CN102102098B - 一种改良的酚-氯仿法提取真菌dna - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改良的酚-氯仿法提取真菌DNA，所述的方法包括真菌细胞裂解、蛋白质消化分离、DNA萃取等步骤；本发明所述的方法是利用SDS、蛋白酶K等化学物质的有效组合，通过水饱和酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂的沉淀后，用分光光度计测定OD260/OD280值接近于标准值，可直接应用于分子操作，该方法可以应用于各种真菌的DNA提取，解决了其他常见真菌DNA提取方法仅仅对某一种真菌有良好效果的问题，在真菌的DNA提取领域具有重大应用前景。
Description
1、技术领域 本改良方法属于分子生物学领域，具体是对酚-氯仿提取DNA方法进行改良，使之适用于各种真菌的DNA提取。
2、背景技术 真菌感染是一种人畜共患的常见病，近半个世纪以来，随着广谱抗生素、皮质类固醇、免疫抑制剂和放射治疗的普遍应用，烧伤抢救和器官移植等工作的开展，艾滋病的流行，条件致病性真菌病日益多见。
在临床上真菌菌种间的鉴定尤其是酵母类真菌的区别鉴定尤其困难，常规的形态学观察无法准确判断，故而对临床样本的分子学鉴定就显得尤为重要。DNA的提取效率，尤其是DNA的纯度严重影响分子鉴定的实验结果，同一标本采用不同方法或不同标本采用相同方法提取DNA，其纯度和提取率有很大差异，而且由于丝状真菌和酵母真菌的细胞壁结构不同，很多提取真菌DNA的方法只能对其中一类真菌有良好效果。目前国内外的真菌DNA提取方法主要为CTAB法、EDTA法以及玻璃珠研磨法，但是以上方法对样本量要求高，提取效率低，试剂配制以及操作过程繁琐，提取成本高等缺点。而常规的酚-氯仿DNA提取法无法有效的破坏真菌的细胞壁，从而无法有效提取真DNA。因此需要一种成本低廉，操作简便，可以针对各种真菌的DNA提取方法。
改良酚-氯仿法是一种增加了破坏真菌细胞壁，并对传统酚-氯仿法中消化蛋白质以及无水乙醇萃取步骤进行了改良的新型真菌DNA提取方法。该方法可以适用于各种真菌，是一种简便有效的真菌DNA提取方法。
3、发明内容 本改良方法增加了液氮研磨破坏真菌细胞壁的步骤，延长蛋白酶K的消化时间，延长无水乙醇萃取时间并将萃取环境改为-20℃。该方法能有效的提取各种真菌的高浓度全基因组DNA。
4、具体实施方式
1)、液氮研磨干燥的真菌样本(样本量不少于75mg)，将研磨成粉末状的真菌样本收集到1.5ml EP管中，加入500ml STE缓冲液(1.169gNaCl、2.422g Tris、3.632g EDTA溶于200ml去离子水调节PH值至8.0)、30μl蛋白酶K、30μl 10％SDS，于54℃消化6-8h。
2)、加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物，振荡至出现絮状物，10000r/min离心3min。
3)、取上清至另一1.5ml EP管中，加入500μl氯仿/异戊醇(24/1)，震荡混匀后10000r/min离心3min。
4)、取上清至新1.5ml EP管中，加入30μl NaCl(5mol/L)、800μl无水乙醇，混匀后于-20℃放置6-10h，10000r/min离心3min。
5)、保留沉淀加入600μl乙醇(70％)，混匀后10000r/min离心3min。
6)、弃上清后，将沉淀中的乙醇充分挥发干净后加入50μl-100μl的无菌水溶解4℃保存。
实施例
取季氏酵母、近平滑念珠菌两种酵母类真菌以及黑曲霉、犬小孢子菌两种丝状真菌的干燥样本各100mg，按照具体实施方式中的方法提取DNA。将提取完成的DNA采用核酸蛋白检测仪检测，测定OD260/280值接近于标准值，其DNA浓度分别在250-2600μg/ml之间；进行真菌ITS区的PCR检测，经过琼脂糖凝胶电泳分别得到了500-600bp左右的单一片段。证明该方法对酵母类真菌和丝状真菌都有良好的提取效果。
Claims (1)
1.一种真菌DNA的酚-氯仿改良提取方法，适于酵母样真菌和丝状真菌DNA的提取，包含如下的步骤：
A)试剂制备方法：
STE缓冲液：将1.169g NaCl、2.422g Tris、3.632g EDTA溶于200ml去离子水调节PH值至8.0，常温保存备用；
苯酚/氯仿/异戊醇混合液：苯酚/氯仿/异戊醇三种试剂按照25/24/1的体积比例混合常温备用；
氯仿/异戊醇混合液：氯仿/异戊醇两种试剂按照24/1的体积比例混合常温备用；
B)DNA提取：
1)、液氮研磨干燥的真菌样本，将研磨成粉末状的真菌样本收集到1.5ml EP管中，加入500ml STE缓冲液、30μl蛋白酶K、30μl 10％SDS，于54℃消化6-8h；所用真菌样本量不少于75mg；
2)、加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇混合液，振荡至出现絮状物，10000r/min离心4min；
3)、取上清至另一1.5ml EP管中，加入500μl氯仿/异戊醇混合液，振荡混匀后10000r/min离心4min；
4)、取3)上清至新1.5ml EP管中，加入5mol/L NaCl溶液30μl、800μl无水乙醇，混匀后于-20℃放置6-10h，10000r/min离心4min；
5)、保留4)沉淀加入70％的乙醇600μl，混匀后10000r/min离心4min；
6)、弃5)上清后，将沉淀中的乙醇充分挥发干净后得到目的物，加入50μl-100μl的无菌水溶解4℃保存。
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