于177.5mg/L至253.2mg/L)、0.4mg/g至1.3mg/g的亚油酸(等于11.26mg/L至33.3mg/L)、0.5mg/g至1.0mg/g的二十碳二烯酸(等于12.8mg/L至25.6mg/L)、0.4mg/g至0.5mg/g的花生四烯酸(等于10.2mg/L至13mg/L)、75mg/g至100mg/g的二十二碳六烯酸(等于1918mg/L至2560mg/L)、1.9mg/g至6mg/g的二十碳五烯酸(等于48.6mg/L至153.5mg/L)以及17.1mg/g至33.7mg/g的二十二碳五烯酸(等于437.4mg/L至862.1mg/L)。
发酵和生产
所提供的方法包括培养微生物(例如破囊壶菌，例如破囊壶菌属种)的步骤或可以与培养微生物(例如破囊壶菌，例如破囊壶菌属种)的步骤结合使用。对于破囊壶菌的培养方法已经描述于例如美国专利公布US2009/0117194A1中，所述专利的全部内容以引用的方式并入本文。通常，微生物在生长培养基(也称为“培养基”)中生长。任何各种培养基可以适于根据本文所提供的选择方法来使用。通常，培养基为微生物供应各种营养组分，包括碳源和氮源。
可以在增加生物质和/或感兴趣的化合物的产生的条件下培养本文所提供的微生物。通常在生理盐水培养基中培养破囊壶菌。例如，可以在具有约2.0-50.0g/L之间的盐浓度的培养基中培养破囊壶菌。任选地，在具有约2-35g/L之间的盐浓度的培养基中培养破囊壶菌。任选地，在具有约18-35g/L之间的盐浓度的培养基中培养破囊壶菌。在某些情形下已经发现，破囊壶菌在低盐条件下生长良好。任选地，在具有约5-20g/L之间的盐浓度的培养基中培养破囊壶菌。任选地，在具有约5-15g/L之间的盐浓度的培养基中培养破囊壶菌。培养基可以或可以不包括NaCl。培养基可以或可以不包括加入NaCl。任选地，培养基含有人工海盐，例如INSTANTOCEANTM,Aquaria,Inc。培养基可以或可以不包括天然或人工海水。任选地，培养基含有天然或人工海水，例如约2％至100％海水。
氯离子可以引起对发酵器或其他下游加工设备的腐蚀。任选地，降低培养基中的氯化物浓度。任选地，培养基包括含非氯化物的钠盐(例如硫酸钠)作为钠源。例如，总钠量的很大一部分可以由非氯化物盐供应，以使得培养基中小于约100％、75％、50％或25％的总钠量由氯化钠供应。
任选地，培养基的氯化物浓度为小于约3g/L、500mg/L、250mg/L或120mg/L。任选地，培养基的氯化物浓度为约60mg/L与120mg/L之间。
适于根据本公开来使用的非氯化物的钠盐的实例包括，但不限于苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠以及其混合物。参见例如美国专利号5,340,742和6,607,900，所述专利各自的全部内容以引用的方式并入本文。
破囊壶菌培养物的培养基可以包括任何各种碳源。碳源的实例包括脂肪酸；脂质；甘油；三甘油；碳水化合物，如葡萄糖、淀粉、纤维素、半纤维素、果糖、右旋糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原；明胶；淀粉(玉米或小麦)；乙酸盐；m-肌醇(来源于玉米浆)、半乳糖醛酸(来源于果胶)、L-岩藻糖(来源于半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸盐(源自于葡萄糖)、纤维二糖、糊精和α-环糊精(来源于淀粉)；蔗糖(来自糖蜜)；多元醇，如麦芽糖醇、赤藓糖醇、阿东糖醇和油酸，如甘油和吐温80；氨基糖，如N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺；以及任何种类的生物质或废物流。
任选地，培养基包括浓度为约5g/L至约200g/L的碳源。任选地，培养基具有约1:1与约40:1之间的C:N比率(碳氮比)。如果使用两相培养物，那么培养基可以对于第一相具有约1:1至约5:1之间的C:N比率，然后在第二相中具有约1:1至约1:大约0(即没有或几乎没有氮)的C:N比率。
破囊壶菌培养物的培养基可以包括任何各种氮源。示例性氮源包括铵溶液(例如NH4的H2O溶液)、铵盐或胺盐(例如(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4OOCH2CH3(NH4Ac))、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸以及酒糟。氮源在适合的培养基中的浓度通常在约1g/L与约25g/L之间的范围内。
任选地，培养基包括磷酸盐，如磷酸钾或磷酸钠。培养基中的无机盐和微量营养物可以包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰、氯化钙以及EDTA。可以包括维生素，如吡哆醇盐酸盐、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12。
例如，适合的培养基可以包含以下物质：约11g/L与约13g/L之间(例如约12g/L)的硫酸钠、约0.45g/L与约0.55g/L之间(例如约0.5g/L)的KCl、约1.8g/L与约2.2g/L之间(例如约2g/L)的MgSO4·7H2O、约0.3g/L与约0.4g/L之间(例如约0.35g/L)的HodagK-60消泡剂、约0.60g/L与约0.70g/L之间(例如约0.65g/L)的K2SO4、约0.9g/L与约1.1g/L之间(例如约1.0g/L)的KH2PO4、约0.95g/L与约1.1g/L之间(例如约1g/L)的(NH4)2SO4、约0.15g/L与约0.19g/L之间(例如约0.17g/L)的CaCl2·H2O、约2g/L与约10g/L之间(例如约4.5g/L)的95DE玉米糖浆(固体基准)、约2.7mg/L与约3.3mg/L之间(例如约3mg/mL)的MnCl2·4H2O、约2.7mg/L与约3.3mg/L之间(例如约3mg/mL)的ZnSO4·7H2O、约0.035mg/L与约0.045mg/L之间(例如约0.04mg/L)的CoCl2·6H2O、约0mg/L与约0.045mg/L之间(例如约0.04mg/L)的Na2MoO4·2H2O、约1.8mg/L与约2.2mg/L之间(例如约2mg/L)的CuSO4·5H2O、约1.8mg/L与约2.2mg/L之间(例如约2mg/L)的NiSO4·6H2O、约9mg/L与约11mg/L之间(例如约10mg/L)的FeSO4·7H2O、约4mg/L与约15mg/L之间(例如约9.5mh/L)的硫胺素、约0.05mg/L与约0.25mg/L之间(例如约0.15mg/L)的维生素B12、在约1.3mg/L与约5.1mg/L之间(例如约3.2mg.L)泛酸钙以及约28％NH4OH溶液。
在适当时，使用酸或碱，和/或使用氮源将培养基的pH调整至3.0与10.0之间。任选地，将培养基调整至pH为4.0与6.5之间。可以对培养基进行灭菌。
任选地，用于培养微生物的培养基是液体培养基。任选地，用于培养微生物的培养基是固体培养基。除了如本文所讨论的碳源和氮源以外，固体培养基可以含有提供结构支撑和/或允许培养基呈固体形式的一种或多种组分(例如琼脂或琼脂糖)。
可以在1-60天的任何时间对细胞进行培养。任选地，进行培养持续14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天或更少时间。任选地，在4℃至30℃之间，例如18℃至28℃的温度下进行培养。任选地，培养包括通气振荡培养、振荡培养、静置培养、分批培养、半连续培养、连续培养、滚动式分批培养或波动培养(waveculture)等。可以使用常规的搅拌式发酵器、泡罩塔发酵器(分批培养或连续培养)、波动发酵器等进行培养。
任选地，通过振荡对培养物进行通气。任选地，振荡在100rpm至1000rpm，例如350rpm至600rpm、1000rpm至450rpm的范围内。任选地，当培养物在产生脂质时期的过程中时，以与在产生生物质时期的过程中不同的方式(例如，使用不同振荡速度)对培养物进行通气。例如，通过在生物质时期的过程中在约150rpm与约350rpm之间的速度下振荡并且在产生脂质时期的过程中在约30rpm与约120rpm之间的速度下振荡来对培养物进行通气。或者或另外，振荡速度可以取决于培养容器的类型(例如烧瓶形状或尺寸)而改变。
任选地，溶解氧(DO)的水平在生物质产生时期过程中高于其在脂质产生时期过程中的水平，例如DO水平在脂质产生时期的过程中发生降低。任选地，使溶解氧的水平降低至低于饱和值；例如，使溶解氧的水平降低至极低或甚至无法检测的水平。
已经发现，可以通过根据涉及转变一种或多种培养条件以便获得较高数量的希望的化合物的方法培养细胞来提高希望的脂质产生。任选地，首先在使生物质最大化的条件下培养细胞，接着将一个或多个培养条件转变成有利于脂质生产率的条件。所转变的条件可以包括氧浓度、C:N比率、温度以及其组合。任选地，进行二阶段培养，其中第一阶段有利于生物质产生(例如使用高氧条件(例如通常或相对于第二阶段)、低C:N比率和环境温度)，接着为第二阶段，所述第二阶段有利于脂质产生(例如其中氧被减少，C:N比率增加，并且温度降低)。即，所提供的方法可以涉及在第一组条件下培养细胞，所述第一组条件包括选自由以下组成的组的一个或多个条件：第一氧浓度、第一C:N比率、第一温度以及其组合。在这个第一组条件下进行的培养持续第一时间段，其持续时间可以改变。在第一时间段结束时(这并非必定为不连续时间点)，改变一个或多个条件以便在第二组条件下培养细胞，所述第二组条件包括选自由以下组成的组的一个或多个条件：第二氧浓度、第二C:N比率、第二温度以及其组合。任选地，在第一时间段结束时改变一些条件，并且维持一些条件直到第二时间段结束，在所述第二时间段结束时可以再次改变一个或多个条件，和/或可以第一次改变一个或多个条件。任选地，第一C:N比率在约2:1至约1:1的范围内；并且第一温度在约10℃至约30℃的范围内。任选地，第二C:N比率是约1:大约0；并且第二温度在约15℃至约30℃的范围内。
任选地，逐步进行和/或发生从第一条件至第二条件的转变。任选地，突然进行和/或发生从第一条件至第二条件的转变。
任选地，在培养过程中以多种可能的方式，包括例如通过转变通气强度来转变(例如降低)氧浓度。
任选地，在培养过程中使温度转变(例如降低)至少2℃。任选地，使温度转变3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。任选地，使温度从约25℃改变至约20℃。
可以通过任何可用的一种或多种方法来评价感兴趣的化合物的细胞生产率。
产品
所产生的PUFA和其他化合物可以用于任何各种应用中，例如利用其生物性质或营养性质。例如，化合物可以被用于生物燃料、药物、食物补充剂、动物饲料添加剂、化妆品等中。根据本公开产生的化合物也可以作为中间体用于产生其他化合物。
应了解到，在宿主细胞的背景下，将由如本文所描述的操纵的细胞产生的PUFA和/或其他化合物合并到最终产品(例如食物或饲料补充剂、婴儿配方食品、药物等)中。例如，宿主细胞可以被冻干、冷冻干燥、冷冻、巴氏灭菌或以另外的方式灭活，并且然后全细胞可以被合并到最终产品中或用作最终产品。任选地，宿主细胞(无论是否干燥的)可以在合并于产品中之前被进一步加工(例如经由溶解、超声处理、珠粒研磨、压力处理、冻融、用于分离组分的脉冲场电泳(PFE)和/或酶处理或其组合，任选地，使用至少两种或更多种所述处理)。可以使用适当的溶剂将溶解的细胞萃取到油中并且使用熟知的方法进行精炼。任选地，最终产品仅合并从整个宿主细胞中分离出来的一部分宿主细胞(例如根据尺寸、溶解度分级分离)。例如，脂质可以从宿主细胞中分离出来并且合并到最终产品中或用作最终产品。含有PUFA的脂质可以使用超临界流体萃取或使用一种或多种溶剂(例如丙酮、氯仿、异丙醇、己烷、二氯甲烷或甲醇)的萃取来萃取。任选地，通过任何各种方法如尿素络合法、柱色谱法和/或超临界流体分级分离来浓缩脂质。用于浓缩溶剂萃取的脂质的技术包括水解(例如使用碱、酸或酶促水解)、进一步萃取、酸化、结晶、过滤以及其组合(参见例如美国专利公布2009/0117194，所述专利公布以引用的方式整体并入本文)。
任选地，一种或多种产生的PUFA和/或其他化合物被合并到食物或饲料的组分(例如食物补充剂)中。可以根据本公开将化合物合并到其中的食物产品的类型不受特别限制，并且包括饮料，如牛奶、水、运动饮料、能量饮料、茶和果汁；甜食，如果冻和饼干；含脂肪的食物和饮料，如乳制品；加工食品，如软米(或粥)；婴儿配方食品；早餐谷类食品等。任选地，一种或多种产生的化合物被合并到例如像复合维生素的膳食补充剂中。任选地，根据所提供的方法产生的PUFA化合物被包括在膳食补充剂中并且可以直接地被合并到食物或饲料的组分(例如食物补充剂)中。
可以将根据所提供的方法产生的化合物合并到其中的饲料的实例包括，例如宠物食物，如猫食物、狗食物等；用于水族箱鱼、养殖鱼或甲壳类动物等的饲料；用于农场饲养动物(包括牲畜和水产养殖的鱼类或甲壳类动物)的饲料。将根据所提供的方法产生的一种或多种化合物合并到其中的食物或饲料物质优选地对于作为预期接受体的生物体是可口的。这种食物或饲料物质可以具有当前对于食物物质所知的任何物理性质(例如固体、液体、柔软的)。
任选地，一种或多种产生的化合物(例如PUFA)被合并到药物中。所述药物的实例包括例如各种类型的片剂、胶囊、可饮用剂等。任选地，药物适用于局部应用。剂型不受特别限制，并且包括胶囊、油剂、粒剂、浓缩细粒剂(granulasubtilae)、散剂、片剂、丸剂、锭剂等。油剂和充油的胶囊可以提供另外的优势，因为其在制造过程中没有成分分解，并且因为含PUFA的脂质滴液可以容易地被合并到基于油的制剂中。
根据本公开的药物可以根据本领域中确立的技术，包括例如在美国药典(UnitedStatesPharmacopoeia)中所描述的普通程序来制备。
根据本公开产生的化合物(无论分离的或在细胞的背景下)可以通过与任何各种试剂的组合而合并到如本文所描述的产品中。例如，所述化合物可以与一种或多种粘合剂或填充剂组合。任选地，产品将包括一种或多种螯合剂、颜料、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、芳香剂、防腐剂等以及其组合。
抗体
还提供了结合本文所公开的分离的破囊壶菌多肽的抗体和抗体多肽。特异性地结合分离的破囊壶菌多肽的抗体多肽可以通过本领域技术人员熟知的方法来产生。例如，分离的多肽或其片段可以用作抗原以在各种宿主(如山羊、兔、大鼠、小鼠等)中诱导抗体产生。可以通过用具有免疫原性性质的任何部分或片段注射来免疫宿主。取决于宿主种类，各种佐剂可以被用来增加免疫应答。所述佐剂包括但不限于弗氏佐剂(Freund’s)、矿物胶如氢氧化铝、和表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基酚。
为了产生多克隆抗体，分离的多肽可以被缀合至常规载体以便增加其免疫原性和对所产生的分离的多肽-载体缀合物的抗血清。肽与载体蛋白偶联和免疫可以如Dymecki等,1992,J.Biol.Chem.,267:4815中所描述的那样进行。可以通过本领域技术人员已知的方法(例如ELISA或者通过点印迹或斑点印迹(Boersma&VanLeeuwen,1994,J.Neurosci.Methods,51:317))来滴定针对分离的多肽抗原的血清。通过ELISA，例如按照Green等,1982,Cell,28:477的程序，一种有用的血清将与分离的多肽强烈地反应。
用于制备单克隆抗体的技术是熟知的，并且例如由Arnheiter等,1981,Nature,294:278描述。单克隆抗体通常获自杂交瘤组织培养物或来自腹水，所述腹水获自将杂交瘤组织引入到其中的动物。可以根据本领域已知的方法，针对结合分离的肽的抗体筛选产生单克隆抗体的杂交瘤(或多克隆血清)。
通过参考以下实施例将更完全地理解本公开。然而，所述实施例并不应当被解释为对本公开的范围进行限制。所有文献引用以引用的方式并入。
实施例
实施例1：分离和鉴定基因、启动子和终止子序列
本实施例描述了从ONC-T18中鉴定和分离某些示例性基因表达启动子和终止子核酸序列。
申请人已经使用鸟枪法测序和焦磷酸测序(GS-20；454)技术基本上对ONC-T18的基因组进行了测序。尤其，本公开提供了例如使用公众可获得的EST(表达序列标签)收集信息(Huang等,2008)、功能注释和/或生物信息学软件(例如可从AppliedMaths获得的Kodon软件包和/或一种或多种算法如BLAST)来分析所述序列信息。为了提供用于表达同源基因和异源基因(例如涉及破囊壶菌微生物内的脂质和脂肪酸生物合成的基因)的工具，使用聚合酶链反应(PCR)技术从破囊壶菌属种ONC-T18的基因组DNA克隆看家微管蛋白基因启动子和终止子以及去饱和酶和延长酶基因和启动子。
ONC-T18菌株在补充的海水培养基中生长。使用改性的FastPrep(MPBiomedicals)方案提取DNA并且送到应用基因组中心(TCAG，儿童医院，Toronto)用于单板454测序和单泳道Illumina2.5kb配偶对测序(mate-pairsequencing)(76个碱基读段(reads))。通过RNeasy方法(Qiagen)，从在细胞培养物快速生长时期的过程中和在高脂质产生的过程中采样的细胞中提取RNA。将总RNA运送至TCAG用于针对每个条件进行单Illumina泳道(76个碱基读段)的RNA-Seq分析。
在IMB研究信息学服务器上使用开放源码软件进行生物信息学分析。使用Mira(Chevreux等,1999)完成基因组组装并且使用Bambus(Pop等,2004)产生可能的支架。使用来自Snap(Korf,2004)和Augustus(Stanke和Waack,2003)的基因模型，通过MAKER(Cantarel等,2008)进行基因组注释。通过Infernal(Eddy,2006)分析Rfam数据库(Griffiths-Jones等,2003)来鉴定RNA编码基因。PASA和Inchworm(Haas等,2003)被用来鉴定5’和3’的未翻译区。使用AutoFact(Koski等,2005)分析蛋白质编码基因，所述AutoFact采用了Blast和rpsblast(Altschul等,1990)来询问非冗余、uniref90、Kegg(Ogata等,1999)、COG(Tatusovet等,2003)和pfam(Finn等,2008)数据库。RNA-Seq数据的分析使用了Tophat(Trapnell等,2009)和Cufflinks(Trapnell等,2010)来将读段映射(map)至草图(draft)基因组、评价转录物丰度并且确定差异表达。用户Perl脚本被用来重新格式化、组装和分析数据。
从先前已经由质粒和粘粒文库产生的单板454读段(1,131,145读段，总共302Mb)、单泳道Illumina配偶对序列(21,570,704读段，总共1.47Gb)和Sanger序列(34,261读段，总共30Mb)组装ONC-T18草图基因组。Mira是唯一能够处理此读取类型种类的汇编程序。组装的信息呈现在表1中。
表1.ONC-T18基因组组装信息
重叠群数 2471
总共有序列 34,463,560个碱基对
平均覆盖度 40.63x(8x 454，32x Illumina，0.63x Sanger)
平均重叠群大小 13,974.62个碱基对
中值重叠群大小 7555个碱基对
最大重叠群 164,938个碱基对
最小重叠群 490个碱基对
虽然在组装中重叠群数是相当高的，但这对于草图基因组来说是通常的。代表了在其以上的一半基因组的重叠群长度的N50重叠群大小是29,352个碱基对。这个基因组可有利地与许多通常具有N50<10,000个碱基对的草图基因组比较。N95为4931，从而表明了95％的基因组在大于约5kb的重叠群内。
在注释时期的过程中，12个重叠群被注释为含有线粒体基因。从组装中移除这些重叠群，并且分别对其重新组装。这产生了具有最大的重叠群为30965个碱基对的5个重叠群，而其他四个重叠群都小于1800个碱基对，并且似乎是大重叠群中的变体区。大重叠群在各末端上具有不容易被连接到环状基因组中的复杂重复区。这种情况先前对破囊壶菌线粒体基因组(GenBank登记AF288091)已经注释过。
在ONC-T18序列中查找基因完全不是那么简单的。虽然大多数基因在单个外显子中编码，但是存在大量的多外显子基因，从而需要使用基因建模软件来分选出单个外显子基因与多外显子基因，并且对于后者鉴定合适的内含子/外显子边界。MAKER通过数种方法协调基因组的分析：来自基因建模软件(Snap和Augustus)的输入、对RNA读段的比对和对蛋白质的比对。所预测的基因进一步通过PASA分析，所述PASA使用组装的转录物(来自Inchworm)来鉴定5’和3’未翻译区，许多未翻译区包括内含子。通过Rfam数据库的Infernal搜索来鉴定RNA编码基因(rRNA、tRNA和其他非编码RNA如核内小DNA(snoRNA/snRNA))。注释数据呈现在表2中。
表2.ONC-T18b注释数据
蛋白质编码基因 13,022
单个外显子 10,272
两个外显子 2,136
三个外显子 425
多于三个的外显子 161
无基因库命中 3258
假设/保守的蛋白质 841
rRNA基因 79
tRNA基因 131
其他RNA基因 8
通过AutoFACT运行所预测的蛋白质来分析蛋白质编码基因。这个软件协调对uniref90、非冗余、Kegg、COG和pfam数据库进行blast搜索并且输出预期的蛋白质函数的共有序列。而且，鉴定了COG函数和KEGG途径，并且如果可能的话，鉴定EC数。在可能的情况下还鉴定了基因本体论分类。这些数据对于鉴定存在于ONC-T18b中的生物化学途径是必需的。
