CN102286463A - 一种高效去除腐殖质的环境样品总dna提取方法 - Google Patents

一种高效去除腐殖质的环境样品总dna提取方法 Download PDF

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赵吉
李靖宇
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Abstract

本发明公开了高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，包括以下步骤：(1)取0.3g过筛的土样于装有三颗2.5mm-3.0mm灭菌玻璃珠的2mL的离心管中，加入1mL脱腐缓冲液，Vortex-Genie
Figure DSA00000527331500011
2(Mobio Laboratories Inc)涡旋1min，12000r/min离心2min，弃上清；(2)加入1mL 0.5mol/L的氯化钙溶液，Vortex-Genie2(MobioLaboratories Inc)涡旋2min，12000r/min离心1min，弃上清；(3)加入800μL DNA提取缓冲液，Vortex-Genie
Figure DSA00000527331500013
2(Mobio Laboratories Inc)涡旋5s。快速高效提取土壤总DNA，为土壤宏基因组学研究提供高纯度基因组DNA。

Description

一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法
技术领域
本发明涉及一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
土壤基因组DNA提取是环境宏基因组学研究的基础。可以通过两种途径实现土壤DNA的提取，一是在裂解细胞前将土壤中的微生物细胞与土壤颗粒等分开，然后再裂解细胞，获得总DNA；二是直接裂解细胞，从土壤中提取总DNA，这种途径获得的总DNA产量大，但纯度低，主要是腐殖酸等杂质的影响。
目前，土壤DNA提取方法多，如液氮研磨法、微波破碎法、玻璃珠裂解法、酶裂解法、快速冻融法、离子交换法、溶剂-玻璃珠混匀法、SDS-玻璃珠法、SDS-GITC-PEG法、MS法、Nycodenz法、Blending法、UltraClean Soil DNA kit(MoBio Laboratories，Inc.，Solana Beach，Calif.)、Fast DNA spin sample kit(for soil；Bio 101，Lajolla，Calif.)等，所有这些方法要解决的关键问题是去除腐殖酸以及如何从裂解的细胞中提取总DNA。上述方法直接提取土壤总DNA的纯度低，需要后续的纯化步骤，费时费力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法。
高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，包括以下步骤：(1)取0.3g过筛的土样于装有三颗2.5mm-3.0mm灭菌玻璃珠的2mL的离心管中，加入1mL脱腐缓冲液(100mmol/L Tris，100mmol/L Na4P2O7，100mmol/L Na2EDTA，1.0％PVP，100mmol/LNaCl，0.05％Triton X-100，pH 10.0)，Vortex-Genie
Figure BSA00000527331800011
2(Mobio Laboratories Inc)涡旋1min，12000r/min离心2min，弃上清；
(2)加入1mL 0.5mol/L的氯化钙溶液，Vortex-Genie2(Mobio Laboratories Inc)涡旋2min，12000r/min离心1min，弃上清；
(3)加入800μL DNA提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH 8.0)，Vortex-Genie
Figure BSA00000527331800022
2(Mobio Laboratories Inc)涡旋5s；
(4)加入200μL SDS溶液(20％)，颠倒混匀，65℃温育10min，5min颠倒混匀一次。；
(5)取上清900μL于2mL离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，12000r/min离心5min；
(6)取上清800μL于2mL离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000r/min离心5min；
(7)取上清600μL于1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴20min，12000r/min离心5min；
(8)弃上清，用70％的酒精洗沉淀，自然干燥或冷冻干燥；
(9)50μL TE溶解沉淀。
去除腐殖酸是土壤总DNA提取的重要环节，步骤1-3协同作用，能高效去除腐殖酸，提高土壤总DNA提取纯度。
高效去除土壤中腐殖酸，提高总DNA提取纯度，为土壤宏基因组学研究提供基础技术。
附图说明
图1为本发明方法提取4种不同土壤微生物基因组DNA电泳图(3个重复)；
图2为本发明方法提取4种不同土壤微生物AOB基因组amoA基因片段扩增电泳图；
图3为本发明方法提取4种不同土壤微生物AOA基因组amoA基因片段扩增电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实验土壤：供试土样采集于内蒙古高原锡林河流域中游，包括典型草原围封区土壤-1、退化草原区土壤-2、锡林河高河漫滩区湿地土壤-3和低河漫滩区湿地土壤-4试验土样，分别记为W1、W2、W3、W4。采集深度：0-10cm，四种土壤样品的部分理化性质见表1。
