CN103409410B - 一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及传统食醋发酵过程样品中微生物总基因组的通用提取方法，属于分子生物学技术领域。本发明要解决的技术问题是提供一种适合于从固态发酵、半固态发酵和液态发酵的不同状态的传统食醋样品中提取微生物总基因组的方法。本发明的微生物总基因组提取方法包括以下步骤：食醋发酵样品预处理、微生物基因组DNA的抽提、除杂及漂洗浓缩。本发明的基因组提取方法为原位提取，所需样品量少于5g，不需要添加蛋白酶、纤维素酶、蜗牛酶等制剂，提取的基因组纯度质量高，可直接用于后续分子指纹图谱分析、宏基因组学分析、PCR(聚合酶链式反应)扩增目的基因和克隆文库的构建。

Description

一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法

技术领域

本发明涉及传统食醋发酵过程样品中微生物总基因组的通用提取方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

中国传统食醋的酿造过程是微生物自然发酵的过程，其风味和口感与微生物产生的多种代谢产物(如有机酸、醇、酯等)密切相关。传统食醋的生产过程与微生物菌群的演替密切相关，主要包括淀粉糖化、酒精发酵和醋酸发酵三个阶段，其发酵状态可分为固态发酵、半固态发酵和液态发酵。在传统食醋生产过程中，稳定的微生物群落结构不仅决定了食醋生产的正常进行，而且保证了产品质量的稳定，通过分析食醋酿造过程中微生物群落的组成和丰度演替规律，对食醋生产监控具有重要的意义。目前关于传统食醋酿造工艺中微生物菌群的研究已经大量开展，但是这些研究也面临着关键的难题，由于环境中有99%的微生物无法在实验室中实现纯培养，仅采用传统的培养分离的研究方法很难检测出主要功能微生物的种类及丰度变化，食醋酿造过程中仍有大量可能具有重要功能的未培养微生物没有被发现。随着分子生态学技术(如变性梯度凝胶电泳DGGE/温度梯度凝胶电泳TGGE)、高通量测序和宏基因组学等技术的发展，使得研究未培养的微生物成为可能。这些基于基因序列分析的研究关键在于高质量的微生物总基因组的提取，以避免由于提取方法不当所造成的数据丢失，影响结果的准确性。目前已经报道的关于食醋的醋醅样品中微生物基因组提取方法多采用“液氮研磨+溶菌酶+SDS高盐抽提”法，该方法仅针对醋酸发酵阶段固态的醋醅样品中微生物基因组的提取进行优化，而由于醋醅的状态不同于其他发酵阶段的样品，如酒精发酵阶段液态的酒醪样品，因此这种提取方法并不适合食醋其他发酵阶段样品中微生物总DNA的提取。已经公布的类似的基因组提取专利，如中国专利《固态发酵微生物总DNA提取方法》(专利号：ZL2007100356764.4)，中国专利《一种从酱香白酒大曲中提取微生物真菌总DNA的方法》(专利申请号：200910228704.3)，中国专利《通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法》(专利申请号：201210344426.X)，均是以固态的样品为研究对象，或以提取真菌的总DNA为目的，或针对酒醅样品做一系列预处理后再提取总DNA。然而，在食醋整体酿造过程中，各阶段的样品既有液态的又有固态的，且样品中有多种复杂微生物共存，这些方法不仅不能保证提取的质量和效果，而且存在一定的局限性。因此，开发一种高效通用的微生物总基因组提取方法对于进一步分析传统食醋发酵过程中微生物菌群的组成及演替规律具有重要意义。

发明内容

本发明目的是针对上述现有技术的不足，提供一种适合从传统食醋发酵过程中不同状态的食醋样品中提取微生物总基因组DNA的通用方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

①食醋发酵样品预处理：取液态或半固态样品0.2-5g在4℃6000-8000×g离心10-30min，弃上清，于-80℃预冻后，真空冷冻干燥，研磨样品至粉末状，待用；固态样品置于-20℃预冷的无菌研钵中，倾入液氮，研磨样品至粉末状，待用。

②微生物基因组DNA的抽提：向预处理后的样品中加入1.0mL-2.0mL DNA提取液，置于37℃的恒温振荡摇床在200-400rpm振摇15-30min后，加入质量比1%-5%的SDS(十二烷基硫酸钠)，充分混匀后置于65℃水浴锅中孵育1-3h，每15min-20min颠倒几下。向抽提液中加入1-2倍体积的PEG(聚乙二醇)8000(20%-40%，溶于1.6mol/L NaCl，体积比)室温放置1-2h，10000-12000×g离心10-30min，弃上清，将沉淀溶于1-2mL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA,pH8.0),加入乙酸钾(3-5mol/L)溶液,4℃放置15-60min，12000-15000×g离心10-20min，取上清，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液(酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1)，12000-15000×g离心10-30min。

