CN114231525A - 一种基于磁珠法的高通量植物组织基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁珠法的高通量植物组织基因组DNA提取方法，属于分子生物学领域。本发明具体公开一种DNA提取液，包括：(a)所述DNA提取液包括如下组分：NaCl，Tris‑HCl，EDTA，CTAB，山梨醇和PVP；(b)所述DNA提取液包括如下组分：NaCl，Tris‑HCl，EDTA，SDS，山梨醇和PVP。本发明基于磁珠法，利用上述DNA提取液结合移液工作台，克服了传统方法耗时费力、手工操作步骤多、规模化标准化程度低、有机试剂对人体有害且污染环境等缺陷，DNA提取效率提高了10倍，且制备的DNA质量稳定可靠，能够满足规模化分子标记辅助育种对高通量核酸提取的需求。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种基于磁珠法的高通量植物组织基因组DNA提取方法。
背景技术
近年来，随着分子生物学的不断发展，棉花基因组测序、品种鉴定及群体遗传分析等研究也被广泛应用和推广。但这些技术的实现往往需要基于高纯度和高完整度的全基因组DNA，对全基因组DNA提取的通量提出了更高要求。
目前，较为成熟的DNA提取方法包括SDS法、CTAB法和试剂盒法，SDS法和CTAB法使用成本低廉，提取得到的DNA能够满足大多数分子实验的使用要求，但是其操作过程过于繁琐、耗时费力，且使用多种有毒有害的试剂，不能规模化使用。试剂盒则存在价格昂贵，使用效果因批次而异等问题，也难以供应高通量的分子生物实验使用需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于磁珠法的高通量植物组织基因组DNA提取方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法服了传统方法耗时费力、手工操作步骤多、规模化标准化程度低、有机试剂对人体有害且污染环境等缺陷，并且DNA提取效率提高了10倍，所制备的DNA质量稳定可靠，能够满足规模化分子标记辅助育种对高通量核酸提取的需求。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种DNA提取液，包括如下(a)或(b)所示配方：
(a)所述DNA提取液包括如下组分：NaCl，Tris-HCl，EDTA，CTAB，山梨醇和PVP；
(b)所述DNA提取液包括如下组分：NaCl，Tris-HCl，EDTA，SDS，山梨醇和PVP。
优选的是，所所述DNA提取液包括如下组分：1.20-1.65mol/L NaCl，0.05-0.12mol/L Tris-HCl，0.01-0.03mol/L EDTA，15.00-23.00g CTAB，3.00-6.50g山梨醇和5.00-13.00g PVP。
优选的是，所述DNA提取液包括如下组分：0.50-0.85mol/L NaCl，0.02-0.07mol/LTris-HCl，0.005-0.015mol/L EDTA，8.00-15.00gSDS，3.00-6.50g山梨醇和8.00-12.00gPVP。
优选的是，还包括磁珠。
本发明还提供一种基于磁珠法的高通量植物组织基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)将植物组织和钢珠混合后再于超低温环境冷冻处理，之后再将植物组织进行研磨；
(2)研磨后的植物组织，与权利要求1所述的DNA提取液混匀后，水浴加热；
(3)水浴加热处理后的样品进行离心，再加入蛋白溶液，震荡、离心；
(4)离心后的样品，放于移液工作站提取基因组DNA。
优选的是，所述植物组织为棉花叶片或者种子。
优选的是，步骤(1)中，所述超低温环境为-80℃；所述研磨条件为：于1500rpm研磨30s；
优选的是，所述棉花叶片与(a)所示的DNA提取液按照0.10g：(400-500)μL混合；
所述棉花种子与(b)所示的DNA提取液按照1粒：400-500μL混合；
所述水浴加热条件为：65℃水浴加热30min。
优选的是，所述蛋白溶液的添加量按照所述DNA提取液体积的一半添加；
加入所述蛋白溶液之前，于4500rpm离心1min；加入所述蛋白溶液后，先于1000rpm震荡10s后再于4500rpm离心10min，最后再于4500rpm离心1min。
优选的是，所述上清液在加入所述移液工作站时，每200μL上清液还需要加入10μL磁珠。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的高通量基因组DNA提取方法一次最多可提取384个样品，DNA提取效率相比传统方法提高了10倍，所用试剂安全性较高，成本低廉，平均每个样本0.80-1.00元；整个方法流程操作较为简单，通过对移液工作站的利用，极大程度上的减少了操作人员熟练度和技术水平所导致提取DNA的质量影响，同时也减少了人工的使用成本，利用本方法，一个人2h可完成384个样品的提取。本发明克服了传统核酸提取方法耗时费力、手工操作步骤多、规模化标准化程度低、有机试剂对人体有害且污染环境等缺陷，DNA提取效率相比传统方法提高了10倍，且制备的DNA质量稳定可靠。本发明提供的提取方法可广泛应用于棉花常规分子生物学实验，尤其适用于规模化分子标记辅助育种对高通量核酸提取的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为KASP分型结果图；
图2为毛细管电泳结果图；