Figure BSA00000527331800031
高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，操作步骤如下：
(1)取0.3g过筛的土样于装有三颗2.5mm-3.0mm灭菌玻璃珠的2mL的离心管中，加入1mL脱腐缓冲液(100mmol/L Tris，100mmol/L Na4P2O7，100mmol/L Na2EDTA，1.0％PVP，100mmol/L NaCl，0.05％Triton X-100，pH 10.0)，Vortex-Genie
Figure BSA00000527331800032
2(MobioLaboratories Inc)涡旋1min，12000r/min离心2min，弃上清。
(2)加入1mL 0.5mol/L的氯化钙溶液，Vortex-Genie
Figure BSA00000527331800033
2(Mobio Laboratories Inc)涡旋2min，12000r/min离心1min，弃上清。
(3)加入800μL DNA提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH 8.0)，Vortex-Genie2(Mobio Laboratories Inc)涡旋5s。
(4)加入200μL SDS溶液(20％)，颠倒混匀，65℃温育10min，5min颠倒混匀一次。
(5)取上清900μL于2mL离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，12000r/min离心5min。
(6)取上清800μL于2mL离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000r/min离心5min。
(7)取上清600μL于1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴20min，12000r/min离心5min。
(8)弃上清，用70％的酒精洗沉淀，自然干燥或冷冻干燥。
注：如果有白色沉淀，加入500μL溶解混合液溶解沉淀后，加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴10min，12000r/min离心5min。弃上清，用70％的酒精洗沉淀，自然干燥或冷冻干燥。
(9)50μL TE溶解沉淀。
实验结果：见图1，从图1可以看出该法提取得到的土壤基因组DNA大小约为23kb左右，且没有断裂。
土壤总DNA提取质量验证：PCR扩增是土壤DNA提取的最终目的，因此，能否进行PCR成为土壤DNA提取质量的一个最重要的指标，验证结果见图2和图3，从图2可以看出该法获得的土壤基因组DNA可以用于氨氧化细菌功能基因的扩增，从图3可以看出该法获得的土壤基因组DNA可以用于氨氧化古菌功能基因的扩增。
结论：本发明提供的方法可以高效去除腐殖酸，得到高纯度的土壤总DNA，能成功应用于后续的分子生物学分析，为土壤环境宏基因组学研究提供了一种新的土壤总DNA提取技术。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，例如，步骤(2)中加入氯化钙溶液步骤，可以通过加入氯化钡溶液、氯化镁溶液、氯化亚铁溶液、氯化铁溶液、氯化铝溶液或氯化锌溶液实现；而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取0.3g过筛的土样于装有三颗2.5mm-3.0mm灭菌玻璃珠的2mL的离心管中，加入1mL脱腐缓冲液(100mmol/L Tris，100mmol/L Na4P2O7，100mmol/L Na2EDTA，1.0％PVP，100mmol/L NaCl，0.05％Triton X-100，pH 10.0)，Vortex-Genie2(MobioLaboratories Inc)涡旋1min，12000r/min离心2min，弃上清；
(2)加入1mL 0.5mol/L的氯化钙溶液，Vortex-Genie
Figure FSA00000527331700012
2(Mobio Laboratories Inc)涡旋2min，12000r/min离心1min，弃上清；
(3)加入800μL DNA提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH 8.0)，Vortex-Genie
Figure FSA00000527331700013
2(Mobio Laboratories Inc)涡旋5s；
(4)加入200μL SDS溶液(20％)，颠倒混匀，65℃温育10min，5min颠倒混匀一次。；
(5)取上清900μL于2mL离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，12000r/min离心5min；
(6)取上清800μL于2mL离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000r/min离心5min；
(7)取上清600μL于1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴20min，12000r/min离心5min；
(8)弃上清，用70％的酒精洗沉淀，自然干燥或冷冻干燥；
(9)50μL TE溶解沉淀。
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