在基因组中鉴定了从18:1脂肪酸比DHA的经典延长/去饱和途径中的所有酶的基因。还鉴定了从丙二酰基-辅酶A直接合成DPA和DHA的PUFA聚酮合酶的三个亚基的基因，尽管它们中的两个由于蛋白质重复的本性而被分到重叠群中。而且，鉴定了通常被描述为“延长非常长链的脂肪酸蛋白质”的难以定义的酶的数个基因，从而表明这些基因是在C18–C22途径中分散的酶变体，或涉及具有大于C22链长度的脂肪酸的合成。
1.分离和鉴定微管蛋白基因启动子#701。
使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于破囊壶菌属种ONC-T18基因组序列数据来设计寡核苷酸引物#52(SEQIDNO:1)和#53(SEQIDNO:2)。寡核苷酸引物由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。
在振荡孵育箱中，在以150rpm进行恒定搅动下，在25℃下从在生长培养基(ONC-T18-GM0)中培养的细胞中提取ONC-T18的基因组DNA，持续36小时。通过在SorvallSuperT21离心机中，用具有适配器Sorvall#00436的转子ST-H750以4300rpm在室温下离心5min来收获50mL培养物的细胞。使用Ultraclean微生物DNA分离试剂盒(MOBIOLaboratories,Inc,SolanaBeach,California)，按照制造商的方案从细胞中分离基因组DNA。
生长培养基ONC-T18-GM0的组分是：5g/L酵母提取物(RM668，HiMedialabs)、5g/L大豆蛋白胨(RM007，HiMedialabs)、10g/LD(+)-葡萄糖(CERELOSETM右旋糖020010，CornProductsInternational)、35g/L人工海盐(INSTANTOCEANTM，Aquaria，Inc.)、1.25mg/L微量元素(5g/LNaH2PO4.H2O、3.15g/LFeCl3·6H2O、4.36g/LNa2EDTA·2H2O、0.6125mg/LCuSO4·5H2O、0.0597g/LNa2MoO4·2H2O、0.022g/LZnSO4·7H2O、0.01g/LCoCl2·6H2O、0.18g/LMnCl2·4H2O、13μg/LH2SeO3、2.7mg/LNiSO4·6H2O、1.84mg/LNa3VO4以及1.94mg/LK2CrO4)以及1.25mg/L维生素(1mg/L维生素B12、1mg/L生物素、0.20g/L盐酸硫胺素)。
使用以下PCR条件从ONC-T18的基因组DNA扩增包括部分开放阅读框序列的微管蛋白基因启动子#701：94℃，持续1分钟；94℃，持续30秒；和68℃，持续6分钟并且重复30个循环以及72℃，持续10分钟。在50μL反应混合物中进行PCR，所述反应混合物含有2.5个单位TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶(TAKARABIOINC.,Shiga,Japan)、1XLAPCR缓冲液II、dNTP混合物(各为0.40mM)、225ng模板基因组DNA、0.20μM引物#52以及0.20μM引物#53。
在用于电泳的0.8％琼脂糖凝胶中在65伏下拆分PCR产物，持续60分钟。用刀片剪出具有预期大小的条带，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案提取并且纯化DNA。
使用Perfectly克隆试剂盒(Novagen,SanDiego,California)，按照制造商的方案将经过纯化的DNA片段克隆到pT7Blue-3载体中。使用直接菌落PCR方法筛选阳性克隆。简单来说，使用牙签挑选转化的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌落，并且分别在200μLPCR管中在含有以下组分的20μLPCR反应混合物中涡旋：TaqDNA聚合酶(Sigma)、1XPCR缓冲液、2.5mMMgCl2、dNTP混合物(各为0.20mM)、0.25μM引物#62(SEQIDNO:3)以及0.25μM引物#63(SEQIDNO:4)。同时，还将菌落在参考板上划线培养用于分离质粒DNA。
在以下条件下进行PCR：94℃，持续3分钟，历经一个循环；94℃，持续1分钟，53℃，持续2分钟以及72℃，持续4分钟，并且重复30个循环；以及72℃，持续10分钟。在0.8％琼脂糖凝胶中区分PCR产物。扩增得到具有预期大小的PCR产物的菌落被认为是阳性菌落。
使用ZYPPYTM质粒微量制备试剂盒(ZymoResearchCorp.,Orange,California)从3mL培养物的细菌大肠杆菌细胞中分离阳性克隆JZ2-17-10的质粒DNA。使用正向引物#62(SEQIDNO:3)和反向引物#63(SEQIDNO:4)对它的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。来自克隆JZ2-17-10的插入物的核苷酸序列的长度是724个碱基对(SEQIDNO:5)。基于使用各种生物信息学软件进行的分析，将部分推定微管蛋白基因开放阅读框(ORF)的推定翻译起始密码ATG上游的498个核苷酸确定为推定的基因表达启动子(序列#701；SEQIDNO:6)。在这个序列内鉴定通常的基因启动子元件。使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,1990)，在包括专利序列的数据库的各种GenBank数据库中对与这个推定的启动子序列#701(SEQIDNO:6)同源的序列进行搜索。没有发现与这个独特的启动子序列#701同源的序列。在BLAST搜索中，ORF的5'端部分序列与莱茵衣藻β微管蛋白2(TUB2)基因(GenBank登记号：XM_001693945)具有最大同源性。
所鉴定的启动子序列的长度是498个核苷酸，并且含有处于位置444上的-10普里布诺盒(Pribnow-Schallerbox)(AGGAAGACT)和处于位置424上的-35盒(CTGACG)、处于位置459上的推定转录起始位点以及处于位置468上的推定转录因子结合位点AAGGTAGA。
2.分离和鉴定微管蛋白基因启动子#341。
使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于破囊壶菌属种ONC-T18基因组序列数据来设计寡核苷酸引物#54(SEQIDNO:7)和#55(SEQIDNO:8)。寡核苷酸引物由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。
通过PCR，使用与对于分离微管蛋白基因启动子#701所述的条件相同的条件，从ONC-T18的基因组DNA扩增包括下游部分开放阅读序列的微管蛋白基因启动子#341。使用Perfectly克隆试剂盒(Novagen,SanDiego,California)，按照制造商的方案将所扩增的经过纯化的DNA片段克隆到pT7Blue-3载体中。使用ZYPPYTM质粒微量制备试剂盒(ZymoResearchCorp.,Orange,California)从3mL培养物的大肠杆菌细胞中分离阳性克隆JZ2-17-14的质粒DNA。
使用正向引物#62(SEQIDNO:3)和反向引物#63(SEQIDNO:4)对重组质粒DNA的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ2-17-14的插入物核苷酸序列的长度是1115个碱基对(SEQIDNO:9)。已经鉴定出位于插入物的3'端序列处的微管蛋白基因的部分ORF。ORF的推定翻译起始密码ATG的上游序列被认为是推定的启动子#341(SEQIDNO:10)。
使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,1990)，在包括专利序列的数据库的各种基因库数据库中对与微管蛋白基因启动子#341(SEQIDNO:10)同源的序列进行搜索。没有发现与这个独特的微管蛋白基因启动子#341序列同源的序列。在BLAST搜索中，推定的部分ORF的5'端序列与莱茵衣藻α微管蛋白2(TUA2)基因(GenBank登记号：5728641)具有最大同源性。
这个长度为1004个核苷酸的启动子序列含有处于位置542上的-10盒(CGCTAAAAT)和处于位置518上的-35盒(TTCACG)、处于位置557上的推定转录起始位点以及处于位置543上的推定转录因子结合位点GCTAAAAT，以及处于位置143上的-10盒(TAGTAGATT)和处于位置125上的-35盒(TTGCTC)、处于位置158上的推定转录起始位点以及处于位置149上的推定转录因子结合位点ATTTTGTA和处于位置150上的TTTTGTAA。
3.分离和鉴定微管蛋白基因终止子#347。
使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于ONC-T18的基因组序列数据来设计寡核苷酸引物#58(SEQIDNO:11)和#59(SEQIDNO:12)。寡核苷酸引物由Invitrogen(California,USA)合成并且购自公司Invitrogen(California,USA)。
通过PCR，使用与对于分离微管蛋白基因启动子#341所述的条件相同的条件，从ONC-T18的基因组DNA扩增微管蛋白基因终止子#347。使用Perfectly克隆试剂盒(Novagen,SanDiego,California)，按照制造商的方案将经过纯化的DNA片段克隆到pT7Blue-3载体中。使用ZYPPYTM质粒微量制备试剂盒(ZymoResearchCorp.,Orange,California)从3mL培养物的细菌大肠杆菌细胞中分离阳性克隆JZ2-17-22的质粒DNA。
使用正向引物#62(SEQIDNO:3)和反向引物#63(SEQIDNO:4)对重组质粒DNA的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ2-17-22的核苷酸序列的插入物的长度是727个碱基对(SEQIDNO:13)。插入物的5'端序列已经被鉴定为含有推定基因翻译终止密码子TAA的推定的部分ORF。终止密码子TAA的下游序列被认为是推定的微管蛋白基因终止子#347(SEQIDNO:14)。
使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,1990)，在包括专利序列的数据库的各种基因库数据库中对与微管蛋白基因终止子#347序列(SEQIDNO:14)同源的序列进行搜索。没有发现与这个独特的微管蛋白基因终止子#347序列的同源序列。在BLAST搜索中，推定的ORF的部分序列与水蕨(Ceratopterisrichardii)α微管蛋白基因(GenBank登记号：XM_001691824)具有最大同源性。
长度为590个核苷酸的终止子序列含有推定的多聚腺苷酸化信号序列AAAACAAAAA，所述推定的多聚腺苷酸化信号序列的功能在于终止通过RNA聚合酶进行的转录。
4.分离和鉴定微管蛋白基因终止子#713。
使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于ONC-T18的基因组序列数据来设计寡核苷酸引物#60(SEQIDNO:15)和#61(SEQIDNO:16)。寡核苷酸引物由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。
通过PCR，使用与对于分离微管蛋白基因启动子#341所述的条件相同的条件，从ONC-T18的基因组DNA扩增微管蛋白基因终止子#713。使用Perfectly克隆试剂盒(Novagen,SanDiego,California)，按照制造商的方案将经过纯化的DNA片段克隆到pT7Blue-3载体中。使用ZYPPYTM质粒微量制备试剂盒(ZymoResearchCorp.,Orange,California)从3mL培养物的细菌大肠杆菌细胞中分离阳性克隆JZ2-22-9的质粒DNA。
使用正向引物#62(SEQIDNO:3)和反向引物#63(SEQIDNO:4)对重组质粒DNA的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ2-22-9的核苷酸序列的插入物的长度是869个碱基对(SEQIDNO:17)。插入物的5'端序列已经被鉴定为含有推定基因翻译终止密码子TAA的推定的部分ORF。终止密码子TAA的下游序列被认为是推定的微管蛋白基因终止子#347(SEQIDNO:18)。
使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,1990)，在包括专利序列的数据库的各种基因库数据库中对与微管蛋白基因终止子#713序列(SEQIDNO:18)同源的序列进行搜索。没有发现与这个独特的微管蛋白基因终止子#713序列同源的序列。在BLAST搜索中，推定的ORF的部分序列与蓝载藻(Cyanophoraparadoxa)β1微管蛋白(tubB1)基因(GenBank登记号：AF092952)具有最大同源性。
长度为640个核苷酸的终止子序列(SEQIDNO:14)含有推定的多聚腺苷酸化信号序列CATAAA，所述多聚腺苷酸化信号序列的功能在于终止通过信使RNA聚合酶进行的转录。
5.分离和鉴定Δ5延长酶基因(PCT/IB2007/004553；WO/2009/010825)启动子序列(SEQIDNO:19)。基于使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)得到的ONC-T18的基因组序列数据，设计了为了便于进行下游分子克隆而在其5'端上添加限制性内切酶位点XbaI的寡核苷酸引物#3(SEQIDNO:20)以及在其5'端上添加限制性内切酶位点NcoI的引物#4(SEQIDNO:21)。寡核苷酸引物由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。使用PCR，从ONC-T18的基因组DNA扩增Δ5延长酶基因启动子，使其沉淀，使用限制性内切酶XhoI和NcoI消化，进行琼脂糖-凝胶纯化并且将其克隆到载体pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的对应限制性位点中。使用引物#14(SEQIDNO:22)和引物#15(SEQIDNO:23)对阳性克隆JZ1-57-7的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ1-57-7的核苷酸序列的插入物的长度是950个碱基对(SEQIDNO:19)，并且已经被鉴定为ONC-T18的Δ5延长酶基因启动子(SEQIDNO:19)。
这个长度为950个核苷酸的启动子序列(SEQIDNO:19)含有处于位置113上的-10盒(TGCCAGACT)、处于位置91上的-35盒(TTTTCT)、处于位置128上的推定转录起始位点以及处于位置87、92、93以及131上的推定转录因子结合位点CTCCTTTT、TTTCTTTT、TTCTTTTT以及TTGCTCCT，以及处于位置444上的-10盒(AGTTCTGAT)、处于位置419上的-35盒(TTTCCG)以及处于位置459上的推定转录起始位点。
使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,1990)，在包括专利序列的数据库的各种Genbank数据库中对与Δ5延长酶基因启动子序列(SEQIDNO:19)同源的序列进行搜索。没有发现与Δ5延长酶基因启动子序列(SEQIDNO:19)同源的序列。
6.分离和鉴定Δ4去饱和酶基因(PCT/IB2007/004553；WO/2009/010825)启动子序列(SEQIDNO:24)。采用为了便于进行下游分子克隆而在其5'端上添加限制性内切酶位点XhoI的寡核苷酸引物#1(SEQIDNO:25)以及在其5'端上添加限制性内切酶位点NcoI的引物#2(SEQIDNO:26)来分离Δ4去饱和酶基因启动子序列(SEQIDNO:24)。使用PCR来扩增Δ4去饱和酶基因启动子的DNA片段，使其沉淀，使用限制性内切酶XhoI和NcoI消化，进行琼脂糖-凝胶纯化并且将其克隆到使用相同限制性内切酶消化并且经过凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的对应限制性位点中。使用引物#14(SEQIDNO:22)和引物#15(SEQIDNO:23)对阳性克隆JZ1-57-1的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆JZ1-57-1的核苷酸序列的插入物的长度是1216个碱基对(SEQIDNO:24)，并且已经被鉴定为ONC-T18的Δ4去饱和酶基因启动子(SEQIDNO:24)。
这个长度为1216个核苷酸的启动子序列(SEQIDNO:24)含有处于位置58上的-10盒(GCGTATTAT)、处于位置34上的-35盒(CTACAG)、处于位置73上的推定转录起始位点以及处于位置63和69上的推定转录因子结合位点TTATATTT和TTTTCGCA，以及处于位置1038上的-10盒(CGTCATCCT)、处于位置1014上的-35盒(TGGACG)以及处于位置1053上的推定转录起始位点。
使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,1990)，在包括专利序列的数据库的各种Genbank数据库中对与Δ4去饱和酶基因启动子序列(SEQIDNO:24)同源的序列进行搜索。没有发现与Δ4去饱和酶基因启动子(SEQIDNO:15)同源的序列。
7.鉴定和分离Δ12去饱和酶基因(SEQIDNO:70)。对来自快速生长的细胞和产生高脂质量的细胞的RNA进行的RNA-Seq分析为ONC-T18的生物学提供了许多认识。将来自这两种条件的RNA读段映射成11,407个基因(87.6％)。没有明显的表达的1613个基因不是真正的基因，仅在非常低的水平下表达或仅在非常特殊的条件(例如，孢子形成)下表达。两种生长条件之间的比较鉴定了1519个基因仅在快速生长条件下表达，而442个基因仅在高脂质产生条件下表达(表3)。分析允许鉴定在任一条件中被高度表达的基因，以及显示出最大变化的那些基因。表达数据清晰地鉴定了许多具有调节的启动子和/或强启动子的基因。这些启动子区可以被用来驱动引入到ONC-T18中的基因的表达。
表3.在高脂质产生条件下最高度表达的基因、指数生长(A表达)和脂肪酸生物合成(B表达)的比较。
描述 A表达 B表达 比率B/A
Δ12脂肪酸去饱和酶 1540.39 66133.1 42.9327
60S核糖体蛋白L40 20680.2 33016.5 1.596527
果糖-二磷酸醛缩酶 8584.79 26817.6 3.12385
非命中 23667.6 20419.4 0.862758
非命中 4648.85 18867 4.058423
精子鞭毛能量载体蛋白 15761 17993.1 1.141622
延长因子1-α 31931.4 16981.2 0.531803
甘油醛-3-磷酸脱氢酶，I型 4794.26 15752.3 3.285658
ATP酶4，质膜型 5823.11 13852.5 2.378883
非命中 10563.6 12461.5 1.179664
丙酮酸激酶 2248.7 12195.4 5.423311
ATP合酶亚基α 12958.5 11405.6 0.880164
特别显著的是，Δ12去饱和酶表达增加大于40倍，所述Δ12去饱和酶在合成多不饱和脂肪酸(去饱和为18:1至18:2)的途径的早期中是关键的酶。标准的生物信息学分析确认最高上调的基因为推定的Δ12去饱和酶。简单来说，BLASTn分析显示与微单胞菌属(Micromonassp.)PCC299的染色体5的区低水平同源作为最高命中。BLASTn结果也表明靶序列的一部分与苜蓿黄萎病菌(Verticilliumalbo-atrum)VaMS.102的Δ12去饱和酶96.9％类似。BLASTx将靶序列鉴定为其中相当大的一个部分(46％)与三角褐指藻的Δ12去饱和酶92％类似的蛋白质。用来鉴定保守结构域的BLASTp分析鉴定出两个保守的Δ12脂肪酸去饱和酶基序。SIB：用来分析蛋白质序列以确定是否存在基序的myhits基序扫描(在http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan上可获得)显示在所述序列内的两个脂肪酸去饱和酶基序，从而进一步表明作为脂肪酸去饱和酶的功能。使用EMBL-EBIInterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)进行的确认分析也显示存在脂肪酸去饱和酶蛋白质的基序特征。
尤其，本实施例证实了在脂肪酸产生过程中破囊壶菌属ONC-T18的Δ12去饱和酶的表达被上调了超过40倍。这种出乎意料和显著的表达增加鉴定了Δ12去饱和酶为破囊壶菌或破囊壶菌属中(尤其在ONC-T18中)的PUFA生物合成的主调节子。通过过表达、下调或抑制对这个主调节子进行的操纵水平可以定制如图1中所示的沿着特定途径的PUFA生物合成。近端调节元件和远端调节元件(例如，Δ12去饱和酶的一种或多种启动子、5’UTR、内含子、终止子和3’UTR)可以可操作地连接至一个或多个另外的PUFA生物合成基因，以便在脂肪酸产生过程中将那些基因的表达水平增加至类似数量级。本质上，Δ12去饱和酶的调节元件是在一个或多个预先确定的方向上驱动PUFA生物合成途径的开关。