③除杂及漂洗浓缩：吸取步骤②DNA抽提后的上清水相，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇体积比24∶1)，混合，12000-15000×g离心5-10min，吸取上清，加入醋酸铵-异丙醇混合液，-20～-80℃放置1-3h沉淀DNA，12000-15000×g离心10-20min，弃上清，取沉淀。用预冷的70%乙醇漂洗沉淀，12000-15000×g离心5-10min，弃上清，室温放置，直至乙醇挥发完全，加入50-100μL双蒸水溶解沉淀，得到微生物基因组总DNA。

步骤①中所述-80℃预冻时间为30-60min，真空冷冻干燥时间为2-5h。

其中，步骤②所述DNA提取液组成包括：50-100mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)，1-1.5mol/L NaCl，50-100mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，50-100mmol/L磷酸钠缓冲液，0.5%-2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，w/v)，1%-3%PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮，w/v)，pH8.0，溶剂为水。

其中，步骤②所述乙酸钾溶液的添加量为10%-20%(v/v)。

其中，步骤③所述醋酸铵-异丙醇混合液与上清液体积比优选为1∶1-2。

其中，步骤③所述醋酸铵溶液的浓度为6-8mol/L，pH为7-7.5。

其中，步骤③所述醋酸铵-异丙醇混合液中醋酸铵溶液∶异丙醇体积比优选为1∶1-5。

所述醋酸铵-异丙醇混合液中醋酸铵溶液∶异丙醇体积比更优选为1∶3。

本发明所述方法从食醋发酵过程中提取得到的微生物总基因组，由于浓度和纯度较高，经检测DNA完整性较好，可直接应用于测定食醋发酵过程中混合微生物的宏基因组文库构建和测序。

有益效果：

1、本发明的总基因组提取方法适用于传统食醋的不同发酵形式，包括固态发酵、半固态发酵和液态发酵，且适用于发酵过程各阶段的样品，包括曲、酒醪和醋醅等。

2、本发明的方法为原位提取，不需要将微生物与样品分离，所需的样品量少于5g，提取过程中不需要添加溶菌酶、纤维素、蜗牛酶等制剂，所用试剂均可从试剂公司购买。

3、本发明所述的DNA提取方法适合从传统食醋发酵样品中同时提取真菌和细菌的总基因组，真空冷冻干燥适合液态和半固态样品预处理，可以尽快去除水分，而加入醋酸铵-异丙醇混合液后在低温环境下有利于DNA沉淀，能较大程度地保证DNA片段的完整性。本方法提取的总DNA质量高，总DNA的纯度OD260/280在1.8-2.0之间，浓度在300-700ng/μL之间，可直接用于后续指纹图谱分析、宏基因组学分析、PCR(聚合酶链式反应)扩增目的基因和克隆文库的构建等。

附图说明

图1醋醅样品提取基因组扩增16S rDNA片段琼脂糖电泳图；

图2酒醪样品提取基因组扩增16S rDNA片段琼脂糖电泳图；

其中，图1中M为DNA Maker；1为本发明方法电泳结果；2为对照方法电泳结果；图2中M为DNA Maker；1为对照方法电泳结果；2为本发明方法电泳结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明中所涉及的试剂和耗材均需要高压灭菌(如121℃灭菌15-20min)后使用。

实施例1

本实施例样品为食醋固态醋醅样品。

(1)取2g醋醅样品于无菌研钵中破碎至细小颗粒，加入液氮快速研磨至粉末状。

(2)取0.3g样品加入2mL DNA提取液，置于37℃的恒温振荡摇床在300rpm振摇20min后，加入200μL2%SDS，旋涡振荡混匀后，迅速置于65℃水浴锅中孵育1h，每15min-20min轻轻颠倒几下，向抽提液中加入PEG8000(20%-40%，溶于1.6mol/L NaCl，体积比)室温放置2h，10000×g离心130min，弃上清，将沉淀溶于TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA,pH8.0),加入3mol/L乙酸钾溶液,4℃放置60min，之后室温条件下13000×g离心15min。

(3)吸取1mL上清水相，加入1mL酚∶氯仿-异戊醇混合液，轻轻颠倒几下，13000×g离心20min。

(4)吸取0.8mL上清水相，加入0.8mL氯仿-异戊醇混合液，轻轻颠倒几下，13000×g离心10min。

(5)吸取上清0.6mL于另一无菌离心管中，加入1mL醋酸铵-异丙醇混合液(体积比1∶2，醋酸铵溶液6mol/L，pH7)，于-20℃静置1h。

(6)13000×g室温离心15min，弃去上清，加入预冷的70%乙醇0.5mL，漂洗沉淀两次，13000×g室温离心5min，弃去上清，室温放置数分钟，直至乙醇挥发完全，加入80μL无菌双蒸水，溶解沉淀后，取1μL测DNA浓度和纯度(结果见表1)，其余放入-20℃冰箱保存。