图3为本发明上述实施例中提取得到的棉花种子基因组DNA和传统方法提取得到的棉花种子基因组DNA电泳图谱，marker为15kbp，1-4泳道为本发明提取的基因组DNA，5-8为传统方式提取得到的基因组DNA。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1一种基于磁珠法的植物高通量基因组DNA提取方法的建立
(1)将待提取的植物叶片取约0.10g(种子则为一粒)，置于2.00mL96深孔板并放入直径0.4cm的钢珠。将所述96深孔板置于-80℃超低温冰箱中冷冻处理一小时。
(2)将96孔板放置在高通量研磨机中频率1500rpm研磨30s(种子使用该条件研磨两次)。
(3)向深孔板中加入2×CTAB提取液400μL混匀，并于65℃水浴30min；所述2×CTAB提取液配方为：1.40mol/L NaCl，0.10mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA，20.00g CTAB，5.00g山梨醇，10.00g PVP。(种子使用SDS提取液，所述SDS提取液配方为：0.70mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl，0.01mol/L EDTA，10.00g SDS，5.00g山梨醇，10.00g PVP)。
(4)将水浴后的样品放入离心机，4500rpm离心1min。
(5)向深孔板中加入去蛋白溶液200μL，设置震荡器频率1000rpm震荡10s后4500rpm离心10min；所述去蛋白溶液配方为：3mol/LKOAc，5mol/L CH3COOH。
(6)将上述深孔板放入离心机，4500rpm离心1min。
(7)离心后的深孔板放于移液工作站打开核酸提取程序，根据程序显示依次放置磁力架、无水乙醇、70％乙醇、磁珠、ddH2O、96深孔板和PCR板等试剂和耗材于相应位置。
(8)开始运行程序，等待运行完毕后取出DNA溶液，放于4℃备用。
所述步骤(7)中，移液工作站为Biomek i7 Automated Workstation，核酸提取程序运行软件为Biomek Software Version 5.1，程序分为Start、工具设置、结合磁珠、70％乙醇清洗1、70％乙醇清洗2、干燥、洗脱磁珠和转移工作液共8个模块。
1Start：
设置“Variable Name”样品体积，对应“Value”200；“Variable Name”SourceSampleVol对应“Value”620。
2工具设置：
设置BC230耗材于TL2-TL10板位、P23板位；设置AgilentReservoir耗材于P1、P2、P9板位；设置耗材96PCR板于P3-P5和P14板位，依次命名为DNA1-DNA4；设置耗材磁力架于P6、P10、P15、P20板位；设置耗材96深孔板于P7、P8、P11、P12、P16、P17、P21、P22板位，依次命名为Reaction1-Reaction4、SamplePlate1-SamplePlate4；设置耗材ModularReservoir于P19板位。
3结合磁珠(Group)
3.1加入乙醇(Group)：加载枪头，向空的4个96深孔板依次加入200ul无水乙醇，卸载枪头，EndGroup。
3.2加入磁珠(Group)：加载枪头，吸取磁珠，向Reaction1-Reaction44个96深孔板每一排孔中加入10μL磁珠，将剩余磁珠打回ModularReservoir中，卸载枪头，EndGroup。
3.3加入上清液(Group)：加载枪头，从SamplePlate1-SamplePlate4依次吸取200μL上清液打入对应编号的Reaction1-Reaction4深孔板中，卸载枪头，EndGroup。
3.4震荡混匀(Group)：将装有乙醇-磁珠-上清液混合溶液的Reaction1-Reaction4四个深孔板依次放上振荡器组件震荡混匀后放于磁力架上静置，EndGroup。
3.5吸弃上清(Group)：加载枪头，依次吸弃Reaction1-Reaction4四个深孔板400μL上清，卸载枪头，EndGroup。
3.6移动深孔板(Group)：将Reaction1-Reaction4四个深孔板从磁力架上取下放回初始板位(P7、P11、P16、P21)，EndGroup。
4 70％乙醇清洗1(Group)：
4.1加入70％乙醇(Group)：加载枪头，向Reaction1-Reaction4四个深孔板依次加入500μL 70％乙醇，卸载枪头，EndGroup。
4.2震荡混匀(Group)：将Reaction1-Reaction4四个深孔板依次放上振荡器组件震荡混匀后放于磁力架上静置，卸载枪头，EndGroup。
4.3吸弃上清(Group)：加载枪头，依次吸弃Reaction1-Reaction4四个深孔板400μL上清，卸载枪头，EndGroup。
4.4移动深孔板(Group)：将Reaction1-Reaction4四个深孔板从磁力架上取下放回初始板位(P7、P11、P16、P21)，EndGroup。
5 70％乙醇清洗2(Group)：
5.1加入70％乙醇(Group)：加载枪头，向Reaction1-Reaction4四个深孔板依次加入500μL 70％乙醇，卸载枪头，EndGroup。
5.2震荡混匀(Group)：将Reaction1-Reaction4四个深孔板依次放上振荡器组件震荡混匀后放于磁力架上静置，卸载枪头，EndGroup。
5.3吸弃上清(Group)：加载枪头，依次吸弃Reaction1-Reaction4四个深孔板400μL上清，卸载枪头，EndGroup。干燥：暂停室温条件下风干20min。