为了分离这种基因(以上所描述的最高上调的基因)，在含有以下物质的50μl体积中进行PCR扩增：200ng破囊壶菌属ONC-T18基因组DNA；10μl甜菜碱；10mMTris-HCl，pH8.3；50mMKCl；1.5mMMgCl2；0.001％明胶；每一种脱氧核糖核苷三磷酸200μM；每一种引物1μM以及0.2个单元的高保真聚合酶。在55.7℃的退火温度下进行热循环，在0.8％低熔化的琼脂凝胶上拆分PCR反应物(reaction)，并且对约600个碱基对的条带进行凝胶纯化。用水将PCR产物从琼脂糖上洗脱下来，并且然后用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,Calif.)纯化。按照制造商的说明书将这些DNA片段克隆到pT7Blue-3PerfectlyBlunt克隆试剂盒(Novagen,SanDiego,Calif.)中。将重组质粒转化到NovaBlue感受态细胞(Novagen,SanDiego,Calif.)中，并且对克隆进行测序。因此分离一个克隆并且对其进行测序。
Δ12去饱和酶全长基因插入物长度为1239个碱基对(SEQIDNO:70)，并且从第一ATG开始含有1238个碱基对的编码412个氨基酸的开放阅读框。
表4：来自ONC-T18的Δ12去饱和酶(SEQIDNO:70)
8.分离和扩增Δ5去饱和酶基因(SEQIDNO:72)。以与Δ12去饱和酶类似的方式分离和鉴定来自破囊壶菌属种ONC-T18的Δ5去饱和酶的序列。完整序列为：
表5：来自ONC-T18的Δ5去饱和酶(SEQIDNO:72)
所预测的氨基酸序列为：
表6：来自ONC-T18的Δ5去饱和酶的所预测的氨基酸序列(SEQIDNO:73)
9.分离和鉴定Δ12去饱和酶基因启动子序列(SEQIDNO:69)。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)，基于ONC-T18的基因组序列数据来设计寡核苷酸引物以侧接Δ12去饱和酶基因的上游调节区。为了便于进行下游分子克隆，设计引物以包括限制性内切酶位点。寡核苷酸引物由Invitrogen(California,USA)合成并且购自Invitrogen(California,USA)。使用PCR从ONC-T18的基因组DNA扩增Δ12去饱和酶基因启动子，使其沉淀，使用适当的限制性内切酶消化，进行琼脂糖-凝胶纯化并且将其克隆到载体pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的对应限制性位点中。在转化到适合的细菌宿主细胞中并选择之后，选择数种转化的细菌，在3.5ml塔中培养并且使用Zyppy质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA。用适当的限制性内切酶消化纯化的质粒DNA以确认存在所希望的DNA片段。使用与5’(正向)端和3’(反向)端间隔约500个碱基对的25个碱基对序列的适当引物对阳性克隆的插入物进行测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆的核苷酸序列的插入物的长度是3247个碱基对(SEQIDNO:69)，并且已经被鉴定为ONC-T18的Δ12去饱和酶基因启动子(SEQIDNO:69)。
表7：ONC-T18Δ12去饱和酶的近端启动子(SEQIDNO:69)
Δ12去饱和酶序列的分析显示在3247个碱基对的区内存在长度大于100个碱基对的24个推定开放阅读框(ORF)。对这些推定开放阅读框进行BLASTP分析鉴定了与控制机理和本申请具有潜在相关性的数个开放阅读框。实例包括与依赖NADPH的肉桂醇脱氢酶具有同源性(E＝2e-55)、具有保守的NADB罗斯曼和表异构酶结构域、双功能蛋白酶/dUTP酶样蛋白质(E＝2.2)、含黄素的单加氧酶(E＝0.48)、推定硫胺素生物合成脂蛋白前体(E＝0.17)、核苷酸转移酶(E＝0.99)以及推定周质麦芽糖结合蛋白(0.5)的那些开放阅读框。本领域已知上游ORF(uORF)可以对蛋白质表达施加调节功能(Child,Miller等,1999)，因为可以交替的剪接和核糖开关机制(Epshtein,Mironov等,2003；Croft,Moulin等,2007)。使用Fruitfly(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行的在线启动子/转录起始位点生物信息学分析鉴定了以下推定的启动子/转录起始位点：
启动子预测正向链
启动子预测反向链
使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,1990)在包括专利序列的数据库的各种Genbank数据库中对与Δ12去饱和酶基因启动子序列(SEQIDNO:69)同源的序列进行搜索。没有发现与Δ12去饱和酶基因启动子序列(SEQIDNO:69)显著同源的序列。
10.分离和鉴定Δ5去饱和酶基因启动子序列(SEQIDNO:71)。设计寡核苷酸引物以侧接Δ5去饱和酶基因的上游调节区。为了便于进行下游分子克隆，设计引物以包括限制性内切酶位点。使用PCR来扩增Δ5去饱和酶基因启动子的DNA片段，使其沉淀，使用限制性内切酶XhoI和NcoI消化，进行琼脂糖-凝胶纯化并且将其克隆到使用相同限制性内切酶消化并且经过凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的对应限制性位点中。使用适当的引物对阳性克隆的插入物测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST对所得序列进行组装和分析。克隆的核苷酸序列的插入物的长度是1066个碱基对(SEQIDNO:71)，并且已经被鉴定为ONC-T18的Δ5去饱和酶基因启动子(SEQIDNO:71)。
表8：ONC-T18Δ5去饱和酶的近端启动子(SEQIDNO:71)
在线ORF预测工具、ORF查找器(ORFfinder)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在1066个碱基对启动子内鉴定了大于100个碱基的12个推定ORF。在这些ORF中，在NCBI(如通过BLASTP分析所鉴定)中发现了数个与非冗余数据库同源的ORF；然而，同源性很低，所以不能被认为与此工作相关。无论如何，如先前所讨论，uORF和核糖开关可以先前未确定的方式影响启动子的功能。使用Fruitfly(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行的在线启动子/转录起始位点生物信息学分析鉴定了以下推定的启动子/转录起始位点。
使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等,1990)在包括专利序列的数据库的各种Genbank数据库中对与Δ5去饱和酶基因启动子序列(SEQIDNO:71)同源的序列进行搜索。没有发现与Δ5去饱和酶基因启动子(SEQIDNO:71)同源的序列。
实施例2：鉴定可以用于遗传操纵破囊壶菌属种ONC-T18的抗 生素
本实施例描述了鉴定抗生素的实验，针对所述抗生素的抗性可以被用作选择标记以遗传操纵ONC-T18。
使破囊壶菌属种ONC-T18在琼脂板上生长(每升ONC-T18-GM020g琼脂)。将一菌环量的ONC-T18接种物接种到50mL液体ONC-T18-GM0中，并且将培养物在振荡孵育箱中在25℃下在250rpm下孵育36小时。将0.5毫升的培养物转移到1.5mL管中并且以全速涡旋30秒以便拆散细胞团，然后在50mL无菌水中稀释。将一百微升所得溶液展布在每个ONC-T18-GM0培养基板上。每个板含有各种浓度中的一种浓度的各种抗生素中的一种。在25℃下孵育板并且每天观察菌落的出现和生长。如可以在表9中看到，ONC-T18的生长对所测试的大多数抗生素不敏感。然而，博来霉素显著地抑制ONC-T18在ONC-T18-GM0琼脂板中的生长。
因此，本实施例将博来霉素鉴定为可以用于在遗传操纵实验中进行选择的抗生素。
表9：抗生素对破囊壶菌属种ONC-T18生长的影响
实施例3：诱变剂
本实施例尤其描述了有效诱变剂的发现。这种试剂特别可用于在破囊壶菌中进行诱变。
博来霉素使细胞中的染色体DNA断裂。假设抗生素博来霉素将是一种用于菌株改良的有用的破囊壶菌菌株诱变剂。在某些浓度下，博来霉素可以杀死大多数经过处理的细胞，但一些细胞仍然存活。在高浓度下处理细胞会增加突变频率，这可以有助于对突变的菌株进行选择和分离。
选择ONC-T18的海洋原生生物野生型菌株作为模型系统来测试博来霉素是否将在这种菌株中有效诱导诱变。将在含有ONC-T18-GM0培养基[5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、10g/LD(+)-葡萄糖、35g/L人工海盐、1.25mg/L微量元素(5g/LNaH2PO4.H2O、3.15g/LFeCl3·6H2O、4.36g/LNa2EDTA·2H2O、0.6125mg/LCuSO4·5H2O、0.0597g/LNa2MoO4·2H2O、0.022g/LZnSO4·7H2O、0.01g/LCoCl2·6H2O、0.18g/LMnCl2·4H2O、13μg/LH2SeO3、2.7mg/LNiSO4·6H2O、1.84mg/LNa3VO4以及1.94mg/LK2CrO4)、1.25mg/L维生素(1mg/L维生素B12、1mg/L生物素、0.20g/L盐酸硫胺素)以及每升20g琼脂]的琼脂板中生长的一完全菌环量的ONC-T18接种物接种到50mL液体ONC-T18-GM0培养基中，并且在振荡孵育箱中在25℃下在250rpm下孵育36小时。将0.5毫升的培养物转移到1.5mL管中并且以全速涡旋30秒，然后在50mL无菌水中稀释。将100微升经过稀释的接种物分别展布在含有各种浓度(0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL)的博来霉素的琼脂板上。在25℃孵育箱中孵育板。每天观察菌落的出现和生长。在接种后六天，在10μg/mL博来霉素下生长的菌落的大小与在0μg/mL博来霉素下生长的菌落大小类似，并且在30μg/mL至50μg/mL博来霉素下逐渐缩小。每个板上的菌落数也在10μg/mL、30μg/mL以及50μg/mL博来霉素下逐渐减少。在50μg/mL博来霉素下仅看到少许菌落。显著地，在50μg/mL博来霉素下生长的一些菌落中观察到发生各种明显的菌落形态改变的菌落角变区(colonysector)，但在较低浓度博来霉素下或在不存在博来霉素的情况下生长的菌落中未观察到，从而表明博来霉素确实是一种有效的破囊壶菌菌株诱变剂。在这些条件下，博来霉素在至少10-200μg/mL的范围内是有效的；较高浓度很可能也是有效的。例如，200-500μg/mL或更高的范围内的浓度可能起作用。在一些情况下，当也增加盐浓度时使用更高浓度的博来霉素以抵偿可能由盐所致的博来霉素降解。在本实施例中所使用的具体条件下，博来霉素在50μg/mL下能够发挥最佳作用。
实施例4：核酸构建体
本实施例描述了破囊壶菌特异性基因表达载体的构建。因此本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属基因、启动子和/或终止子的载体(例如，这样使得启动子位于所述基因的上游并且终止子位于下游)。所述载体包括例如一个或多个复制起点和一个或多个检测性标记或选择性标记。因此本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属启动子的载体。在一些实施方案中，所述载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测性标记或选择性标记。
1.产生重组质粒载体pD4DPZ1(SEQIDNO:30；图2)和pE5PZ1(SEQIDNO:31；图3)。利用PCR，使用ONC-T18的基因组DNA作为模板并且使用TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶(TakaraBioInc.,Shiga,Japan)来扩增ONC-T18的Δ4去饱和酶和Δ5延长酶基因的启动子DNA片段。使用在其5'端上具有限制性内切酶位点XhoI的引物#1(SEQIDNO:25)和在其5'端上包含限制性内切酶位点NcoI的引物#2(SEQIDNO:26)来对Δ4去饱和酶基因启动子(SEQIDNO:24)进行扩增。采用在其5'端上具有限制性内切酶位点XbaI的引物#3(SEQIDNO:20)和在其5'端上含有限制性内切酶位点NcoI的引物#4(SEQIDNO:21)来对Δ5延长酶启动子(SEQIDNO:19)进行扩增。在50μL体积的反应混合物中进行PCR反应，所述反应混合物含有2.5个单位TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶(TakaraBioInc.,Shiga,Japan)、1XLAPCR缓冲液II、dNTP混合物(各为0.40mM)、225ηg基因组DNA模板、0.20μM引物[引物对，用于扩增Δ4去饱和酶基因启动子的#1(SEQIDNO:25)和#2(SEQIDNO:26)，以及用于扩增Δ5延长酶启动子的#3(SEQIDNO:20)和#4(SEQIDNO:21)]，所述PCR反应在以下条件下进行：94℃，持续30秒，历经一个循环；98℃，持续10秒，以及55℃，持续5秒，72℃，持续2分钟，历经30个循环。
按照以下这些程序使PCR产物沉淀：添加不含核酸酶的ddH2O到总体积200μL，然后添加20μL3MNaAc(pH5.2)和440μL100％乙醇，并且通过短暂涡旋加以混合，在冰中孵育1小时，使用台式离心机以全速离心10分钟，弃去上清液，添加500μL75％乙醇并且以全速离心2分钟，弃去上清液并且将DNA沉淀物真空干燥约10分钟。在37℃下，在含有1XNE缓冲液2和1XBSA(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)的25μL体积的反应混合物中，使用限制性内切酶NcoI(10个单位)和XhoI(10个单位)消化Δ4去饱和酶基因启动子的PCR产物，持续2小时。在相同条件下使用限制性内切酶NcoI(10个单位)和XbaI(10个单位)消化Δ5延长酶基因启动子的PCR产物。在用于电泳的0.8％琼脂糖凝胶中，在88伏下拆分经过消化的PCR产物，持续45分钟。用刀片从琼脂糖凝胶上切出PCR产物的DNA条带，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对DNA进行提取和纯化。将所得的具有酶特异性粘性末端的Δ4去饱和酶基因启动子DNA片段连接到使用相同的限制性内切酶消化并且经过琼脂糖-凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2的对应限制性位点NcoI和XhoI中，以便产生载体pD4DPZ1(SEQIDNO:30；图2)。将所得的具有酶特异性粘性末端的Δ5延长酶基因启动子DNA片段连接到使用NcoI和NheI限制性内切酶消化并且经过琼脂糖-凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的限制性位点中，以便产生载体pE5PZ1(SEQIDNO:31；图3)。在环境温度下，在含有1X连接缓冲液、插入物和载体DNA(3:1摩尔比)以及0.5个单位T4DNA连接酶(Invitrogen,California)的10μL体积的反应混合物中进行连接反应，持续12小时。然后，将连接的DNA转化到大肠杆菌Top10感受态细胞(Invitrogen公司,California)中。使用ZyppyTM质粒微量制备试剂盒(ZymoResearchCorp.,Orange,California)从3mL细菌培养物中分离转化体的三个菌落的质粒DNA。通过使用酶XhoI和NotI针对Δ5延长酶基因启动子构建体进行限制性内切酶消化，并且使用酶NcoI和XhoI针对Δ4去饱和酶基因启动子构建体进行限制性内切酶消化来初步测试克隆的完整性。使用引物#14(SEQIDNO:22)和引物#15(SEQIDNO:23)对Δ4去饱和酶基因启动子载体的经过初步鉴定的阳性克隆JZ1-57-1以及Δ5延长酶基因启动子载体的经过预先鉴定的阳性克隆JZ1-57-7的插入物进行完全测序。所得的载体pD4DPZ1(SEQIDNO:30；图2)含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因，所述ble基因由ONC-T18的Δ4去饱和酶基因启动子和SV40终止子侧接。所得的载体pE5PZ1(SEQIDNO:31；图3)还含有ble基因，所述ble基因由ONC-T18的Δ5延长酶基因启动子和SV40终止子侧接。
因此，本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属启动子的载体。所述载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测性标记或选择性标记。
2.产生绿色荧光蛋白(GFP)标记基因表达载体(SEQIDNO:32；图4)。为了制备GFP基因的模板质粒DNA，从ArabidopsisDepositCenter(Ohio,USA)购得含有质粒pCD3-327[GenBank登记号U70496；(Davis和Vierstra,1998)]的大肠杆菌细菌储备液。将细菌划线接种在含有100μg/mL氨比西林(ampicillin)的LB琼脂板中。将单个群落接种在含有100μg/mL氨比西林的3mLLB培养基中，并且使其生长过夜。使用Ultraclean微生物微量制备DNA分离试剂盒(MOBIOLaboratories,Inc,SolanaBeach,California)，按照制造商的方案从所培养的细菌中分离质粒DNA。
通过PCR，使用TaKaRaPrimeStarTaqTMDNA聚合酶(TakaraBioInc.,Shiga,Japan)、模板质粒pCD3-327DNA以及引物对#5(SEQIDNO:33)(在其5'端上具有限制性内切酶位点XhoI)和#6(SEQIDNO:34)来扩增GFP基因DNA片段。然后，用乙醇使PCR产物沉淀并且用限制性内切酶XhoI进行消化，并且进行凝胶纯化。将经过凝胶纯化的DNA连接到经过XhoI和BsaAI酶消化并且经过凝胶纯化的载体pE5PZ1质粒DNA(SEQIDNO:31；图3)的骨架的限制性内切酶位点XhoI和BsaAI中，以便将ble基因置换为绿色荧光蛋白(GFP)标记基因，并且产生表达载体pE5PRsGFP1(SEQIDNO:32；图4)，在所述表达载体pE5PRsGFP1中，GFP基因由ONC-T18的Δ5延长酶基因启动子和SV40终止子侧接。如图4中所示，AMP抗性基因对转化的克隆提供了阳性选择。
因此本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属启动子的载体。在一些实施方案中，所述载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测性标记或选择性标记。根据本文所提供的对于多种所述载体和关于某些元件(如启动子和/或终止子)的序列信息(所述序列信息足以容许具有所述序列的元件(例如启动子、终止子)与其他元件连接)的描述，阅读本公开内容，本领域普通技术人员将完全能够经常根据已知技术例如通过将所提供的序列与任何各种已知的其他元件组合来制备并且使用广泛多种不同的单独的载体构建体。
3.产生重组质粒载体p341PZ40T(SEQIDNO:35；图5)。为了构建含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因的载体p341PZ40T(SEQIDNO:35；图5)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和SV40终止子侧接，通过PCR，使用引物对#66(SEQIDNO:36)和#67(SEQIDNO:37)以及实施例1中所描述的克隆JZ2-17-14的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#341的DNA片段。引物#66(SEQIDNO:36)的5'端序列与来源于载体pT7Blue-3(Novagen,Gibbstown,NJ,USA)的中间载体的小区域互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的5'端的负链互补。引物#67(SEQIDNO:37)的5'端序列与ble基因的开放阅读框的5'端序列的正链互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的3'端的正链互补。
还通过PCR，使用引物对#68(SEQIDNO:38)和#71(SEQIDNO:39)以及载体pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的质粒模板DNA来扩增ble基因ORF的DNA片段(包括位于它的3'端上的SV40终止子)。引物#68(SEQIDNO:38)的5'端序列与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的3'端序列的负链互补，并且它的3'端序列与ble基因ORF的5'端的负链互补。引物#71(SEQIDNO:39)的5'端序列与来源于载体pT7Blue-3的中间载体的小区域互补，并且它的3'端序列与SV40终止子的3'端序列的正链互补。
