CN105368815A - 多糖多酚植物基因组的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种多糖多酚植物基因组的提取方法，步骤为：取植物材料研磨后加入核酸分离缓冲液和2-巯基乙醇，混匀后置水浴中；离心机中离心后弃上清；加入1×PBS溶液，研磨仪上震荡混匀，离心后弃上清；向沉淀中加入预热的3×CTAB裂解液并混匀，水浴裂解；加等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入NaCl和冰异丙醇，混匀，沉淀1～3小时；取出离心后，将沉淀用乙醇洗涤，风干后加TE溶解，即完成提取。本发明能有效去除多糖多酚，减少糖和酚类物质对核酸提取的影响，提高DNA的质量和浓度。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种应用于植物基因组提取的方法。
背景技术
基因组DNA的提取技术是遗传学与分子生物学研究中的基本技术。DNA提取是分子分析的重要步骤，在得到基于凝胶系统的高分辨率结果方面起着重要作用，高质量的DNA是获得准确试验结果的基础。
现有多种DNA提取方法，如CTAB法、高盐低pH法、SDS法、苯酚法和提取试剂盒的使用等。但是，对于多数叶厚汁多、含有大量多糖类和其他次生代谢产物的植物来说，采用常规的方法很难提取出高质量的DNA，因而需要改良常规的分离方法。
CTAB是一种去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，并能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心，可将CTAB--核酸复合物同蛋白质、部分多糖类物质分开。溶解于高盐溶液中的CTAB--核酸复合物，加入乙醇可使核酸沉淀，而CTAB则溶于乙醇。CTAB法是目前应用最广泛发展较成熟的方法，最大优点就是除去多糖。在CTAB法的基础上进行适当的改良，获得了高质量的DNA分子。细菌一般分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和真菌的基因组提取一直困扰着科研人员。目前提取微生物基因组的方法主要有酶解法、化学或者热裂解法、磁珠或超声波机械破壁，又或者是上述几种方法的结合。但这些方法提取出的基因组浓度很低，且大多污染严重，不能满足三代测序的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的多糖多酚植物DNA提取方法，从而对富含多糖多酚植物材料的基因组实现快速高效的获取。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种多糖多酚植物基因组的提取方法，包含下述步骤：(1)取待提取植物材料，研磨后加入核酸分离缓冲液和2-巯基乙醇，并使所述2-巯基乙醇的终浓度为1％～5％，震荡混匀后，置于75～95度水浴中5～30分钟；(2)从水浴中取出后，离心机中高速离心，弃掉上清液；(3)加入1×PBS溶液，研磨仪上震荡混匀，高速离心，弃上清；(4)向沉淀中加入500～1000ul预热3×CTAB裂解液并混匀，65度水浴裂解30～60分钟；(5)加等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；(6)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；(7)取上清，加入NaCl和冰异丙醇，上下颠倒混匀，在-20～-80度环境下沉淀1～3小时；(8)取出，离心后，将沉淀用乙醇洗涤，风干后加TE溶解，即得到所提取的基因组。
本发明的实施方式所提供的多糖多酚植物基因组的提取方法，其创新点在于：一方面，在核酸分离缓冲液中适当提高2-巯基乙醇的浓度，能有效的去除多酚以及代谢物质，能降低后续裂解多酚物质多提取的影响；另一方面，使用1xPBS缓冲液清洗并研磨分离后的细胞沉淀，能有效去除多糖，减少后续多糖对提取的影响；再一方面，增加CTAB的浓度至3％，能更有效的去除多糖。因而，本发明的实施方式所提供的多糖多酚植物基因组的提取方法，能有效去除多糖多酚，减少糖和酚类物质对核酸提取的影响，提高DNA的质量和浓度；且本发明的实施方式所提供的基因组提取方法耗时短，成本低廉，相较试剂盒，能节约成本，提高浓度，满足后续实验的需求。
优选地，本发明的实施方式所提供的多糖多酚植物基因组的提取方法中，步骤(1)中的核酸分离缓冲液中包含下述组分：200mMTris、250mMNacl、50mMEDTA和质量浓度为4％PVP，提高了核酸分离缓冲液中PVP的浓度，能有效地去除多酚以及代谢物质，能降低后续裂解多酚物质多提取的影响。
优选地地，本发明的实施方式所提供的多糖多酚植物基因组的提取方法中，步骤(1)中对待提取植物材料研磨之前，以液氮将所述待提取植物材料冻存。
优选地，本发明的实施方式所提供的多糖多酚植物基因组的提取方法中，步骤(1)中加入核酸分离缓冲液时，每100毫克待提取植物材料加入1～2毫升核酸分离缓冲液。
优选地，本发明的实施方式所提供的多糖多酚植物基因组的提取方法中，在进行步骤(4)之前，对步骤(3)重复2～3次。
优选地，本发明的实施方式所提供的多糖多酚植物基因组的提取方法中，步骤(5)中所述的酚/氯仿/异戊醇混合液中，按体积比计，酚：氯仿：异戊醇为25:24:1；步骤(6)中的氯仿/异戊醇混合液中，按体积比计，氯仿：异戊醇为24:1。上述提取试剂中，酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用；氯仿可加速有机相与液相的分层。在抽提DNA的过程中，为了混合均匀，通常进行剧烈震荡，此时会在混合液内产生大量气泡，而异戊醇的作用是降低分子表面张力，因而能在提取过程中减少气泡的产生。为使酚、氯仿和异戊醇在DNA提取过程中更好地发挥上述作用，步骤(5)中所使用的酚/氯仿/异戊醇混合液中，按体积比计，酚：氯仿：异戊醇为25:24:1；步骤(6)中使用的氯仿和异戊醇的最佳体积比为24：1。
优选地，本发明的实施方式所提供的多糖多酚植物基因组的提取方法中，步骤(7)中，加入NaCl的体积为所述上清体积的1/2；加入冰异丙醇的体积为所述上清体积的2/3。