(7)DNA提取液组成包括：50mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)，1mol/L NaCl，50mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，50mmol/L磷酸盐缓冲液，0.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，w/v)，1%PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮，w/v)，pH8.0，溶剂为水。

(8)对照方法：步骤(5)中以0.6mL异丙醇溶液替换0.6mL的醋酸铵-异丙醇混合液，于室温沉淀1h。其余步骤基本相同。

表1

注：OD260/280表示DNA的纯度，在1.8-2.0之间表示DNA纯度较好，数值低于1.8表示样品中存在杂蛋白，高于2.0表示样品中存在RNA。

实施例2

本案例样品为食醋半固态酒醪样品。

(1)取5g酒醪样品于4℃8000×g离心20min，弃上清，将样品于-80℃放置30min后真空冷冻干燥2h，将干燥样品均匀放入无菌研钵中，倾入液氮快速研磨至样品成白色粉末。

(2)快速称取0.5g样品，加入1.5mL DNA抽提缓冲液，置于37℃的恒温振荡摇床在400rpm振摇15min后，加入250μL2%SDS，旋涡振荡混匀后，迅速置于65℃水浴锅中孵育1h，每15min-20min轻轻颠倒几下，向抽提液中加入2倍体积的PEG8000(20%-40%，溶于1.6mol/L NaCl，体积比)室温放置1h，12000×g离心10min，弃上清，将沉淀溶于2mL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA,pH8.0),加入10%(v/v)5mol/L乙酸钾溶液,4℃放置40min，之后室温条件下14000×g离心15min。

(3)吸取1mL上清水相，加入1mL酚∶氯仿∶异戊醇混合液(体积比25∶24∶1)，轻轻颠倒几下，14000×g室温离心15min。

(4)吸取上清水相0.8mL，加入0.8mL氯仿∶异戊醇混合液(体积比24∶1)，轻轻颠倒几下，14000×g离心10min。

(5)吸取上清0.5mL于另一无菌离心管中，加入1mL醋酸铵-异丙醇混合液(体积比1∶5，醋酸铵溶液7mol/L，pH7.5)于-20℃静置2h。

(6)14000×g室温离心20min，弃去上清，加入预冷的70%乙醇0.5mL，漂洗沉淀两次，14000×g室温离心5min，弃去上清，室温放置数分钟，直至乙醇挥发完全，加入80μL无菌双蒸水，溶解沉淀后，取1μL测DNA浓度和纯度(结果见表2)，其余放入-20℃冰箱保存。

(7)DNA提取液组成包括：100mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)，1.5mol/L NaCl，100mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，100mmol/L磷酸盐缓冲液，2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，w/v)，2%PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮，w/v)，pH8.0，溶剂为水。

(8)对照方法：步骤(1)酒醪样品离心后直接取沉淀加液氮研磨，不进行低温放置和真空干燥。其他步骤基本相同。

表2

实施例3

(1)称取实施例2中预处理研磨后的样品0.3g，加入1mL DNA抽提缓冲液，置于37℃的恒温振荡摇床在200rpm振摇30min后加入和200μL2%SDS，旋涡振荡混匀后，迅速置于65℃水浴锅中孵育2h，每15min轻轻颠倒几下，向抽提液中加入等体积的PEG8000(20%-40%，溶于1.6mol/L NaCl，体积比)室温放置1.5h，10000-12000×g离心10-30min，弃上清，将沉淀溶于1mL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA,pH8.0),加入20%(v/v)3mol/L乙酸钾溶液,4℃放置15min，之后15000×g离心10min。

(2)吸取1mL上清水相，加入1mL酚∶氯仿∶异戊醇混合液(体积比25∶24∶1)，轻轻颠倒几下，15000×g离心10min。

(3)吸取上清水相0.8mL，加入0.8mL氯仿∶异戊醇混合液(体积比24∶1)，轻轻颠倒几下，15000×g离心10min。

(4)吸取上清0.5mL于另一无菌离心管中，加入0.5mL的醋酸铵-异丙醇(体积比1∶3，醋酸铵溶液7.5mol/L，pH7.5)于-80℃静置3h。

(5)15000×g离心10min，弃去上清，加入预冷的70%乙醇0.5mL，漂洗沉淀两次，15000×g离心5min，弃去上清，室温放置数分钟，直至乙醇挥发完全，加入80μL无菌双蒸水，溶解沉淀后，取1μL测DNA浓度和纯度，其余放入-20℃冰箱保存。