在50μL体积的反应混合物中进行PCR反应，所述混合物含有2.5个单位TaKaRaPrimeStarTaqTMDNA聚合酶(TakaraBioInc.,Shiga,Japan)、1XPrimerStarPCR缓冲液、dNTP混合物(各为0.40mM)、1ηg模板质粒DNA、0.20μM引物对中的每一种引物。采用以下PCR条件：98℃，持续10秒，以及55℃，持续5秒，以及72℃，持续2分钟，历经30个循环。在用于电泳的0.8％琼脂糖凝胶中，在65伏下拆分微管蛋白基因启动子#341和ble基因ORF的PCR产物，持续60分钟。用刀片剪出具有准确大小的条带，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对它们的DNA进行提取和纯化。然后，以类似的摩尔比混合经过凝胶纯化的PCR产物，将其用作DNA模板用于延伸PCR以将微管蛋白基因启动子#341、包括SV40终止子的ble基因ORF融合在一起(Higuchi、Krummel以及Saiki,1988；Zhang、Wege以及Jeske,2001)。在50μL体积的反应混合物中，使用TaKaRaPrimeStarTaqTMDNA聚合酶(TakaraBioInc.,Shiga,Japan)、大约100ng的混合PCR产物的模板DNA以及引物对#66(SEQIDNO:36)和#71(SEQIDNO:39)(各为0.20μM)进行延伸PCR。采用以下PCR条件：98℃，持续10秒，50℃，持续5分钟，以及72℃，持续3分钟，历经6个循环；以及98℃，持续10秒，50℃，持续5秒，以及72℃，持续3分半钟，历经25个循环。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对含有ONC-T18特异性ble基因表达盒的PCR产物进行凝胶纯化，并且使用延伸PCR将其克隆到来源于载体pT7Blue-3(Novagen,Gibbstown,NJ,USA)的中间载体中(Higuchi、Krummel以及Saiki,1988；Zhang、Wege以及Jeske,2001)。在50μL体积的PCR反应混合物中进行延伸PCR，所述PCR反应混合物含有2.5个单位TaKaRaPrimeStarTaqTMDNA聚合酶(TakaraBioInc.,Shiga,Japan)、1XPrimerStarPCR缓冲液、dNTP混合物(各为0.40mM)、200ng经过凝胶纯化的含有ONC-T18特异性ble基因表达盒的PCR产物的DNA，以及600ng由限制性内切酶HindIII线性化的中间载体的质粒DNA。采用以下PCR条件：98℃，持续10秒，60℃，持续5秒，以及72℃，持续5分半钟，历经30个循环。之后，通过DpnI进行限制性内切酶消化来破坏模板质粒DNA，所述DpnI特异性地消化从一些细菌菌株中分离的甲基化质粒DNA。在37℃下，在含有50μL延伸PCR产物、30个单位DpnI以及1X限制性内切酶反应缓冲液4(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)的150μL的反应体积中进行这种消化，持续2小时。在消化后，通过在80℃下孵育20分钟来使DpnI酶失活。然后，在消化混合物中添加无菌水达到350μL并且进一步脱盐，并且使用Microcon柱(YM-100,Millipore公司,Billerica,MA)将DNA浓缩至大约100ng/μL。使用1μL经过脱盐的DNA来使用设置在1890伏的电穿孔仪(Eppendorf5210)以及1mm间隙的电穿孔小槽(Eppendorf,NY,USA)对Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,California,USA)进行转化。通过实施例1中所描述的直接菌落PCR，使用引物对#64(SEQIDNO:40)和#65(SEQIDNO:41)对阳性菌落进行初步筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#15(SEQIDNO:23)、#16(SEQIDNO:42)、#54(SEQIDNO:7)、#64(SEQIDNO:40)、#65(SEQIDNO:41)以及#85(SEQIDNO:43)对阳性克隆JZ2-53-10的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)对所得序列进行组装和分析，并且确认所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表达载体被命名为p341PZST(SEQIDNO:35；图5)，在所述载体中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和SV40终止子侧接。
4.产生重组质粒载体p341PZ347T(SEQIDNO:44；图6)。为了构建含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因的载体p341PZ347T(SEQIDNO:44；图6)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和微管蛋白基因终止子#347侧接，通过PCR，使用引物对#66(SEQIDNO:36)和#67(SEQIDNO:37)以及实施例1中所描述的克隆JZ2-17-14的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#341的DNA片段。
还通过PCR，使用引物对#68(SEQIDNO:38)和#72(SEQIDNO:45)以及载体pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的质粒模板DNA来扩增ble基因ORF的DNA片段。引物#72(SEQIDNO:45)的5'端序列与微管蛋白基因终止子#347的5'端序列的正链互补。
通过PCR，使用引物对#73(SEQIDNO:46)和#74(SEQIDNO:47)以及实施例1中所描述的克隆JZ2-17-22的模板质粒DNA扩增微管蛋白基因终止子#347的DNA片段。引物#73(SEQIDNO:46)的5'端序列与ble基因的开放阅读框的3'端序列的负链互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因终止子#347的5'端的负链互补。引物#74(SEQIDNO:47)的5'端序列与来源于载体pT7Blue-3的中间载体的小区域互补，并且它的3'端序列与与破囊壶菌属种微管蛋白基因终止子#347的3'端的正链互补。
完全如实施例2第3部分中所描述的那样来进行PCR。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对PCR产物进行凝胶纯化。以类似的摩尔比混合微管蛋白基因启动子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因终止子#347的经过凝胶纯化的PCR产物，将其用作DNA模板用于延伸PCR以便将微管蛋白基因启动子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因终止子#347融合在一起。使用引物对#66(SEQIDNO:36)和#74(SEQIDNO:47)(各为0.20μM)，如实施例2第3部分中所描述的那样进行延伸PCR。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对融合PCR产物进行凝胶纯化，并且如实施例2第3部分中所描述的那样使用延伸PCR将其克隆到来源于载体pT7blue-3的中间载体中。通过电穿孔将延伸PCR产物转化到Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,California,USA)中。最初通过菌落PCR方法，使用引物对#64(SEQIDNO:40)和#65(SEQIDNO:41)、引物对#16(SEQIDNO:42)和#59(SEQIDNO:12)以及引物对#54(SEQIDNO:7)和#15(SEQIDNO:23)对阳性群落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#15(SEQIDNO:23)、#16(SEQIDNO:42)、#54(SEQIDNO:7)、#59(SEQIDNO:12)、#63(SEQIDNO:4)、#64(SEQIDNO:40)、#65(SEQIDNO:41)以及#85(SEQIDNO:43)对阳性克隆JZ2-69-2a的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)对所得序列进行组装和分析，并且确认所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表达载体被命名为p341PZ347T(SEQIDNO:44；图6)，在所述载体中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和终止子#347侧接。
因此本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属启动子和终止子的载体(例如，这样使得启动子位于所述基因的上游并且终止子位于下游)。在一些实施方案中，所述载体包括例如一个或多个复制起点和一个或多个检测性标记或选择性标记。因此本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属启动子的载体。在一些实施方案中，所述载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测性标记或选择性标记。
5.产生重组质粒载体p341P713T(SEQIDNO:48；图7)。为了构建含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因的载体p341PZ713T(SEQIDNO:48；图7)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和微管蛋白基因终止子#713侧接，通过PCR，使用引物对#66(SEQIDNO:36)和#67(SEQIDNO:37)以及实施例1中所描述的克隆JZ2-17-14的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#341的DNA片段。
通过PCR，使用引物对#68(SEQIDNO:38)和#75(SEQIDNO:49)以及载体pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的质粒模板DNA来扩增ble基因ORF的DNA片段。引物#75(SEQIDNO:49)的5'端序列与微管蛋白基因终止子#713的5'端序列的正链互补。
通过PCR，使用引物对#76(SEQIDNO:50)和#77(SEQIDNO:51)以及实施例1中所描述的克隆JZ2-9-22的模板质粒DNA扩增微管蛋白基因终止子#713的DNA片段。引物#76(SEQIDNO:50)的5'端序列与ble基因ORF的3'端序列的负链互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因终止子#713的5'端的负链互补。引物#77(SEQIDNO:51)的5'端序列与来源于载体pT7blue-3的中间载体的小区域互补，并且它的3'端与与ONC-T18的微管蛋白基因终止子#713的3'端的正链互补。
对微管蛋白基因启动子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因终止子#713的PCR产物进行凝胶纯化，将其以类似的摩尔比混合，并且用作DNA模板以用于使用引物对#66(SEQIDNO:36)和#77(SEQIDNO:51)进行延伸PCR，以便将微管蛋白基因启动子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因终止子#713融合在一起。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)对融合的PCR产物进行凝胶纯化，并且使用第二延伸PCR将其克隆到来源于载体pT7blue-3的由HindIII线性化的中间载体中。使用1微升(大约100ηg)延伸PCR产物DNA以通过电穿孔对Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,California,USA)进行转化。最初通过菌落PCR，使用引物对#64(SEQIDNO:40)和#65(SEQIDNO.41)、引物对#16(SEQIDNO:42)和#77(SEQIDNO:51)以及引物对#54(SEQIDNO:7)和#15(SEQIDNO:23)对阳性菌落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#15(SEQIDNO:23)、#16(SEQIDNO:42)、#54(SEQIDNO:7)、#63(SEQIDNO:4)、#64(SEQIDNO:40)、#65(SEQIDNO:41)以及#85(SEQIDNO:43)对阳性克隆JZ2-69-2b的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)对所得序列进行组装和分析，并且确认所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表达载体被命名为p341PZ713T(SEQIDNO:48；图7)，在所述载体中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和终止子#713侧接。
因此本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属启动子和终止子的载体(例如，这样使得启动子位于所述基因的上游并且终止子位于下游)。在一些实施方案中，所述载体包括例如一个或多个复制起点和一个或多个检测性标记或选择性标记。因此本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属启动子的载体。在一些实施方案中，所述载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测性标记或选择性标记。根据本文所提供的对于多种所述载体和关于某些元件(如启动子和/或终止子)的序列信息(所述序列信息足以容许具有所述序列的元件(例如启动子、终止子)与其他元件连接)的描述，阅读本公开内容，本领域普通技术人员将完全能够经常根据已知技术例如通过将所提供的序列与任何各种已知的其他元件组合来制备并且使用广泛多种不同的单独的载体构建体。
6.产生重组质粒载体p701PZ40T(SEQIDNO:52；图8)。为了构建含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因的载体p701PZ40T(SEQIDNO:52；图8)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#701和SV40终止子侧接，通过PCR，使用引物对#87(SEQIDNO:53)和#88(SEQIDNO:54)以及实施例1中所描述的克隆JZ2-17-10的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#701的DNA片段。引物#87(SEQIDNO:48)的5'端序列与载体p341PZ40T的小区域互补，并且它的3'端与微管蛋白基因启动子#701的5'端序列的负链互补。引物#88(SEQIDNO:54)的5'端序列与ble基因ORF的5'端序列的正链互补，并且它的3'端与微管蛋白基因终止子#701的3'端的正链匹配。对PCR产物进行凝胶纯化并且使用延伸PCR将其克隆到p341PZ40T载体中以便置换微管蛋白基因启动子#341(Higuchi等,1988；Zhang等,2001)。在延伸PCR中使用TaKaRaPrimeStarTaqTMDNA聚合酶、200ng经过凝胶纯化的PCR产物的DNA以及600ng载体p341PZ40T的由BglII线性化的质粒DNA。使用1微升(大约100ηg)延伸PCR产物DNA以通过电穿孔对Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen,California,USA)进行转化。最初通过菌落PCR方法，使用引物对#52(SEQIDNO:51)和#53(SEQIDNO:52)对阳性菌落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#52(SEQIDNO:1)和#53(SEQIDNO:2)、#15(SEQIDNO:23)、#16(SEQIDNO:42)、#63(SEQIDNO:4)、#64(SEQIDNO:40)、#65(SEQIDNO:41)以及#85(SEQIDNO:43)对阳性克隆的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)对所得序列进行组装和分析，并且确认所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表达载体被命名为p701PZ40T(SEQIDNO:52；图7)，在所述载体中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#701和SV40终止子侧接。
7.产生重组质粒载体p341PRsGP40T(SEQIDNO:55；图9)。为了构建含有来自维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria)的GFP基因的载体p341PRsGP40T(SEQIDNO:55；图9)，所述GFP基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和SV40终止子侧接，通过PCR，使用引物对#66(SEQIDNO:36)和#78(SEQIDNO:56)以及实施例1中所描述的克隆JZ2-17-14的模板质粒DNA来扩增微管蛋白基因启动子#341的DNA片段。引物#78(SEQIDNO:56)的5'端序列与GFP基因ORF的5'端序列的正链互补，并且它的3'端与ONC-T18的微管蛋白基因终止子#341的3'端的正链匹配。
还通过PCR，使用引物对#79(SEQIDNO:57)和#80(SEQIDNO:58)以及载体pCD3-327的模板质粒DNA来扩增GFP基因ORF的DNA片段。引物#79(SEQIDNO:57)的5'端序列与ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341的3'端序列的正链互补，并且它的3'端序列与GFP基因ORF的5'端的负链匹配。引物#80(SEQIDNO:58)的5'端序列与SV40终止子的5'端序列的正链互补，并且它的3'端与GFP基因ORF的3'端序列的正链匹配。
还通过PCR，使用引物对#81(SEQIDNO:59)和#71(SEQIDNO:39)以及载体pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的模板质粒DNA来扩增SV40终止子的DNA片段。引物#81(SEQIDNO:59)的5'端序列与GFP基因ORF的3'端序列的负链互补，并且它的3'端序列与SV40终止子的5'端匹配。
对以上三种PCR产物进行凝胶纯化，将其以类似的摩尔比混合，并且用作DNA模板以用于使用引物对#66(SEQIDNO:36)和#71(SEQIDNO:39)进行延伸PCR，以便将微管蛋白基因启动子#341、GFP基因ORF以及SV40终止子融合在一起(Higuchi、Krummel以及Saiki,1988)。对含有ONC-T18特异性GFP基因表达盒的延伸PCR产物进行凝胶纯化，并且在第二轮延伸PCR中将其克隆到由限制性内切酶HindIII线性化的载体p341PZ40T中。净化第二轮PCR产物，脱盐，并且通过电穿孔将其转化到Top10大肠杆菌感受态细胞中。使用直接菌落PCR以及引物对#54(SEQIDNO:7)和#86(SEQIDNO:60)对阳性菌落进行筛选。使用正向引物和反向引物以及内部引物#15(SEQIDNO:23)、#16(SEQIDNO:42)、#54(SEQIDNO:7)、#63(SEQIDNO:4)、#64(SEQIDNO:40)、#65(SEQIDNO:41)、#85(SEQIDNO:43)以及#86(SEQIDNO:60)对阳性克隆JZ2-53-20的插入物进行完全测序。使用生物信息学软件包Kodon(AppliedMaths)对所得序列进行组装和分析，并且确认所克隆的插入物的完整性。所得GFP基因表达载体被命名为p341PRsGFP40T(SEQIDNO:55；图8)，在所述载体中，GFP基因由ONC-T18的微管蛋白基因启动子#341和SV40终止子侧接。
8.产生重组质粒载体pD4DPZ118S(SEQIDNO:61；图10)。为了构建pD4DPZ18S(SEQIDNO:61；图10)载体，使用限制性内切酶SalI和SphI对载体pD4DPZ1的质粒DNA进行消化以便将载体线性化，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)按照制造商的方案进行凝胶纯化。通过使用酶XhoI和SphI进行限制性酶切消化以从克隆JZ2-3-1的质粒DNA释放通过PCR使用引物对18SrRNAf(SEQIDNO:27)和18SrRNAr(SEQIDNO:28)从ONC-T18的基因组DNA加以扩增并且被克隆到载体pT7Blue-3中的18SrDNA片段(SEQIDNO:29)，然后进行凝胶纯化并且将其连接到pD4DPZ1的线性化载体的限制性位点SalI和SphI中，以便产生具有18S核糖体RNA基因的DNA片段的pD4DPZ18S(SEQIDNO:61；图10)。