6洗脱磁珠(Group)：
6.1移动深孔板(Group)：将Reaction1-Reaction4四个深孔板从磁力架上取下放回初始板位(P7、P11、P16、P21)，EndGroup。
6.2加入洗脱液(Group)：加载枪头，向Reaction1-Reaction4四个深孔板中依次加入100μL洗脱液，卸载枪头，EndGroup。
6.3震荡混匀(Group)：将Reaction1-Reaction4四个深孔板依次放上振荡器组件震荡混匀后放于磁力架上静置，卸载枪头，EndGroup。
7转移工作液(Group)：加载枪头，从Reaction1-Reaction4深孔板依次吸取80μL上清液打入对应编号的PCR板中，EndGroup。
利用上述实施例1建立的提取植物组织的方法，下面以棉花为例具体实施以对上述技术方案进一步说明。
实施例2
将待提取的棉花叶片取约0.10g，置于2mL 96深孔板并放入直径0.40cm的钢珠。将96深孔板置于-80℃超低温冰箱中冷冻处理一小时后取出，在高通量研磨机中研磨，设置频率1500r研磨30s。
向深孔板中加入2×CTAB提取液400μL混匀，并于65℃水浴加热30min；将水浴后的样品放入离心机，4500rpm离心1min。向深孔板中加入去蛋白溶液200μL，设置震荡器频率1000rpm震荡10s后4500rpm离心10min；将深孔板放入离心机，4500rpm离心1min。离心后的深孔板放于移液工作站打开核酸提取程序，根据程序显示依次放置磁力架、无水乙醇、70％乙醇、磁珠、ddH2O、2mL 96深孔板和PCR板等试剂和耗材于相应位置。点击程序“Run”开始运行程序，等待运行完毕后取出DNA溶液，放于4℃备用。
利用本发明提取的DNA进行PCR扩增与KASP检测，使用高灵敏度孔板检测仪进行结果读取。其中反应体系与引物cs18参照专利ZL2015108076501(基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记)。引物如下：
正向引物1：5’-GCCCGTAAATCAGTCATTGATCTCT-3’；
正向引物2：5’-GCCCGTAAATCAGTCATTGATCTCC-3’；
反向引物：5’-AAAGGCAATGTTGTGGTAGATGCTCTAT-3’。
反应程序：94℃15min；94℃20s，61℃—55℃60s(每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃20s，55℃60s，26个循环。
KASP检测结果表明，分型检测效果良好(图1)，样品可成功分型检出，表明本发明提取的棉花基因组DNA可适用于KASP检测。
实施例3
将待提取的棉花种子取一粒，置于2mL 96深孔板并放入直径0.40cm的钢珠。将96深孔板置于-80℃超低温冰箱中冷冻处理一小时后取出，在高通量研磨机中研磨，设置频率1500r研磨1min。
向深孔板中加入SDS提取液400μL混匀，并于65℃水浴加热30min；将水浴后的样品放入离心机，4500rpm离心1min。向深孔板中加入去蛋白溶液200μL，设置震荡器频率1000rpm震荡10s后4500rpm离心10min；将深孔板放入离心机，4500rpm离心1min。离心后的深孔板放于移液工作站打开核酸提取程序，根据程序显示依次放置磁力架、无水乙醇、70％乙醇、磁珠、ddH2O、2mL 96深孔板和PCR板等试剂和耗材于相应位置。开始运行程序，等待运行完毕后取出DNA溶液，放于4℃备用。取2μL DNA溶液为模板直接用于SSR检测实验。
利用本发明提取的DNA进行SSR毛细管电泳检测，ABI3130基因分析仪检测结果表明，峰型清晰尖锐(图2)，样品可成功分型检出，表明本发明提取的棉花基因组DNA可适用于SSR毛细管电泳检测。
反应体系：20μL反应液中包括10μL 2×Taq Plus Master Mix、0.4μmol/LSSR引物、80ng DNA模板。引物如下：
上游引物：5’-CCGGTTCAAGCCGACTATTCG-3’；
下游引物：5’-ACTCGTAACACCGTGCTGATTG-3’。
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共32个循环；72℃延伸7min。
对比例1
相对于传统DNA提取方法，本发明不使用对人体有害的试剂。对本发明上述实施例中提取得到的棉花种子基因组DNA进行电泳检测，1-4泳道为本发明提取得到的DNA，6-8泳道为传统方式提取得到的DNA。基于本发明2h可提取384个样品，提取效率远高于传统方式(2h可提取96个)，本发明提取的棉花基因组DNA浓度和完整性等质量与传统方法基本相当。
上述传统提取方法步骤如下：取棉花种子一粒剥壳，将种仁放入2ml试管中。向试管内加入0.4cm钢珠，在研磨机中使用频率1500rpm研磨60s。向试管加入800μLSDS提取液(SDS提取液配方为：0.70mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl，0.01mol/L EDTA，10.00g SDS，5.00g山梨醇，10.00gPVP)，水浴加热30min后取出，向离心管中加入400μL氯仿：异戊醇：酚(25:24:1)，轻轻混匀后离心10min。吸取上清后向其中加入400μL异丙醇，使DNA沉淀析出。使用剪口枪头吸出絮状沉淀，依次使用1000μL的70％乙醇和无水乙醇清洗沉淀，晾干后加入100μLddH2O备用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种DNA提取液，其特征在于，包括如下(a)或(b)所示配方：
