CN107151667A - 一种基因组dna提取方法 - Google Patents

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邢红兵
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

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Abstract

本发明公开了一种基因组DNA提取方法，包括：取新鲜材料剪碎，加液氮速冻，快速研磨，获得低温粉料；将低温粉料转移到1.5mL离心管中，加20%SDS 20mL，蛋白酶K（2mg/mL）20mL，混匀；加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀4min；离心抽提溶解等步骤；最终获得DNA溶解液，检测DNA质量后将DNA溶解分装到1.5mL离心管冷冻保藏。本发明热的DNA提取方法，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中快速高效的获得DNA，DNA质量高，经酶切后不仅可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等后续研究，具有很好的实用性。

Description

一种基因组 DNA 提取方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因组DNA提取方法。
技术背景
DNA提取是基因克隆研究的第一步，现有的方法主要是CTAB方法，其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式：酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有；硅质材料、阴离子交换树脂等。这些方法种类繁多，提取质量各有千秋，还不能完全满足使用需求。
发明内容
发名目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基因组DNA提取方法，具有高效，快速质量高等优点。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
1）取新鲜材料剪碎，加液氮速冻，快速研磨，获得低温粉料；
2）将低温粉料转移到1.5mL 离心管中，加20%SDS 20mL，蛋白酶K（2mg/mL）20mL，混匀；
3）55℃水浴2-3h；
4）加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀4min；
5）离心5500g 12min，取上层水相到另一1.5mL 离心管中；
6）加等体积饱和酚，混匀，离心5300g 12min，取上层水相到另一管中；
7）加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5500g 12min，取上层水相到另一管中；如水相仍不澄清，可重复此步骤数次；
8）加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5500g 12min，取上层水相到另一管中；
9）加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀；
10）待絮状物出现后，离心5500g 6min，弃上清液；
11）沉淀用75%乙醇洗涤，离心5500g 2min，弃上清液；
12）室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mLTE溶解过夜；
13）取1uL DNA溶解液检测DNA质量；
14）DNA质量符合要求后，将DNA溶解分装到1.5mL离心管冷冻保藏。；
所述的TE：10mM Tris-HCl，1mM EDTA。
所述的TBS：25mM Tris-HCl，200mM NaCl，5mM KCl。
所述裂解缓冲液：250mM SDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。
有益效果：与现有技术相比，本发明热的DNA提取方法，在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中快速高效的获得DNA，DNA质量高，经酶切后不仅可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等后续研究，具有很好的实用性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
以下实施例所使用的主要试剂如下：
TE：10mM Tris-HCl（pH7.8），1mMEDTA（pH8.0）。
TBS：25mMTris-HCl（pH7.4），200mMNaCl，5mMKCl。
裂解缓冲液：250mM SDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。
20%SDS、2mg/mL 蛋白酶K、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿、无水乙醇、75%乙醇。
实施例1
一种基因组DNA提取方法，包括以下步骤：
1）取新鲜材料剪碎，加液氮速冻，快速研磨，获得低温粉料。
2）将低温粉料转移到1.5mL 离心管中，加20%SDS 20mL，蛋白酶K（2mg/mL）20mL，混匀。
3）55℃水浴2-3h。
4）加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀4min；
5）离心5500g 12min，取上层水相到另一1.5mL 离心管中。
6）加等体积饱和酚，混匀，离心5300g 12min，取上层水相到另一管中。
7）加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5500g 12min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
8）加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5500g 12min，取上层水相到另一管中。
9）加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
10）待絮状物出现后，离心5500g 6min，弃上清液。
11）沉淀用75%乙醇洗涤，离心5500g 2min，弃上清液。
12）室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mLTE溶解过夜。
13）取1uL DNA溶解液检测DNA质量；
14）DNA质量符合要求后，将DNA溶解分装到1.5mL离心管冷冻保藏。
本发明热的DNA提取方法，在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中快速高效的获得DNA，DNA质量高，经酶切后不仅可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等后续研究，具有很好的实用性。

Claims (4)

1.一种基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤
1）取新鲜材料剪碎，加液氮速冻，快速研磨，获得低温粉料；
2）将低温粉料转移到1.5mL 离心管中，加20%SDS 20mL，蛋白酶K（2mg/mL）20mL，混匀；
3）55℃水浴2-3h；
4）加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀4min；
5）离心5500g 12min，取上层水相到另一1.5mL 离心管中；
6）加等体积饱和酚，混匀，离心5300g 12min，取上层水相到另一管中；
7）加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5500g 12min，取上层水相到另一管中；如水相仍不澄清，可重复此步骤数次；
8）加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5500g 12min，取上层水相到另一管中；
9）加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀；
10）待絮状物出现后，离心5500g 6min，弃上清液；
11）沉淀用75%乙醇洗涤，离心5500g 2min，弃上清液；
12）室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mLTE溶解过夜；
13）取1uL DNA溶解液检测DNA质量；
14）DNA质量符合要求后，将DNA溶解分装到1.5mL离心管冷冻保藏。
2.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述的TE：10mM Tris-HCl，1mM EDTA。
3.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述的TBS：25mM Tris-HCl，200mM NaCl，5mM KCl。
4.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述裂解缓冲液：250mM SDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。
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