9.产生重组质粒载体p341PZ5pEx(SEQIDNO:62；图11)。为了构建载体p341PZ5pEx用于过表达同源基因和异源基因(例如，Δ12去饱和酶)，通过PCR，使用引物接头F(SEQIDNO:63)和接头R(SEQIDNO:64)对博来霉素抗性基因表达载体pd5EPPZ1进行修饰以便将博来霉素抗性基因ORF置换为多克隆位点，包括核酸内切酶限制性位点(NcoI、SpeI、KpnI、MluI、NdeI、SphI、NruI、BstBI以及BamHI)。在PCR之后，使用核酸内切酶限制性内切酶DpnI破坏模板质粒DNA。使PCR产物沉淀并且使用核酸内切酶限制性内切酶MluI消化，进行凝胶纯化，使用T4DNA连接酶(Invitrogen,California)重新连接在一起，然后将其转化到Top10大肠杆菌细胞中。使用限制性酶切消化对阳性克隆进行初步筛选。通过DNA测序确认阳性克隆的完整性并且将其命名为质粒p5eEP40T(SEQIDNO:65)。使用核酸内切酶限制性内切酶HindIII和EcoRI对阳性克隆的质粒DNA进行消化，并且对骨架质粒DNA进行凝胶纯化。还从经过相同的核酸内切酶限制性内切酶HindIII和EcoRI消化的载体p18S341PZ40t中分离博来霉素抗性基因表达盒并且进行凝胶纯化，在所述博来霉素抗性基因表达盒中，博来霉素基因ORF由微管蛋白基因启动子#341P和SV40终止子侧接。然后将博来霉素抗性基因表达盒连接到质粒p5eEP40T的对应核酸内切酶限制性位点HindIII和EcoRI中，从而产生基因表达载体p341PZ5pEx。
10.产生重组质粒载体pD12DPZ1和pD5DPZ1。利用PCR，使用ONC-T18的基因组DNA作为模板并且使用TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶(TAKARABIOINC.,Shiga,Japan)来扩增ONC-T18的Δ12和Δ5去饱和酶基因的启动子DNA片段(近似基因ORF的2千碱基的5-端)。利用适当地设计的在其5'端上具有限制性内切酶位点XhoI的正向PCR引物和在其5'端上包含限制性内切酶位点NcoI的反向引物来对Δ12去饱和酶基因启动子进行扩增。同样地，利用适当地设计的在其5'端上具有限制性内切酶位点XhoI的正向引物和在其5'端上包含限制性内切酶位点NcoI的反向引物来对Δ5去饱和酶基因启动子进行扩增。在50μL体积的反应混合物中进行PCR反应，所述反应混合物含有2.5个单位TaKaRaLATaqTMDNA聚合酶(TakaraBioInc.,Shiga,Japan)、1XLAPCR缓冲液II、dNTP混合物(各为0.40mM)、225ng基因组DNA模板、0.20μM引物，所述PCR反应在以下条件下进行：94℃，持续3分钟，历经一个循环；98℃，持续30秒，以及55℃，持续30秒，72℃，持续2分钟，历经30个循环。
根据以下这些程序使PCR产物沉淀：添加不含核酸酶的ddH2O到总体积200μL，然后添加20μL3MNaAc(pH5.2)和440μL100％乙醇，并且通过短暂涡旋加以混合，在冰中孵育1小时，使用台式离心机以全速离心10分钟，弃去上清液，添加500μL75％乙醇并且以全速离心2分钟，弃去上清液并且将DNA沉淀物真空干燥约10分钟。在37℃下，在含有1XNE缓冲液2和1XBSA(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)的25μL体积的反应混合物中，用限制性内切酶NcoI(10个单位)和XhoI(10个单位)消化Δ12去饱和酶基因启动子的PCR产物持续2小时，并且用限制性内切酶NcoI(10个单位)和XhoI(10个单位)消化Δ5去饱和酶基因启动子的PCR产物持续2小时。在用于电泳的0.8％琼脂糖凝胶中，在88伏下拆分经过消化的PCR产物，持续45分钟。用刀片从琼脂糖凝胶上切出PCR产物的DNA条带，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California)，按照制造商的方案对DNA进行提取和纯化。将所得的具有酶特异性粘性末端的Δ12去饱和酶基因启动子DNA片段连接到经过相同的限制性内切酶消化并且经过琼脂糖-凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2的对应限制性位点NcoI和XhoI中，以便产生载体pD12DPZ1。同样地，将所得的具有酶特异性粘性末端的Δ5去饱和酶基因启动子DNA片段连接到经过相同的限制性内切酶消化并且经过琼脂糖-凝胶纯化的载体pSV40/Zeo2的对应限制性位点NcoI和XhoI中，以便产生载体pD5DPZ1。在环境温度下，在含有1X连接缓冲液、插入物和载体DNA(3:1摩尔比)以及0.5个单位T4DNA连接酶(Invitrogen,California)的10μL体积的反应混合物中进行连接反应，持续12小时。然后，将连接的DNA转化到大肠杆菌Top10感受态细胞(Invitrogen公司,California)中。使用ZyppyTM质粒微量制备试剂盒(ZymoResearch公司,Orange,California)从3mL细菌培养物中分离转化体的1-10个菌落的质粒DNA。使用适当地对应的酶进行限制性内切酶消化来初步测试克隆的完整性。所得的载体pD12DPZ1和pD5DPZ1含有来自印度斯坦链异壁菌的ble基因，所述ble基因分别由ONC-T18的Δ12或Δ5去饱和酶基因启动子和SV40终止子侧接。
因此本公开尤其提供了包含操作地连接至异源基因的破囊壶菌属Δ12和/或Δ5去饱和酶启动子(例如脂肪酸合酶(FAS)1型)的载体。在一些实施方案中，所述载体包括例如终止子、一个或多个复制起点以及一个或多个检测性标记或选择性标记。
11.产生具有Δ12去饱和酶启动子的重组质粒载体以驱动Δ5去饱和酶基因表达。通过PCR，使用适当选择和设计的引物来扩增ONC-T18的Δ5去饱和酶基因的前2千碱基与启动子区(近似基因ORF的2千碱基5-端)，以便扩增序列并且在扩增的序列的末端上插入限制性消化位点。分离并纯化所得的PCR产物，然后使用适当设计的引物进行第二轮PCR以在ORF开始与启动子之间插入限制性位点。使用标准技术将所得构建体克隆到细菌表达载体中。
然后使用工程化的限制性位点和标准分子生物学技术将Δ12去饱和酶基因启动子(SEQIDNO:69)的分离的序列克隆到Δ5去饱和酶基因的ORF的5-端。然后，将连接的DNA转化到大肠杆菌Top10感受态细胞(Invitrogen公司,California)中。使用ZyppyTM质粒微量制备试剂盒(ZymoResearch公司,Orange,California)从3mL细菌培养物中分离转化体的1-10个菌落的质粒DNA。使用特异于工程化的限制性位点的酶进行限制性内切酶消化来初步测试克隆的完整性。
12.产生重组Δ12去饱和酶酵母表达载体。使用UltraClean6分钟微型质粒制备试剂盒(MOBIOLaboratories,Inc,SolanaBeach,Calif.)纯化来自实施例1.7的质粒DNA。因此用BamHI/NotI消化获得的质粒并且克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中以产生克隆pYΔ12Desat，然后将pYΔ12Desat用于酵母的表达研究中。
13.产生Δ12去饱和酶敲除载体pT7-ΔΔ12desat。为了证实宿主生物体内的Δ12去饱和酶基因的功能，制备了pT7-ΔΔ12desat载体。通过PCR沿着Δ12去饱和酶ORF和3’UTR序列的一部分来扩增即刻侧接Δ12去饱和酶ORF的5’序列的1000个碱基对。这提供了5’和3’序列用于同源重组。所使用的引物是Δ12RegF1–GGATCAAAGTCATACTATGCGTACACG(SEQIDNO:87)和Δ12RegR1–GGTACCGTGAATACAGTCGAGGTAGC(SEQIDNO:88)，从而产生2368个碱基对的DNA片段。通过标准的TA克隆方法，根据制造商的说明书将这个DNA片段克隆到质粒pT7-Blue3(Novagen)中。通过消化分析提取的质粒DNA来鉴定阳性克隆并且对其测序以确认构建体保真度，从而产生质粒pT7-ΔΔ12desat。通过PCR从适合的模板DNA中分离Ble-SV40DNA片段并对其扩增。针对这个过程采用引物Δ12delMW-F– ATGGCCAAGTTGACCAGTGC(SEQIDNO:89)和Δ12delMW_R– CAGACATGATAAGATACATTG(SEQIDNO:90)。设计引物以包括将同源性引入到Δ12去饱和酶DNA片段的5’延长部分(在引物D12delMWF和D12delMWR中的粗体和下划线部分)。使用标准反应条件通过PhusionDNA聚合酶进行PCR。为了增加插入效率，使用在Δ12去饱和酶ORF的碱基1与碱基95之间的独特位点处裂解的限制性内切酶如NcoI消化质粒pT7-D12desat。凝胶纯化线性质粒DNA并且与Ble-SV40PCR的凝胶纯化的产物一起使用，所述Ble-SV40PCR在第二PCR反应中从引物D12DelMWF和D12delMWR产生，将所述Ble-SV40PCR设计成以位点特异性方式将Ble-SV40DNA片段插入pT7-D12desat中从而产生质粒pT7-ΔΔ12desat。这个PCR方法被称为MEGAWHOMPPCR，并且先前已被描述(Miyazaki2011)，并且所述方法通过PhusionDNA聚合酶根据标准方案来完成。扩增之后，通过添加5μl10xNEB缓冲液4和2μlDpnI限制性核酸内切酶使用DpnI来消化PCR反应。在37℃下消化反应持续16小时。消化之后，通过SureClean试剂(Bioline)按照制造商的说明书沉淀DNA样品，将其重新悬浮在10μl无水核酸酶中并且3μl悬浮体用来转化电感受态大肠杆菌细胞。根据标准方案实现转化，并且立即将细胞重新悬浮在750μlSOC培养基中并且在37℃下孵育1小时。随后通过将细胞展布在含有氨比西林的LB琼脂板上和在37℃下孵育>16小时来实现选择。选择数种生成的克隆，在3.5MlLB肉汤中培养，用氨比西林补充，通过zippy质粒DNA提取试剂盒根据制造商的说明书提取质粒DNA。完成消化以确认在pT7-D12去饱和酶内存在Ble-SV40DNA片段，并且对阳性质粒测序以确认插入的保真度和准确性。从而创建了质粒pT7-ΔΔ12desat。
实施例5：新型发酵程序
本实施例描述了用于在破囊壶菌菌株中获得高生物质、总脂质以及PUFA产生的二阶段发酵方法。
通过对来自在各种条件(如X:N来源的比率、溶解氧水平以及温度)下生长的培养物的细胞进行显微镜观察来详细地研究菌株ONC-T18的生命周期。已发现，在低氧浓度和高碳与氮的比率(C:N)(例如在40:1至1:大约0的范围内，并且确切来说在1:1至1:大约0下)以及环境温度下，菌株ONC-T18生长旺盛并且主要通过产生游动孢子来繁殖，从而产生大量的含有相对小并且较少的亚细胞油体的小营养细胞。相比之下，在高C:N比、低氧水平以及相对低温(例如在10℃-30℃范围内，并且确切来说在20℃-25℃下)下，菌株ONC-T18主要通过直接营养细胞分裂来繁殖，从而产生大量的含有非常庞大的亚细胞油体的巨细胞。因此，开发了二阶段发酵方法以使生物质、总脂质以及PUFA生产率最大化。这是一种用于使高脂质和PUFA破囊壶菌菌株生长并且对其进行筛选的最佳方法。进行以下三个测定：
测定I：将野生型菌株ONC-T18接种在10mL液体ONC-T18-GM0培养基中。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长2天。然后，在250mL烧瓶中将接种物(OD660＝12)接种在100mLONC-T18-GM0培养基中。每种菌株接种三份培养物。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长2天，然后切换成150rpm和20℃，并且使其再生长4天。通过将细胞培养物转移到50mL锥形离心管中并且使用SORVALLLEGENDRT+离心机(ThermoFisherScientific公司,MA,USA)在4000rpm下离心来收获培养物的生物质。生物质以紧密层的形式浮在液体培养基的表面上。通过使用18G11/2注射器针头在锥形离心管的底部穿出极小的洞来释放液体培养基。将管中的生物质的沉淀物在-80℃冷冻器中冷冻过夜，然后使用冷冻干燥器冷冻干燥三天。对每个样品的生物质进行称重。
测定II：如测定I中所述制备接种物。接下来，在250mL烧瓶中将接种物(OD660＝6)接种到50mLONC-T18-GM0培养基中。每种菌株接种三份培养物。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长2天，然后切换成150rpm和20℃。在接种后2天，将5mL经过高压灭菌的50％葡萄糖添加到每个培养烧瓶中，然后在接种后4天，添加6mL葡萄糖。在接种后6天之后，如测定I中所述收获培养物的生物质。
测定III：如测定I中所述制备接种物。然后，在250mL振荡三角烧瓶(baffledflask)中将接种物(OD660＝6)接种到50mLONC-T18-GM0培养基中。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长。在接种后2天和4天，将5mL和6mL经过高压灭菌的50％葡萄糖分别添加到每个培养烧瓶中，如测定II中所操作。在接种后6天，如测定I中所述收获培养物的生物质。
使用直接酯基转移法分析每个样品的总脂质和DHA含量。通过涡旋10秒将近似20mg经过冷冻干燥的细胞生物质和3mL酯基转移反应缓冲液(甲醇:盐酸:氯仿)混合，然后在90℃水浴中孵育两小时。在完成酯基转移之后，移出样品并且冷却到环境温度。添加1mL水并且通过涡旋10秒加以混合。然后通过添加3X2mL己烷:氯仿(v/v，4:1)溶剂并且涡旋10秒来提取脂肪酸甲酯(FAME)，并且允许其静置直到完成相分离为止。
使用两种内标物(200μL)对FAME进行气相色谱(GC)分析。在酯基转移之前添加一种二十六烷酸(C23:0)并且在分析之前直接添加另一种十九烷酸(C19:0)。在安装有30mX0.32mm内径(0.25μm膜厚度)OMEGAWAX320熔融石英毛细管柱(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和设定在250℃的火焰离子化检测器(在275℃下FID检测器的分流比为50:1)的Agilent6890GC(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA,USA)中进行分析。注射体积为1μL。载气为恒定流速为每分钟5.0mL的H2。使用TraceGC-DSQ质谱仪(ThermoElectron,Boston,USA)并且与实验室标准品的保留时间进行比较来对FAME的身份进行确认。
结果(表10)表明测定II中所使用的发酵条件对于ONC-T18中的高脂质和DHA产生来说是最好的；观察到约50％至约70％范围内的干生物质水平；基于这些研究结果可以预期高至约70％至约90％的水平。所观察到的DHA产率在约5g/L培养物至约7.5g/L培养物的范围内。基于这些研究结果，可以预期高至约45g/L至约95g/L的DHA产率。
表10：在各种发酵条件下的破囊壶菌属种ONC-T18的生物质、总脂质以及DHA生产率
测定 生物质(g/L) 总脂质(mg/g) 总脂质(g/L) DHA(g/L) DHA％
I 7.10 211.20 1.499 0.45 30.02
II 41.32 671.09 27.729 5.94 21.42
III 46.50 661.07 30.740 3.06 9.96
在测定III中例如通过使用振荡三角烧瓶和高振荡速度来增加溶解氧可以显著地提高生物质生产率，但是DHA生产率显著低于测定II中的DHA生产率。因此，优化发酵参数(如C:N比率、葡萄糖浓度、溶解氧以及温度)以及在发酵过程中这些参数的动力学会影响破囊壶菌菌株中脂质和PUFA的有成本效益的产生。不希望受任何具体理论束缚，发明人认为与测定I相比在测定II中所观察到的产率增加可能至少部分地归因于在测定II中葡萄糖浓度更高和/或溶解氧水平更低。
实施例6：优化ONC-T18-GM0培养基中的盐度用于有效选择破 囊壶菌属种ONC-T18转化体
如本领域中所知，博来霉素在高盐浓度下不稳定(Invitrogen,CA,USA)。还已经显示，ONC-T18因它的天然存在环境而更喜欢生长在相对高的盐度条件下(PCT/IB2006/003977)。本实施例描述了确定用于使用博来霉素抗性基因作为选择性标记来有效选择ONC-T18转化体的最佳博来霉素浓度和盐度。
将由2天培养物1:500稀释的100μLONC-T18细胞悬浮液展布在含有各种浓度的抗生素博来霉素和海盐的ONC-T18-GM0板上。在25℃孵育箱中将接种的板孵育10天。对每个板上的菌落数进行计数。来自两个一式两份板的菌落数的平均值呈现于表2中。在接种后10天，在含有5g/L海盐和各种浓度的博来霉素的ONC-T18-GM0琼脂板中没有观察到菌落。在含有8.5g/L海盐而不含博来霉素的板中，仅观察到一个菌落。在含有18g/L海盐而不含博来霉素的板中，菌落数类似于含有35g/L海盐而不含博来霉素的板的菌落数。然而，30μg/mL浓度的博来霉素完全抑制含有18g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板中的ONC-T18的生长，而需要100μg/mL博来霉素来完全抑制含有35g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板中的ONC-T18。测量两个一式两份板中的单个群落的直径并且它们的平均值示于表3中。18g/L与35g/L之间的盐度并不显著地影响菌落的大小(图12)。本实施例因此尤其证实了在浓度高于约8.5g/L的海盐存在下观察到更好的生长。8.5g/L至大于35g/L(例如至约36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L或更多，甚至可能多达55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L或更多)范围内的浓度可以适合用于生长。当然，对于使用博来霉素选择转化体，希望在维持对博来霉素的敏感性的情况下实现稳固生长。因此，对于这个工作，使用18g/L海盐来制备ONC-T18-GM0以用于选择使用具有博来霉素抗性基因表达盒的构建体转化的ONC-T18转化体。
表11：博来霉素和盐度对破囊壶菌属种ONC-T18的菌落数的影响
表12：博来霉素和盐度对破囊壶菌属种ONC-T18的菌落生长速率(直径，以mm为单位)的影响
在不同的压力条件下测试转化效率。在各种压力条件下测试转化效率。在本实施例中，发现约1100psi的压力条件与所测试的其他压力条件相比产生更好的转化效率。
实施例7：对破囊壶菌属种ONC-T18进行转化
本实施例描述了ONC-T18的生物射弹式转化方法。
材料和方法。
产生感受态细胞。在25℃孵育箱中，将ONC-T18维持在ONC-T18-GM0琼脂板上，并且每3-4周转移至新鲜板。将获取自生长旺盛的细胞的一菌环量的ONC-T18接种物在250mL锥形烧瓶中的50mLONC-T18-GM0中接种，然后在振荡孵育箱中在25℃下在150rpm下培养约46小时。在层流净化罩中，在无菌条件下，将0.5毫升的培养物转移到已灭菌的1.5mL离心管中，然后在台式离心机中在3,000rpm下离心1分钟。弃去上清液，将细胞沉淀物重新悬浮于0.5mL无菌水中，并且将100μL细胞悬浮液展布在ONC-T18-GM0琼脂板的中心区域(近似28cm2)上。将皮氏培养皿在层流净化罩中在无菌条件下保持打开状态10分钟至15分钟以使细胞沉降并且使液体水蒸发。
生物射弹式转化。使用ZYPPYTM质粒大量提取试剂盒(ZymoResearchCorp.,Orange,California)按照制造商的方案从含有相应质粒的菌株的细菌培养物中分离质粒pd5EPZ1、p341PZ40T、p341PZ347T、p341PZ713T以及pD4DPZ18S(如实施例2中所描述进行构建；还参见图3、图5、图6、图7以及图10)。如实施例2中所论述，这些质粒中的每一个都含有ble转基因，所述ble转基因赋予了针对博来霉素、腐草霉素以及博莱霉素的抗性。(参见例如Gatignol等(1988)和Dumas等(1994)，所述文献各自的全部内容以引用的方式并入本文。)在本实施例中，采用Shble(印度斯坦链异壁菌)转基因。其他ble转基因也是适合的，如Tn5ble和Sable(金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))转基因。
对于每个质粒，通过涡旋3分钟将5μL(大约1μg/μL)质粒DNA与25μL金颗粒悬浮液(60mg/mL，在50％甘油中)混合并且在冰上孵育10分钟。将10μL0.1M亚精胺和25μL2.5MCaCl2添加到混合物中并且立即涡旋4分钟，然后在台式离心机中以全速离心10秒。弃去上清液。用70％乙醇将涂覆有质粒DNA的金颗粒洗涤两次并且重新悬浮于36μL98％乙醇中。将6μL金颗粒悬浮液展布在每个巨载体膜片上并且将膜片空气干燥(Zhang等2001)。