(a)所述DNA提取液包括如下组分：NaCl，Tris-HCl，EDTA，CTAB，山梨醇和PVP；
(b)所述DNA提取液包括如下组分：NaCl，Tris-HCl，EDTA，SDS，山梨醇和PVP。
2.如权利要求1所述的DNA提取液，其特征在于，所述DNA提取液包括如下组分：1.20-1.65mol/L NaCl，0.05-0.12mol/L Tris-HCl，0.01-0.03mol/L EDTA，15.00-23.00g CTAB，3.00-6.50g山梨醇和5.00-13.00g PVP。
3.如权利要求1所述的DNA提取液，其特征在于，所述DNA提取液包括如下组分：0.50-0.85mol/L NaCl，0.02-0.07mol/L Tris-HCl，0.005-0.015mol/L EDTA，8.00-15.00gSDS，3.00-6.50g山梨醇和8.00-12.00g PVP。
4.如权利要求1所述的DNA提取液，其特征在于，还包括磁珠。
5.一种基于磁珠法的高通量植物组织基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将植物组织和钢珠混合后再于超低温环境冷冻处理，之后再将植物组织进行研磨；
(2)研磨后的植物组织，与权利要求1所述的DNA提取液混匀后，水浴加热；
(3)水浴加热处理后的样品进行离心，再加入蛋白溶液，震荡、离心；
(4)离心后的上清液，放于移液工作站提取基因组DNA。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物组织为棉花叶片或者种子。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超低温环境为-80℃；所述研磨条件为：于1500rpm研磨30s；
8.如权利要求6所述的方法，其特征在，所述棉花叶片与权利要求1中(a)所示的DNA提取液按照0.10g：(400-500)μL混合；
所述棉花种子与权利要求1中(b)所示的DNA提取液按照1粒：400-500μL混合；
所述水浴加热条件为：65℃水浴加热30min。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白溶液的添加量按照所述DNA提取液体积的一半添加；
加入所述蛋白溶液之前，于4500rpm离心1min；加入所述蛋白溶液后，先于1000rpm震荡10s后再于4500rpm离心10min，最后再于4500rpm离心1min。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上清液在加入所述移液工作站时，每200μL上清液还需要加入10μL磁珠。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN107326023A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-11-07 | 河南科技大学 | 一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法 |
| WO2021055605A1 (en) * | 2019-09-17 | 2021-03-25 | Beckman Coulter, Inc. | Automated reagent identification for fluid handling system |
| CN112779247A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-05-11 | 袁隆平农业高科技股份有限公司 | 植物组织基因组dna提取试剂盒及高通量提取方法 |
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2022
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107326023A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-11-07 | 河南科技大学 | 一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法 |
| WO2021055605A1 (en) * | 2019-09-17 | 2021-03-25 | Beckman Coulter, Inc. | Automated reagent identification for fluid handling system |
| CN112779247A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-05-11 | 袁隆平农业高科技股份有限公司 | 植物组织基因组dna提取试剂盒及高通量提取方法 |
| CN112941071A (zh) * | 2021-04-20 | 2021-06-11 | 中国水稻研究所 | 一种用于提取植物或植物加工品dna的试剂组及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 匡猛 等: "单粒棉花种子DNA 快速提取方法", 《分子植物育种》, vol. 8, no. 4, pages 829 * |
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