(6)检测结果OD260/280为1.85，DNA浓度(ng/μL)为652.33，满足后续实验要求。

(7)DNA提取液组成包括：80mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)，1.2mol/L NaCl，70mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，80mmol/L磷酸盐缓冲液，1%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，w/v)，3%PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮，w/v)，pH8.0，溶剂为水。

实施例4

以实施例1和2中提取的基因组为模板，扩增细菌16S rDNA V3区片段，用于宏基因组文库的构建和测序。PCR引物为338f(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)/518r(ATTACCGCGGCTGCTGG)，PCR反应体系为50μL，各组分比例为：基因组DNA1μL，引物各0.2μM，0.2mM的dNTPs，0.5μL TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶，5μL10×Ex Taq Buffer。PCR程序为：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性1min，52℃退火45s，72℃延伸30s；72℃终延伸10min。PCR产物采用超微量紫外分光光度计(NanoDrop)和2%琼脂糖凝胶电泳对样品进行检测，结果分别见表3、图1和图2。图1说明未采用醋酸铵、低温沉淀处理的基因组有较多碎片，扩增片段有弥散片段，而加入醋酸铵、低温沉淀的基因组DNA样品扩增产物带型完整，扩增效果较好。图2说明未经预处理的样品扩增片段较暗，而经预处理后的基因组DNA样品扩增片段明亮，效果较好。

表3

检测结论是依据华大基因测序样品检测标准要求，对检测样品所做的综合评价，根据超微量紫外分光光度计和电泳检测结果显示，样品主带明显，浓度均大于3μg，属于一类品，可以进行文库构建。其定量分类标准为：总量大于3μg属于一类品；总量在1-3μg之间的样品属于二类品；总量小于1μg属于不合格样品。由于小片段文库需要DNA3-5μg，单一条带PCR产物构建一个PCR free文库需要DNA3μg，根据检测结果表明本方法提取的总DNA质量及PCR扩增样品的质量均达到了宏基因组测序的标准。

Claims (7)

1.一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：

①食醋发酵样品预处理：取液态或半固态样品0.2-5g在4℃6000-8000×g离心10-30min，弃上清，于-80℃预冻后真空冷冻干燥，研磨样品至粉末状，待用；固态样品置于-20℃预冷的无菌研钵中，倾入液氮，研磨样品至粉末状，待用；

②微生物基因组DNA的抽提：向预处理后的样品中加入1.0mL-2.0mL DNA提取液，置于37℃的恒温振荡摇床在200-400rpm振摇15-30min后，加入质量比1％-5％的SDS，充分混匀后置于65℃水浴锅中孵育1-3h，每15min-20min颠倒几下，向抽提液中加入1-2倍体积的PEG 8000，室温放置1-2h，10000-12000×g离心10-30min，弃上清，将沉淀溶于1-2mL TE缓冲液,加入3-5mol/L乙酸钾溶液,4℃放置15-60min，12000-15000×g离心10-20min，取上清，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1，12000-15000×g离心10-30min；所述DNA提取液组成包括：50-100mmol/LTris-HCl，1-1.5mol/L NaCl，50-100mmol/L EDTA，50-100mmol/L磷酸钠缓冲液，0.5％-2％w/v CTAB，1％-3％w/v PVPP，pH 8.0，溶剂为水；

③除杂及漂洗浓缩：吸取步骤②DNA抽提后的上清水相，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，氯仿:异戊醇体积比为24:1，12000-15000×g离心5-10min，吸取上清，加醋酸铵-异丙醇混合液，醋酸铵溶液:异丙醇体积比为1:1-5，-20～-80℃放置1-3h沉淀DNA，12000-15000×g离心10-20min，弃上清，取沉淀；用预冷的70％乙醇漂洗沉淀，12000-15000×g离心5-10min，弃上清，室温放置，直至乙醇挥发完全，加入50-100μL双蒸水溶解沉淀，得到微生物基因组总DNA。

2.如权利要求1所述的一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法，其特征在于，步骤①中所述-80℃预冻时间为30-60min，真空冷冻干燥时间为2-5h。

3.如权利要求1所述的一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法，其特征在于，步骤②所述乙酸钾溶液的添加量为10％-20％v/v。

4.如权利要求1所述的一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法，其特征在于，步骤③所述醋酸铵-异丙醇混合液与上清液体积比为1:1-2。

5.如权利要求1所述的一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法，其特征在于，步骤③所述醋酸铵溶液的浓度为6-8mol/L，pH为7-7.5。

6.如权利要求1所述的一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法，其特征在于，所述醋酸铵-异丙醇混合液中醋酸铵溶液:异丙醇体积比为1:3。

7.权利要求1-6任一所述的提取微生物总基因组的方法用于食醋发酵过程中提取混合微生物的宏基因组DNA的用途，提取的DNA可直接用于宏基因组测序。