在灭菌条件下在层流净化罩中根据制造商的方案，使用PSD-1000/He颗粒递送系统(Bio-RadLaboratories,Inc.,California)将具有博来霉素抗性基因表达盒的质粒DNA递送到ONC-T18感受态细胞中。将颗粒递送系统的部件(包括巨载体固定器、巨载体、终止屏)进行高压灭菌。通过用70％乙醇进行擦拭来对颗粒递送系统的腔室进行消毒。在轰击之后，在25℃孵育箱中在暗处将含有转化的细胞的皮氏培养皿孵育6小时至16小时。然后使用1mL无菌培养基将转化的细胞从皿上洗出，转移到1.5mL高压灭菌的微量离心管中，并且在3,000rpm下离心2分钟。弃去上清液并且将沉淀物重新悬浮于0.5mL高压灭菌的培养基中。将50μL至150μL的细胞悬浮液展布在含有大约50-500μg/mL博来霉素的琼脂ONC-T18-GM0板上。在已经使板中的液体蒸发之后，用M密封板并且在25℃孵育箱中孵育6-10天。使用10μL吸移管尖端挑选博来霉素抗性菌落并且将其悬浮于200μLPCR管中的50μL无菌水中。将1μL细胞悬浮液点样到含有150-200μg/mL博来霉素的ONC-T18-GM0琼脂板上。在25℃下孵育3-5天之后，选择生长旺盛的菌落用于进一步分析。
在生物射弹式转化之后4-6天，使博来霉素抗性菌落在含有50-500μg/mL博来霉素的ONC-T18-GM0琼脂板上生长。使用来源于从ONC-T18分离的各种启动子和终止子的组合的各种构建体来产生博来霉素抗性菌株。每次转化使用不同的构建体所产生的转化体数目是可变的。(参见例如表13)。在一些实施方案中，转化数目为每5μg质粒DNA中有近似10-500次转化。
表13：每次转化的转化体数目
构建体 转化体数目/5μg质粒DNA
pd5EPZ1 11
p341PZ40T 9
p341PZ347T 4
p341PZ713T 7
pD4DPZ18S 5
实施例8：对破囊壶菌属种ONC-T18的转化体进行PCR分析
本实施例描述了确认在转化的ONC-T18中存在转基因。使用PCR测定来评估ble转基因的存在，所述ble转基因存在于用来转化ONC-T18的每个质粒构建体中。
在50mL烧瓶中将一菌环量的在博来霉素-ONC-T18-GM0琼脂板上生长的每种可能经过转化的菌株的接种物接种于10mL液体ONC-T18-GM0培养基中，并且使其在振荡孵育箱中在25℃下并且在250rpm下生长2天。使用2mL培养物，使用Ultraclean微生物微量制备DNA分离试剂盒(MOBIOLaboratories,Inc,SolanaBeach,California)根据制造商的方案来分离每种菌株的基因组DNA。使用分光光度计Spectro2000RSP(Lebomed,Inc.,CulverCity,CA,U.S.A)测量基因组DNA浓度。在200μLPCR管中，将0.5μL的基因组DNA用于含有以下组分的20μLPCR反应物：TaqDNA聚合酶(Sigma)、1XPRC缓冲液、2.5mMMgCl2、dNTP混合物(各为0.20mM)、0.25μM引物#64(SEQIDNO:66)，以及0.25μM引物#65(SEQIDNO:67)。使用以下热循环程序进行PCR反应：94℃，持续3分钟；94℃，持续1分钟；55℃，持续2分钟；以及72℃，持续2分钟，历经30个循环。引物#64与用于转化ONC-T18的每个质粒的ble基因的5’端退火，并且引物#65与用于转化ONC-T18的每个质粒的ble基因的3'端退火。从阳性转化体的基因组DNA以及从阳性对照的质粒DNA，但未从分离自野生型ONC-T18细胞的阴性对照的基因组DNA扩增大约350个碱基对的DNA片段。这些结果确认了大多数博来霉素抗性菌株是真实的转化体(图13)。
实施例9：转化体的生长速率
本实施例描述了确定转化的单细胞来源的菌株的生长速率。使用10μL移液管尖端从每个菌落中挑选在博来霉素ONC-T18-GM0琼脂板上已转化三次的博来霉素抗性菌株的接种物，并且重新悬浮于200μLPCR管中的50μL无菌水中。将1μL细胞悬浮液点样于含有18g/L或35g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板(15g/L琼脂)上。在接种后的第1天、第3天、第5天、第7天以及第9天测量点样的菌落的直径。
在ONC-T18-GM0琼脂板上大多数所测试的菌株比野生型菌株ONC-T18生长得快，无论它们是在含有18g/L或是35g/L海盐的板上生长。在所测试的菌株中，大多数菌株在含有18g/L海盐的板上比在含有35g/L海盐的板上生长得快。在含有18g/L海盐的ONC-T18-GM0琼脂板上生长最快的一些菌株(如菌株5-3)比在含有35g/L海盐的板上的其他菌株生长得慢。看来大多数转化的菌株更喜欢在含有更低盐度例如18g/L海盐的培养基上生长(图14)。
实施例10：转化的菌株的博来霉素敏感性
本实施例描述了对单细胞来源的经过转化的菌株的博来霉素敏感性的测定。
使用10μL吸移管尖端从菌落中挑选已经在博来霉素/ONC-T18-GM0琼脂板上通过菌落传代转移三次的博来霉素抗性菌株(以及它们的亲本菌株或野生型菌株)的极小量接种物，并且将其重新悬浮于200μLPCR管中的50μL无菌水中。将1μL细胞悬浮液点样于含有18g/L海盐(15g/L琼脂)以及浓度在0μg/mL至5000μg/mL范围内的博来霉素(Invitrogen,CA,USA)的ONC-T18-GM0琼脂板上。在第1天、第3天、第5天、第7天以及第8天测量点样的菌落的直径。
所测试的所有菌株在不存在博来霉素的情况下在ONC-T18-GM0琼脂板上都良好地生长，但是它们的生长速率有所不同。亲本菌株(野生型菌株)ONC-T18仅在具有30μg/mL或更少博来霉素的ONC-T18-GM0琼脂板上生长。对于所有五种不同的质粒构建体，所有转化的具有博来霉素抗性基因(来自印度斯坦链异壁菌)表达盒的菌株在具有浓度在30μg/mL至1000μg/mL范围内的博来霉素的ONC-T18-GM0琼脂板上都良好地生长(图15)。然而，在5000μg/mL博来霉素的浓度下，大多数菌株的生长显著慢于它们在具有1000μg/mL或更少博来霉素的培养基上的生长，并且一些菌株完全无法在5000μg/mL博来霉素上生长(图15)。然而，数种菌株，尤其是那些经过具有由Δ5延长酶基因启动子驱动的博来霉素抗性基因表达盒的质粒构建体转化的菌株非常良好地生长(图15)，从而表明与其他菌株相比，在这些菌株中博来霉素抗性基因的表达升高，对此原因可能包括：(i)由于例如强表达、稳定mRNA、基因沉默的抑制，Δ5延长酶启动子允许在细胞中累积更多的重组蛋白；(ii)转基因插入物位于基因组的活跃转录区，再次增加了细胞中的重组蛋白水平或(iii)Δ5延长酶构建体能够优先地诱导来自单个转化的多个插入事件，从而增加细胞中的表达水平和重组蛋白水平。
这些结果与以下一致：DHA是破囊壶菌微藻类组中的主要能量储存脂肪酸(Jain等2007)，和Δ5延长酶延长步骤是DHAω-3脂肪酸产生微生物中DHA生物合成过程中的限速步骤(Leonard等2004)。经过相同质粒构建体转化的菌株间生长速率的可变性反映了由于插入位置可变性引起的表达水平的可变性(如先前所讨论)或宿主菌株ONC-T18的染色体内的ble转基因的拷贝数的变化(如先前所讨论)。
这些结果证实了从ONC-T18分离的各种启动子和终止子序列可以有效地驱动PUFA产生微生物中的转基因表达。另外，这些结果表明来自印度斯坦链异壁菌的ble转基因是一种用于破囊壶菌属种菌株的工业菌株改良方案和遗传操纵的非常有效的选择标记基因，如先前所描述(Hou和Shaw2010；Sakaguchi,Matsuda等2012)。
实施例11：破囊壶菌属种ONC-T18的经过转化的菌株与野生型 菌株之间的生物质生产率的比较
本实施例描述了对转化体的生物质生产率与野生型菌株破囊壶菌属种的生物质生产率的比较。
将ONC-T18、10mLONC-T18-GM0(18g/L海盐)培养物各自用转化的菌株(即携带博来霉素抗性基因)或野生型菌株ONC-T18接种。用转化的菌株接种的培养物在培养基中含有200μg/mL博来霉素。用野生型菌株ONC-T18接种的培养物在不具有博来霉素的培养基中生长。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长3天，直到OD600达到约1.979～2.369为止。然后，在250mL烧瓶中，用OD600值为6的每种菌株的接种物对含有18g/L或35g/L海盐的50mLONC-T18-GM0培养物进行接种，所述菌株包括野生型菌株(测量1mL培养物的OD600，然后将培养物的体积按比例扩大以对应于6的OD600值；例如，如果OD600测量结果是2，那么使用(1mL×(6/2.0))＝3mL作为接种物)。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长2天。然后将5mL经过高压灭菌的50％葡萄糖添加到每个培养烧瓶中。使培养物在设定在150rpm的振荡孵育箱中并且在20℃下再连续生长2天。然后将6mL经过高压灭菌的50％葡萄糖添加到每个培养烧瓶中并且使培养物在设定在150rpm的振荡孵育箱中并且在20℃下再持续生长3天。通过将细胞培养物转移到50mL锥形离心管(falcontube)中并且使用SORVALLLEGENDRT+离心机(ThermoFisherScientificInc.,MA,USA)在4000rpm下离心来收获两种类型的ONC-T18-GM0培养基(具有18g/L或具有35g/L海盐)中的每种菌株的培养物的生物质。生物质以紧密层的形式浮在液体培养基的表面上。通过使用18G11/2注射器针头在锥形离心管的底部穿出极小的洞来释放液体培养基。将管中的生物质的沉淀物在-80℃冷冻器中冷冻过夜，然后使用冷冻干燥器冷冻干燥三天。对每个样品的生物质进行称重。测试包括野生型在内的九种菌株。
如所期望，当在含有35g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中生长时，大多数转化体产生与野生型菌株ONC-T18类似的干细胞生物质的量。然而，当在相同条件下生长时，8种转化的菌株中有一种产生比野生型菌株ONC-T18多约22％的干细胞生物质(图16)。类似地，在含有18g/L海盐的ONC-T18-GM0中，8种转化的菌株中有7种产生与野生型菌株ONC-T18类似或比野生型菌株ONC-T18更多的生物质的量。8种所测试的菌株中有一种产生比野生型菌株ONC-T18多19.5％的生物质(图16)。这证实了转化和转基因表达不会消极地影响由ONC-T18引起的生物质产生。因此，假定ONC-T18生物学是足够稳固以承受与转化和异源蛋白生物合成相关的压力。
实施例12：破囊壶菌属种ONC-T18的经过转化的菌株与野生型 菌株之间的DHA生产率的比较
本实施例描述了在多质粒或多顺反子表达系统中，用包含Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去延长酶以及其组合的表达载体转化的各种菌株中的DHA生产率的。当与野生型菌株和用空载体对照转化的菌株相比时，观察到DHA水平升高。本实施例尤其证实了，可以实现比野生型高至少1％-36％范围内(例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％等)的水平。基于这些研究结果，本领域普通技术人员将了解，可以实现进一步升高(例如，升高到比野生型高1％-1000％范围内的水平，例如，比野生型高约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％或更多的水平)。本实施例进一步证实了实现约1:4至约1:2范围内的DHA:生物质比率，比在野生型菌株下通常所观察到的DHA:生物质比率高至少约40％。(参见例如Raghukumar(2008)中的表2，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文。)基于这些研究结果，本领域技术人员将了解可以实现至少约1:5的比率。我们已经实现了约1:8至1:4的DHA:生物质比率(DHA:生物质)；并且预期实现约1:3的比率。文献(如由Raghukumar,2008发表的综述)中的实施例表明已实现不使这个比率降低到1:5以下。
在与所描述的条件相同的条件下使256种单独地经过转化的菌株(用包含Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5延长酶的表达载体的每个组合转化)与它们的亲本菌株(野生型)的培养物生长，并且收获生物质并且将其冷冻干燥。通过直接酯基转移方法进行脂肪酸甲酯(FAME)提取。通过涡旋10秒将近似20mg经过冷冻干燥的细胞生物质和3mL酯基转移反应缓冲液(甲醇:盐酸:氯仿)混合，然后在90℃水浴槽中孵育两小时。在完成酯基转移之后，移出样品并且冷却至环境温度。添加1mL水并且通过涡旋10秒加以混合。然后通过添加3X2mL己烷:氯仿(v/v，4:1)溶剂并且涡旋10秒来提取FAME；然后允许样品静置直到完成相分离为止。
使用两种内标物(200μL)对FAME进行气相色谱(GC)分析。在酯基转移之前添加一种二十六烷酸(C23:0)并且在分析之前直接添加另一种十九烷酸(C19:0)。在安装有30mX0.32mm内径(0.25μm膜厚度)OMEGAWAX320熔融石英毛细管柱(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和设定在250℃的火焰离子化检测器(在275℃下FID检测器的分流比为50:1)的Agilent6890GC(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA,USA)中进行分析。注射体积为1μL。载气为恒定流速为每分钟5.0mL的H2。使用TraceGC-DSQ质谱仪(ThermoElectron,Boston,USA)并且与实验室标准品的保留时间进行比较来对FAME的身份进行确认。
许多经过转化的菌株产生约6.337g/LDHA。当在含有35g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中生长时，此产率比野生型菌株ONC-T18多约16％。当在相同条件下在含有18g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中生长时，一些经过转化的菌株产生比野生型菌株ONC-T18多1％至13％范围内的DHA。
一些经过转化的菌株产生7.445g/L和7.871g/LDHA，这分别表示比它们在含有35g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中生长的亲本菌株(5.935g/L)多25％和36％。使用盐度更低的ONC-T18-GM0不仅会直接降低DHA生产成本，而且还会减慢由用于培养破囊壶菌微生物的生长培养基中的高浓度氯化钠盐所引起的对发酵罐的腐蚀。
来自高水平DHA产生的转化的菌株的DHA与总脂质的比率高于它们的亲本菌株。DHA:总脂质因数可以影响对从经过转化的菌株的细胞中提取的DHA的下游加工。用本文所提供的菌株和方法实现的DHA:总脂质比率可以根据发酵条件而改变。例如，对于在烧瓶中生长的培养物，可以通常用经过转化的菌株实现DHA占总脂质约15％至约50％的百分比(对应于约0.15:1至约0.50:1的DHA:总脂质比率)。对于在发酵罐中生长的培养物，可以通常用经过转化的菌株实现DHA占总脂质约30％至约75％的百分比(对应于约0.3:1至约0.75:1的DHA:总脂质比率)。从本文所公开的经过转化的菌株获得的DHA产率比可以用野生型菌株获得的DHA产率要大得多。例如，来自经过转化的菌株的DHA产率通常在约7g/L(基于以上数据)至约50g/L(每升培养基DHA的克数)范围内，而来自野生型ONC-T18菌株的DHA产率通常在约0.5g/L至约6g/L范围内。(参见例如Raghukumar(2008)中的表2)。来自高水平DHA产生的转化的菌株的DHA与生物质的比率也高于它们的亲本菌株。这种更高的DHA与生物质比率有利于从转化的菌株的细胞生物质中下游提取DHA。
本实施例中的所有培养物都在相同条件下生长(野生型ONC-T18在无博来霉素存在的情况下培养)。转化的菌株能够产生更高水平的DHA表明了那些菌株将碳源转化成DHA的效率更高，这可以降低从那些转化的菌株生产DHA的成本。
实施例13：破囊壶菌属种ONC-T18的经过转化的菌株与野生型 菌株之间总脂质生产率的比较
如本文所充分描述和证实，ONC-T18作为高效的生物工厂(biofactory)不仅在用于PUFA和它的药物和营养药物(nutraceutical)生物分子产品的衍生物方面，而且还在用于生物燃料生产方面具有巨大潜能。为了对待用于生物燃料生产的ONC-T18的能力进行评估和表征，针对在用于对于特殊产品应用改变脂肪酸分布的方法中的潜在用途来分析ONC-T18的经过转化的菌株的总脂质生产率和脂肪酸分布。例如，可能希望提高短链脂肪酸(即具有少于16个碳的脂肪酸)或特定PUFA的产生，如本文在对PUFA生物合成途径的讨论中所提到。可能例如希望提高EPA(例如通过使PKS基因和Δ5延长酶基因突变或敲除PKS基因和Δ5延长酶基因)或ARA(例如通过下调任何PKS基因和/或上调Δ12去饱和酶基因)的产生。
用包含博来霉素抗性转基因的载体转化8种ONC-T18菌株的培养物并且与阴性对照亲本菌株(野生型；T18A30)比较。在与实施例9中所描述的条件相同的条件下使细胞生长，并且收获生物质并且将其冷冻干燥。如上所述来进行FAME提取和GC分析。
我们发现当在含有35g/L人工海盐的ONC-T18-GM0中生长时，经过转化的菌株的脂肪酸分布(即例如针对DHA、EPA、ARA的脂肪酸提取物的组成)与它们的亲本菌株极为类似。八种经过转化的菌株中有四种产生比它们的亲本菌株多的总脂质，从而进一步证实了转化过程本身和转基因的存在和/或表达并不会显著地影响这些菌株中的脂肪酸分布，也没有干扰可能涉及大多数衍生菌株的脂质代谢途径的基因。因此，看来在转化过程之后，菌株保持了亲本菌株的遗传完整性(图17A)。
转化破囊壶菌属菌株的能力为遗传修饰这些微生物和引导代谢途径提供了巨大的可能。显著地，当使经过转化的菌株在含有18g/L海盐的ONC-T18-GM0中生长时，两种菌株显示出C16脂肪酸产生水平都显著高于它们的亲本。这些结果在将这种菌株ONC-T18开发成短链脂肪酸生物燃料生产平台中是有用的。这些结果证实了在博来霉素抗性转化体的选择过程中，以相对高的频率在细胞中发生诱变。在菌株改良方案中可以使用这种高频率的诱变(图17B)。
产生高水平短链脂肪酸的菌株中总脂质与生物质的比率高于低水平产生菌株(图17C)；这种更高的比率可以有益于下游的油提取和加工成本的降低。
在低海盐ONC-T18-GM0(18g/L)中生长会增强所测试的大多数菌株的整体总脂质生产率(图17D)。
实施例14：ble转基因在破囊壶菌属种ONC-T18的经过转化的 菌株中的稳定性
本实施例确认了本文所描述的经过转化的破囊壶菌属种菌株中的转基因稳定性。
转基因稳定性对于在工业微生物菌株改良方案中进行基因工程化的某些应用来说是重要的，在所述工业微生物菌株改良方案中，将微生物用于药物或工业过程中并且其中产品的数量和品质是最重要的。我们因此对经过转化的ONC-T18菌株进行转基因稳定性评估测定。对于在以上所描述的生长速率测定，将每次转化的四种菌株的接种物以及它们的原种野生型菌株在不存在博来霉素的情况下点样于ONC-T18-GM0琼脂板上并且在25℃下孵育七天。(每次转化使用五种不同的质粒构建体中的一种进行，每种质粒构建体具有由不同启动子和终止子的组合驱动的各种博来霉素抗性基因表达盒)。然后，使用相同的方法，将菌株转移到新的新鲜ONC-T18-GM0琼脂板上并且在25℃下孵育7天；进行菌落传代6次。最后，将菌株转移回到不具有或具有浓度为每毫升培养基200μg/mL博来霉素的ONC-T18-GM0琼脂板上。
结果表明在六次菌落传代之后，所有菌株都可以在具有或不具有博来霉素的ONC-T18-GM0琼脂板上良好生长(图18)。然而，在具有浓度为每毫升培养基200μg/mL博来霉素的ONC-T18-GM0琼脂板上，仅经过转化的菌株生长良好，而野生型菌株都不能生长。
这些结果证实了在所研究的菌株中没有观察到转基因的丧失。此外，在野生型菌株中没有观察到抗性，从而表明这些性状没有发生自发突变并且不存在可检测出的污染。如本文中所描述使用PCR来进一步确认在六次菌落传代之后在经过转化的菌株中存在ble转基因。所有经过转化的菌株即使在6次菌落传代之后仍保留ble转基因。因此，ble转基因在经过转化的ONC-T18菌株中显示出稳定性。
实施例15：诱变剂的应用
本实施例描述了诱变剂博来霉素用于菌株改良破囊壶菌的应用。
将来自菌落角变区的接种物转移到新的新鲜板中并且开发成新的菌株。选择四种新的菌株1a、1b、3a以及3b用于进一步研究(结果示于表2中)。将这四种菌株和它们的野生型亲本菌株ONC-T18接种于10mLONC-T18-GM0液体培养基中。使培养物在设定在250rpm的振荡孵育箱中在25℃下生长3天直到OD660大于2为止。然后，分别将包括野生型菌株的每种菌株的接种物(OD660＝6)接种于250mL烧瓶中的50mLONC-T18-GM0培养基中。以下所用的实验条件和程序与实施例14测定II中相同。
表14：破囊壶菌属种ONC-T18的四种所选择的菌株和它们的野生型亲本菌株的生物质、总脂质以及DHA生产率
实验结果表明四种所选择的菌株中有三种与它们的野生型亲本菌株相比产生显著更少的生物质、总脂质以及DHA(表6)。然而，菌株3a比它的野生型菌株产生更多的生物质、更多的脂质和DHA。菌株3a的高DHA生产率不仅由于它的高生物质生产率，而且还由于高DHA与生物质的比率。这个结果表明所发现的诱变剂可以被用来改良微生物菌株的适应性(例如像使用更便宜的碳源的能力，所述碳源如废物流、甘油、淀粉、纤维素以及半纤维素)、产品的品质和数量(如PUFA的ARA、DHA和/或EPA生产率)以及有利于生物燃料应用的脂肪酸和/或脂质分布。
可以通过任何各种手段从产生菌株和/或培养基组分中分离所产生的物质。例如通过采用改变脂肪酸分泌和/或使细胞壁变薄弱的一个或多个步骤来促进对所产生的物质进行提取。
实施例16：破囊壶菌属种的新型菌株