附图说明
图1为具体实施方式中样本序号为1、2的多糖多酚植物样本材料提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果，其中，泳道号为样本序号；
图2为具体实施方式中样本序号为3、4的多糖多酚植物样本材料提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果，其中，泳道号为样本序号。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
以下采用本发明所提供的方法分别对下述4个多糖多酚植物样本进行基因组DNA的提取：
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 种类 | 耧斗菜 | 耧斗菜 | 栎属植物 | 栎属植物 |
实验操作：
1.核酸分离缓冲液的制备：200mMTris(pH＝8.0)
250mMNacl
50mMEDTA(pH＝8.0)
4％PVP，
配制100ml，高压灭菌。
3xCTAB裂解液制备：100mMTris(pH＝8.0)
1.5MNacl
25mMEDTA(pH＝8.0)
2％PVP
3％CTAB
配制100ml，磁力搅拌器上搅拌过夜，高压灭菌。
2.提取步骤：
1)取适量植物材料(50-100mg)，液氮冻存后研磨仪下研磨，加入1.8ml核酸分离缓冲液和终浓度为1％-5％2-巯基乙醇，震荡混匀，置90度水浴中10min，期间颠倒混匀几次；
2)取出，离心机中高速离心，弃掉上清液；
3)加入适量1XPBS溶液，研磨仪上震荡混匀，高速离心，弃上清；
4)重复3)步骤2-3次；
5)沉淀加800ul预热3xCTAB裂解液并混匀，65度水浴裂解30-60min；
6)取出加等体积酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混匀，高速离心；
7)取上清，加等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，高速离心；
8)取上清，加1/2体积的NaCl(5M)和2/3体积的冰冷的异丙醇，上下颠倒混匀，-20度沉淀1-3h；
9)取出，高速离心
10)沉淀用75％乙醇洗涤2次，风干后加50ulTE溶解。
3.实验结果：TBS380荧光定量结果如下表所示：
样本序号为1、2的多糖多酚植物样本材料提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果如附图1所示，样本序号为3、4的多糖多酚植物样本材料提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果如附图2所示，附图1和附图2中，图中M使用的是TaKaRa公司的DL15000Marker。
(样品：上样量均为100‐200ng，M(DL15,000)：上样量为3μl)。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (9)
1.一种多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)取待提取植物材料，研磨后加入核酸分离缓冲液和2-巯基乙醇，并使所述2-巯基乙醇的终浓度为1％～5％，震荡混匀后，置于75～95度水浴中5～30分钟；
(2)从水浴中取出，离心机中离心，弃掉上清液；
(3)加入1×PBS溶液，研磨仪上震荡混匀，离心，弃上清；
(4)向沉淀中加入500～1000ul预热的3×CTAB裂解液并混匀，65度水浴裂解30～60分钟；
(5)加等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；
(6)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；
(7)取上清，加入NaCl和冰异丙醇，上下颠倒混匀，在-20～-80度环境下沉淀1～3小时；
(8)取出，离心后，将沉淀用乙醇洗涤，风干后加TE溶解，即得到所提取的基因组。
2.根据权利要求1所述的多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的核酸分离缓冲液中包含下述组分：200mMTris、250mMNacl、50mMEDTA和质量浓度为4％PVP。
3.根据权利要求1所述的多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，步骤(1)中对待提取植物材料研磨之前，以液氮将所述待提取植物材料冻存。
4.根据权利要求1所述的多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，步骤(1)中加入核酸分离缓冲液时，每100毫克待提取植物材料加入1～2毫升核酸分离缓冲液。
5.根据权利要求1所述的多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，在进行步骤(4)之前，对步骤(3)重复2～3次。
6.根据权利要求1所述的多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，步骤(5)中所述的所述酚/氯仿/异戊醇混合液中，按体积比计，酚：氯仿：异戊醇为25:24:1。
7.根据权利要求1所述的多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，步骤(6)中所述的氯仿/异戊醇混合液中，按体积比计，氯仿：异戊醇为24:1。
8.根据权利要求1所述的多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，步骤(7)中，加入NaCl的体积为所述上清体积的1/2。
9.根据权利要求1所述的多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，步骤(7)中，加入冰异丙醇的体积为所述上清体积的2/3。
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