本实施例描述了具有高脂质和DHA生产率水平的破囊壶菌属种的新型菌株的发现。
将ONC-T18单细胞展布在含有ONC-T18-GM0培养基和50μg/mL博来霉素的琼脂板上。在接种后10天至15天，目测筛选菌落。随机分离没有明显形态变化的大菌落并且使其开发成新的菌株。比较新菌株的生物质、总脂质以及DHA生产率。最初发现一种菌株ONC-T18/35/Z50能够产生显著更多的生物质、总脂质以及DHA，这已经使用实施例5测定II中所描述的优化的发酵条件、方法以及程序加以反复确认。在使用含有35g/L海盐的ONC-T18-GM0培养基的二阶段发酵测定中，新的菌株ONC-T18/35/Z50比它的亲本菌株ONC-T18多产生5％的生物质、多产生7％的总脂质以及多产生14％的DHA。使用相同但含有18g/L海盐的培养基，新的菌株ONC-T18/35/Z50比它的亲本菌株ONC-T18多产生约10％的生物质、多产生20％的总脂质以及多产生36％的DHA。此外，在高水平DHA产生的新菌株ONC-T18/35/Z50中的DHA和总脂质与生物质的比率高于它的亲本菌株，从而证实了新菌株具有更稳固的将碳源(如葡萄糖)转化成脂质和DHA的能力。这种新型菌株不仅可用于改良产率，而且还可用于降低用于从微藻类生产生物脂质和PUFA(如DHA)的发酵和下游加工成本。
实施例17：破囊壶菌属ONC-T18Δ12去饱和酶在酵母中的表达
如实施例4中所描述，将由全长Δ12去饱和酶组成的克隆pYΔ12desat克隆到pYES2(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中。将pYΔ12desat转化到感受态隐球酵母INVSc1中。使用S.c.EasyComp转化试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)根据制造商所指定的条件进行酵母转化。在缺乏尿嘧啶的培养基(SC-Ura)上对于尿嘧啶营养缺陷选择转化体。为了检测这些克隆的特定去饱和酶活性，在有益于脂肪酸生物合成的条件下培养转化体。阴性对照菌株为含有未被改变的pYES2载体的INVSc1，同时地使阴性对照菌株生长。剧烈搅动培养物(150rpm)并使其在30℃下生长96小时。使细胞沉淀并且用100mM磷酸盐缓冲液pH7.0洗涤，将细胞沉淀物冷冻干燥。然后提取脂质并且衍化成脂肪酸甲酯(FAME)用于气相色谱法分析(GC)。使用100mg经过冷冻干燥的细胞通过C19:0作为内标物，添加酯基转移反应混合物(甲醇:盐酸:氯仿，10:1:1)，混合并且在90℃下加热2小时，然后在室温下冷却来完成酯基转移和提取。通过添加1ml水和2ml己烷:氯仿(4:1)来提取FAME，并且允许有机相和水相分离。提取有机层并且用0.5g无水硫酸钠处理以除去颗粒和残余的水。在氩气流下蒸发有机溶剂。将FAME重新悬浮于异辛烷中并且通过GC-FID分析。D12去饱和酶过表达突变体的FAME分布与对照菌株FAME分布的比较证实了亚油酸累积增加和油酸含量减少。
为了研究Δ12去饱和酶的底物特异性，将通过质粒pYΔ12desat转化以表达Δ12去饱和酶基因的酵母细胞与用空载体转化的并且因此不含有实验的Δ12去饱和酶的野生型酵母对照进行比较。使用它们对应的FAME通过GC分析这些转化体的脂肪酸组合物。在Δ12去饱和酶转化体的GC谱中发现对应于C18:29,12甲酯标准品的峰，但在模拟转化体的GC谱中没有发现。基于离子片段化谱，从Δ12去饱和酶转化体新产生的峰的GC-MS分析随后确认了对应于C18:29,12的峰确实是亚油酸，从而表明在经过Δ12去饱和酶转化的菌株中内源油酸被转变为亚油酸。1％-50％之间的油酸被转变为亚油酸。这个结果证实了ONC-T18来源的Δ12去饱和酶为12-脂肪酸去饱和酶。随后的分析证实了当在外部将脂肪酸添加至培养基时，Δ12去饱和酶不能将双键引入到肉豆蔻脑酸(14:19)、棕榈烯酸(16:19)、十七碳烯酸(17:110)、反油酸(反式18:19)、亚麻酸(C18:36,9,12)、二高-γ-亚麻酸(C20:38,11,14)、花生四烯酸(C20:45,8,11,14)或二十二碳四烯酸(C22:47,10,13,16)中。合起来看，这些数据进一步证实了经过鉴定的Δ12去饱和酶编码12-脂肪酸去饱和酶。
实施例18：破囊壶菌属ONC-T18Δ12去饱和酶在ONC-T18中 的异源表达
为了组成型过表达，将分离的ONC-T18的Δ12去饱和酶(SEQIDNO:70)克隆到如实施例4.9中所描述的p341PZ5pEx载体中，从而产生载体p341PZ5pD12Ex。如上在实施例7中所描述将异源过表达载体转化到ONC-T18中。然后可以如上评估转化体的PUFA产生分布并且与阴性对照(空载体转化体)比较。通过定量实时PCR来确认PUFA生物合成基因的复制数目和表达水平的变化。
本实施例描述了在各种经过转化的菌株中的PUFA生产率，并且证实了与野生型相比水平升高。本实施例尤其证实了ONC-T18Δ12去饱和酶的过表达使总脂肪酸含量增加，但使C12和C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的水平降低。可以实现总脂肪酸水平比野生型高至少1％-50％范围内(例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％…30％、31％、32％、…41％、42％、43％等)。基于这些研究结果，本领域技术人员将了解，可以实现进一步升高(例如，升高至比野生型高1％-1000％范围内的水平，例如，比野生型高约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％或更多的水平)，尤其在Δ12去饱和酶水平的操纵与理想的培养条件和/或其他PUFA生物合成基因的共操纵组合时。与野生型相比，可以使C12和C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸降低近似1％至50％(例如约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％等)的水平。
本实施例进一步证实了实现指定的脂肪酸含量的PUFA产生分布。Δ12去饱和酶的过表达使ARA、EPA和/或DHA水平相对于对照有所增加。本实施例进一步证实了实现约1:8至约1:2范围内的DHA:生物质比率，比在野生型菌株下通常所观察到的DHA:生物质比率高至少约40％。
实施例19：ONC-T18内的Δ12去饱和酶的缺失
为了进一步证实ONC-T18的Δ12去饱和酶蛋白功能和它缺失的影响，将这个编码区截短并且通过使用质粒pT7-ΔΔ12desat将其置换。这个质粒含有紧接Δ12去饱和酶ORF上游的5’的1000个碱基和对应于Δ12去饱和酶ORF的一部分并且进行到3’UTR中的具有3’序列同源性的1000个碱基对。这提供了与Δ12去饱和酶基因座处的ONC-T18基因组的基本同源，从而允许通过同源重组插入Ble-SV40盒。通过同源重组的插入将博来霉素抗性基因和SV40终止子放置到Δ12去饱和酶ORF中并且在具有Δ12去饱和酶起始密码子(ATG)的框中。因此Ble表达是在Δ12去饱和酶启动子的控制下并且SV40终止子阻止Δ12去饱和酶基因的转录。此外，Ble-SV40构建体的插入产生对Δ12去饱和酶ORF的87个碱基对的5’截断并且还将移码突变引入到ORF中。因此，通过同源重组将pT7-ΔΔ12去饱和酶构建体插入到Δ12去饱和酶基因座中消除了天然Δ12去饱和酶的表达。准备感受态ONC-T18细胞并且准备对其转化，并且如实施例7的材料和方法部分中所描述的那样进行。分别在具有18g/L和35g/L盐的GMO-琼脂板上进行选择。由于Δ12去饱和酶启动子对Ble表达和随后的博来霉素抗性的不明影响，在20-2000μg/L下使用博来霉素补充琼脂板来进行选择。在25℃接种7天之后，挑选克隆，在含有博来霉素的GMO琼脂板上复制，并且用来接种10mL的GMO肉汤培养基。将培养物在25℃、150rpm下孵育3天，通过离心收获并且使用MoBioDNA提取试剂盒按照制造商的说明书来提取基因组DNA。为了确认Δ12去饱和酶内存在Ble-SV40构建体，采用基因组基因座PCR与侧接插入位点的引物。为了这个目的设计并采用了PCR引物5'侧翼区F–CCTCCACATGTCTCACAAGACCACCG(SEQIDNO:91)和3'侧翼区R–GCAAGCAATGCTCGATTTCCTACC(SEQIDNO:92)。在野生型菌株中，扩增产生了1587个碱基对的DNA片段；而在其中缺失D12去饱和酶ORF的突变体菌株中，产生了2185个碱基对的PCR产物。阳性菌株被标记为ONC-T18-ΔΔ12去饱和酶。
使用它们的FAME通过GC-MS分析野生型和ΔΔ12去饱和酶ONC-T18菌株中的脂肪酸的组合物。与野生型对比，ONC-T18-ΔΔ12去饱和酶突变体不具有亚油酸(C18:2Δ9,12)(Δ12去饱和酶的主要产物)；反而它们累积大量的OA(C18:1Δ9)(Δ12去饱和酶的主要底物)。重要的是，在标准延长/去饱和途径中亚油酸的下游衍生物也在ONC-T18-ΔΔ12去饱和酶突变体中大幅度地减少，除了DHA。相对于野生型菌株，DHA实际上在ONC-T18-ΔΔ12去饱和酶突变体中增加了近似5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或更多。相对于野生型，这使细胞的总脂肪酸含量内的DHA增加了近似2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。
此外，C17:1Δ9和C19:1Δ9含量也在ONC-T18-ΔΔ12去饱和酶突变体中增加，从而表明了这些奇数链的脂肪酸可能是Δ12去饱和酶的底物。在标准途径中OA的累积和LA以及它的下游PUFA的减少不仅在ONC-T18-ΔΔ12去饱和酶突变体的总脂肪酸级分中观察到，而且在ONC-T18-ΔΔ12去饱和酶突变体的每个脂质种类(即中性脂质、磷脂和糖脂)中观察到。在所采用的实验条件下，尽管在总脂肪酸和复杂脂质级分中脂肪酸分布产生显著变化，但是在野生型菌株与ONC-T18-ΔΔ12去饱和酶破坏突变体之间的细胞生长中没有观察到区别，在总脂肪酸中也没有观察到区别。
实施例20：应用ONC-T18Δ12去饱和酶基因启动子以驱动Δ5 去饱和酶基因表达
如上在实施例7中所描述，组合以上所描述的异源Δ12去饱和酶启动子和Δ5去饱和酶基因以用于在ONC-T18转化之后异源表达Δ5去饱和酶基因。简单来说，使用PCR引物5’Δ12FlankF：GGATCAAAGTCATACTATGCGTACACG(SEQIDNO:93)和5’Δ12FlankR：ATCTATGTTAACCGAATGCAATTGCGTCCGAGAGACCTAAAGAATCAAGTTCG(SEQIDNO:94)，通过分离和扩增以及3’延伸Δ12去饱和酶5’侧翼序列来创建质粒pPΔ12-Δ5Desat-Δ12UTR-Zeo，该质粒涵盖推定的启动子区。5’Δ12FlankR引物延伸启动子序列并且将独特的MfeI限制性内切酶位点引入到产生的PCR片段中。PCR产生845个碱基对的DNA片段。以类似的方式通过用引物3’Δ12FlankF：TATCATCAATTGATGTAGGTTAACGCCATTTCTAGCTCGAGCTGC(SEQIDNO:95)和3’Δ12FlankR：ATGTGCCAATTTGGTACCGTGAATACAGTCG(SEQIDNO:96)的PCR来实现通过PCR在5’端处分离、扩增以及延伸Δ12去饱和酶3’UTR序列。PCR扩增3’Δ12去饱和酶DNA片段产生了165个碱基对的产物。引物3’Δ12FlankR将独特的MfeI限制性内切酶位点引入到3’Δ12去饱和酶PCR产物的5’端。通过沉淀纯化PCR产物，使用限制性内切酶MfeI进行消化并且进行凝胶纯化。然后在过夜的连接反应中采用经过消化的DNA片段。在20μl反应体积中，使用各为200ng的DNA片段、10U的T4DNA连接酶以及4μl的5xT4DNA连接酶缓冲液进行连接。在16℃下进行连接。通过琼脂糖凝胶电泳基于与尺寸标准物相比的迁移距离来确认5’和3’Δ12去饱和酶DNA片段的连接，并且使用Qiagen微量样品凝胶提取试剂盒按照制造商的说明书从琼脂糖凝胶中提取所希望的产物。随后通过添加2UTaqDNA聚合酶、2μl10XPCR缓冲液、0.5μl10mMdATP、0.4μl50mM氯化镁以及无水核酸酶至20μl对DNA产物进行3’腺苷酸。在68℃下完成3’腺苷酰作用持续10分钟。然后通过标准方案将这个反应的DNA产物克隆到质粒pT7-Blue3中，从而产生质粒pT7-5-3Δ12desat。
通过PCR使用引物Δ5desatF：ATGGGCAAGGGAAGCGAGGG(SEQIDNO:97)和Δ5desatR：CTAGTCTTGCTTCTTGGCGTC(SEQIDNO:98)来扩增Δ5去饱和酶。PCR产生具有SEQID:72的尺寸和序列的产物。用限制性内切酶HpaI对质粒pT7-5-3Δ12deat进行消化并且对其去磷酸化。随后在过夜的连接反应中采用经过去磷酸化的和线性的质粒pT7-5-3Δ12desat，同时Δ5去饱和酶PCR产物的反应条件和先前所描述的那些条件一样，除了所采用的载体与插入物的比率为6:1。用限制性内切酶HpaI进行消化并且连接所描述的Δ5去饱和酶PCR产物为Δ12去饱和酶启动子在核苷酸水平上保留精确的间隔。因此，没有另外的核苷酸或多余的序列被并入到在Δ12去饱和酶启动子与Δ5去饱和酶基因之间的最终构建体中。将连接产物转化到大肠杆菌中。通过标准PCR和消化方法，对于所希望的构建体筛选产生的文库。对具有连接到质粒pT7-5-3Δ12desat的Δ5去饱和酶ORF的质粒进行测序以确认保真度并且被标记为pPΔ12-Δ5Desat-Δ12UTR。如先前所描述，使用各自独特的限制性位点将质粒pPΔ12-Δ5Desat-Δ12UTR的表达盒从这个载体中移除并且将其连接到质粒pD4DPZ1中，这允许为了对博来霉素具有抗性而进行的转化和选择。所产生的质粒被标记为pPΔ12-Δ5Desat-Δ12UTR-Zeo。
在将质粒pPΔ12-Δ5Desat-Δ12UTR-Zeo转化到ONC-T18中之后，通过先前所描述的引物的适当组合使用PCR来确认转基因的存在。然后可以如上评估转化体的PUFA产生分布并且与阴性对照(空载体转化体)比较。通过定量实时PCR来确认PUFA生物合成基因表达的变化。
Δ5去饱和酶催化ARA和EPA合成中的最终步骤。应用Δ12去饱和酶启动子以驱动Δ5去饱和酶基因的表达显著增加了Δ5去饱和酶蛋白的产生；在指数生长过程中增加了近似20倍并且在脂肪酸生物合成中增加了近似40-100倍。如果脂肪酸前体是可利用的，那么过表达的Δ5去饱和酶蛋白通过延长/去饱和途径大幅度地影响ARA和/或EPA生物合成。
实施例21：应用ONC-T18Δ5去饱和酶基因启动子以驱动PKSA 基因簇
PKSA基因簇负责ONC-T18中的DHA产生。PKSA序列和它的启动子区的一部分示于以下表15中：
表15：PKSA序列(SEQIDNO:99)
在指数生长过程中，可操作地连接控制这个基因簇至Δ5去饱和酶启动子使PKS蛋白复合物的表达从1189个单元减少至71个单元，并且在脂肪酸产生过程中从5102个单元减少至62个单元。为了实现这个目的，使用引物XhoI-PPKSAF：ATACCGTGCGGCACGACGGTCCGTGAGT(SEQIDNO:100)和PPKSA-NcoI：TATGCCGTCGAGGTTAAAGGTGTTGGTGCAG(SEQIDNO:101)通过PCR来分离和扩增PKSA的5’侧翼序列。限制性内切酶基序为斜体和下划线部分。使用限制性内切酶XhoI和NcoI消化所产生的PCR产物。使用限制性内切酶XhoI和NcoI类似地消化质粒pD4DPZ1。如先前所描述，凝胶提取两个DNA片段并且将其在过夜的连接中组合。质粒pD4DPZ1的消化引起Δ4去饱和酶启动子序列移除，而连接引起PKSA5’侧翼序列插入以取代Δ4去饱和酶。这提供了与ONC-T18内的PKSA基因的5’序列具有同源性的541个碱基对，从而产生质粒pPKSA-PZ1。通过PCR使用引物EcoRI-Δ5desatF：ATAGATATGTATTTACGTGATCAAC(SEQIDNO:102)和Δ5desat-PKSAR： (SEQIDNO:103)来扩增Δ5去饱和酶启动子序列(SEQID:71)。EcoRI位点在正向引物中以下划线标出并以斜体表示，而在反向引物中与随后的融合PCR同源的部分以粗体突出。PCR引起引入与PKSA基因的前24个碱基对同源的部分。使用引物PKSAF：ATGAACTGCGTCGTCGACGCCGCC(SEQIDNO:104)和PKSA-PstIR：TATGTTGTAGGCGCGGCGGAGGGCCTCCTCCT(SEQIDNO:105)通过PCR分离和扩增PKSA基因的前388个碱基对。PstI位点在反向引物中以斜体和下划线突出，而在正向引物中与随后的融合PCR同源的部分以粗体突出。通过标准方案沉淀DNA产物并且使用标准方案在随后的融合PCR中采用。用于这个融合PCR的模板DNA为各为100ng的Δ5去饱和酶启动子PCR产物和PKSA前388个碱基对PCR产物。所使用的引物为EcoRI-Δ5desatF和PKSA-PstIR。扩增之后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA并且使用QIAGEN微量样品凝胶提取试剂盒纯化基于尺寸的对应于Δ5去饱和酶启动子和PKSADNA片段的融合的DNA产物。用EcoRI和PstI过夜消化所得的DNA片段，并且将其连接到先前用EcoRI和PstI过夜消化的质粒pPPKS-PZ1中，并且对其凝胶纯化，以产生pPPKS-PZ1-PΔ5desatPKSA。因此在ONC-T18基因组内，质粒pPPKS-PZ1-PΔ5desatPKSA含有：博来霉素选择性标记，所述博来霉素选择性标记在正确整合之后从天然PKSA启动子表达；和Δ5启动子，所述Δ5启动子在正确整合之后将驱动PKSA的表达。仅正确的整合可以基于博来霉素选择实现选择。使用先前所描述的引物通过基因组DNA提取和PCR分析来确认正确的整合。
与野生型和阴性对照相比，PKS蛋白复合物表达的变化使产生的油的DHA组合物减少近似1％至50％或更多(例如约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％等)。破囊壶菌或破囊壶菌属基因启动子可以可操作地连接至分离的破囊壶菌或破囊壶菌属PUFA生物合成途径基因。PUFA生物合成基因启动子通过生长阶段、培养条件和底物可用性来激活。一般来说，每一个启动子和/或基因可以独立地起作用，从而允许使用标准分子生物学技术移除每一个或包括每一个；因此提供了优化用于产生特定PUFA或产生具有优化范围的组分的总脂肪酸的工程化的破囊壶菌或破囊壶菌属菌株。本公开因此提供了工程化的菌株，所述工程化的菌株产生含有小于25％、小于20％、小于15％、小于10％和小于5％的长链PUFA组分的油组合物。
等同性
本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验即能够确定本文所描述的具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围并不旨在限制于以上描述。替代性方法和材料以及另外的应用对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且旨在包括在以下权利要求书之内。
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Claims (109)

1.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及
(e)核酸分子，其具有与SEQIDNO:70的核酸序列至少90％相同的序列。
2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子被操作地连接至启动子。
3.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述启动子对于所述分离的核酸分子为异源的。
4.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核酸来源于微生物。
5.如权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。
6.如权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述微生物为ONC-T18。
7.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:72所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体编码具有Δ5去饱和酶活性的多肽，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及
(e)核酸分子，其具有与SEQIDNO:72的核酸序列至少90％相同的序列。
8.如权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子被操作地连接至启动子。
9.如权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述启动子对于所述分离的核酸分子为异源的。
10.如权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述核酸来源于微生物。
11.如权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所述微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。
12.如权利要求11所述的分离的核酸分子，其中所述微生物为ONC-T18。
13.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:69所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体调节Δ12去饱和酶的转录，以及
(c)核酸分子，其具有与SEQIDNO:69的核酸序列至少90％相同的序列。
14.如权利要求13所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子被操作地连接至核酸序列。
15.如权利要求14所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子被操作地连接至异源核酸序列。
16.如权利要求15所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子被操作地连接至编码酶多肽或酶多肽复合物的一部分的多核苷酸，所述酶多肽或酶多肽复合物的一部分具有选自由以下组成的组的活性：去饱和酶活性、延长酶活性、脂肪酸合酶活性和聚酮多不饱和脂肪酸合酶(PKS)活性。
17.如权利要求16所述的分离的核酸分子，其中所述活性为去饱和酶活性。
18.如权利要求17所述的分离的核酸分子，其中所述去饱和酶活性为Δ5去饱和酶活性。
19.如权利要求14所述的分离的核酸分子，其中所述核酸来源于微生物。
20.如权利要求19所述的分离的核酸分子，其中所述微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。
21.如权利要求20所述的分离的核酸分子，其中所述微生物为ONC-T18。
22.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:71所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体调节Δ5去饱和酶的所述转录，以及
(c)核酸分子，其具有与SEQIDNO:71的核酸序列至少90％相同的序列。
23.如权利要求22所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子被操作地连接至异源核酸序列。
24.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子被操作地连接至编码酶多肽或酶多肽复合物的一部分的多核苷酸，所述酶多肽或酶多肽复合物的一部分具有选自由以下组成的组的活性：去饱和酶活性、延长酶活性、脂肪酸合酶活性和聚酮多不饱和脂肪酸合酶(PKS)活性。
25.如权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述活性为去饱和酶活性。
26.如权利要求25所述的分离的核酸分子，其中所述去饱和酶活性为Δ12去饱和酶活性。
27.如权利要求22所述的分离的核酸分子，其中所述核酸来源于微生物。
28.如权利要求27所述的分离的核酸分子，其中所述微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。
29.如权利要求28所述的分离的核酸分子，其中所述微生物为ONC-T18。
30.一种包含氨基酸序列的多肽，所述多肽由根据权利要求1所述的分离的核酸序列编码。
31.一种包含氨基酸序列的多肽，所述多肽由根据权利要求7所述的分离的核酸序列编码。
32.一种载体，其包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子。
33.一种载体，其包含根据权利要求7所述的分离的核酸分子。
34.一种载体，其包含根据权利要求13所述的分离的核酸分子。
35.一种载体，其包含根据权利要求22所述的分离的核酸分子。
36.一种工程化的微生物，其中所述微生物表达选自由以下组成的组的异源核酸序列：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及
(e)核酸分子，其具有与SEQIDNO:70的所述核酸序列至少90％相同的序列。
37.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中所述微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。
38.如权利要求37所述的工程化的微生物，其中所述微生物为ONC-T18。
39.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中所述异源核酸序列被操作地连接至异源启动子。
40.如权利要求39所述的工程化的微生物，其中所述异源启动子与SEQIDNO:71至少90％相同。
41.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中所述异源启动子选自由以下组成的组：细菌启动子、酵母启动子、真核病毒启动子或从微藻类分离的启动子元件。
42.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中所述异源核酸序列被过表达。
43.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中通过表达载体将所述异源核酸序列引入到所述微生物中。
44.如权利要求43所述的工程化的微生物，其中将所述表达载体引入到具有至少一种另外的异源多核苷酸的所述微生物中，所述异源多核苷酸编码涉及多不饱和脂肪酸生物合成的酶多肽或酶多肽的一部分。
45.如权利要求44所述的工程化的微生物，其中所述至少一种另外的异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
46.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的含量，所述微生物的总脂肪含量增加至少10％。
47.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述微生物的总脂肪含量增加至少20％。
48.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述微生物的总脂肪含量增加至少50％。
49.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述微生物的总脂肪含量增加至少100％。
50.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的含量，所述异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的含量减少至少10％。
51.如权利要求37所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少20％。
52.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少50％。
53.如权利要求36所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少100％。
54.一种工程化的微生物，其中所述微生物表达至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸，所述多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸被操作地连接至选自由以下组成的组的异源启动子：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:69所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体调节Δ12去饱和酶的所述转录，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)核酸分子，其具有与SEQIDNO:69的所述核酸序列至少90％相同的序列。
55.如权利要求54所述的工程化的微生物，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸对于所述微生物为内源的。
56.如权利要求55所述的工程化的微生物，其中通过同源重组将所述至少一种内源多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸操作地连接至所述异源启动子。
57.如权利要求54所述的工程化的微生物，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸对于所述微生物为外源的。
58.如权利要求55或57所述的工程化的微生物，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
59.如权利要求58所述的工程化的微生物，其中所述工程化的微生物进一步过表达选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及
(e)核酸分子，其具有与SEQIDNO:70的所述核酸序列至少90％相同的序列。
60.一种用于产生多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：
提供一种工程化的破囊壶菌属细胞，其中所述工程化的破囊壶菌属细胞表达选自由以下组成的组的异源核酸分子：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及
(e)核酸分子，其具有与SEQIDNO:70的所述核酸序列至少90％相同的序列，
其中当在可比条件下培养所述工程化的细胞和参考细胞时，与参考细胞相比，所述异源表达改变所述工程化的细胞对一种或多种多不饱和脂肪酸的产生；并且
在足以实现所述一种或多种多不饱和脂肪酸的产生的条件下和时间内培养所述工程化的破囊壶菌属细胞。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述一种或多种多不饱和脂肪酸选自由以下组成的组：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸和/或亚麻酸。
62.如权利要求60所述的方法，其进一步包括表达至少一种异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
63.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少10％。
64.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少20％。
65.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少50％。
66.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少100％。
67.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少10％。
68.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少20％。
69.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少50％。
70.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少100％。
71.如权利要求60所述的方法，其中所述异源核酸分子被过表达。
72.一种用于产生多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：
提供一种工程化的破囊壶菌属细胞，其中所述工程化的破囊壶菌属细胞表达至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸，所述多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸被操作地连接至选自由以下组成的组的异源启动子：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:69所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体调节Δ12去饱和酶的转录，
(c)核酸分子，其具有与SEQIDNO:69的所述核酸序列至少90％相同的序列，
其中当在可比条件下培养所述工程化的细胞和参考细胞时，与参考细胞相比，所述异源启动子与至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸的所述操作地连接改变所述工程化的细胞对一种或多种多不饱和脂肪酸的产生；并且
在足以实现所述一种或多种多不饱和脂肪酸的产生的条件下和时间内培养所述工程化的破囊壶菌属细胞。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述一种或多种多不饱和脂肪酸选自由以下组成的组：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸和/或亚麻酸。
74.如权利要求72所述的方法，其进一步包括表达至少一种异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
75.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少10％。
76.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少20％。
77.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少50％。
78.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少100％。
79.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少10％。
80.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少20％。
81.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少50％。
82.如权利要求72-74中任一项所述的方法，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸分子的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少100％。
83.如权利要求74所述的方法，其中编码酶多肽或酶多肽复合物的一部分的所述至少一种异源多核苷酸被过表达。
84.如权利要求72所述的方法，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
85.一种由权利要求60或72所述的方法产生的多不饱和脂肪酸组合物。
86.一种工程化的微生物，其中所述微生物表达选自由以下组成的组的异源核酸序列：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:72所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体编码具有Δ5去饱和酶活性的多肽，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及
(e)核酸分子，其具有与SEQIDNO:72的所述核酸序列至少90％相同的序列。
87.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中所述微生物选自由以下组成的组：裂殖壶菌属、椭圆壶菌属、橙黄壶菌属和破囊壶菌属。
88.如权利要求87所述的工程化的微生物，其中所述微生物为ONC-T18。
89.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中所述异源核酸序列被操作地连接至异源启动子。
90.如权利要求89所述的工程化的微生物，其中所述异源启动子与SEQIDNO:71至少90％相同。
91.如权利要求89所述的工程化的微生物，其中所述异源启动子选自由以下组成的组：细菌启动子、酵母启动子、真核病毒启动子或从微藻类分离的启动子元件。
92.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中所述异源核酸序列被过表达。
93.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中通过表达载体将所述异源核酸序列引入到所述细胞中。
94.如权利要求93所述的工程化的微生物，其中将所述表达载体引入到具有至少一种另外的异源多核苷酸的所述微生物中，所述异源多核苷酸编码涉及多不饱和脂肪酸生物合成的酶多肽或酶多肽的一部分。
95.如权利要求94所述的工程化的微生物，其中所述至少一种另外的异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
96.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少10％。
97.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少20％。
98.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少50％。
99.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列存在下的所述含量，所述细胞的总脂肪含量增加至少100％。
100.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少10％。
101.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少20％。
102.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少50％。
103.如权利要求86所述的工程化的微生物，其中相对于无所述异源核酸序列的表达存在下的所述脂肪酸的所述含量，所述异源核酸序列的表达使C12-C16饱和的和单一不饱和的脂肪酸的所述含量减少至少100％。
104.一种工程化的微生物，其中所述微生物表达至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸，所述多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸被操作地连接至选自由以下组成的组的异源启动子：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:71所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体调节Δ5去饱和酶的所述转录，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)核酸分子，其具有与SEQIDNO:71的所述核酸序列至少90％相同的序列。
105.如权利要求104所述的工程化的微生物，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸对于所述微生物为内源的。
106.如权利要求105所述的工程化的微生物，其中通过同源重组将所述至少一种内源多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸操作地连接至所述异源启动子。
107.如权利要求104所述的工程化的微生物，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸对于所述微生物为外源的。
108.如权利要求105或107所述的工程化的微生物，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸生物合成多核苷酸编码选自由以下组成的组的酶多肽或酶多肽复合物的一部分：脂肪酸合酶(FAS)、Δ5延长酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和聚酮PUFA合酶(PKS)。
109.如权利要求108所述的工程化的微生物，其中所述工程化的微生物进一步过表达选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)核酸分子，其在严格条件下与由SEQIDNO:70所述的核苷酸序列组成的分子杂交，
(b)(a)的所述核酸的补体，所述补体编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽，
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并而在密码子序列中与(a)或(b)的所述核酸分子不同，以及
(d)(a)或(b)或(c)的补体；以及
(e)核酸分子，其具有与SEQIDNO:70的所述核酸序列至少90％相同的序列。
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