CN103289990A

CN103289990A - 一种血液dna的快速提取方法

Info

Publication number: CN103289990A
Application number: CN2013102350999A
Authority: CN
Inventors: 秦炜; 毕婷婷; 陈标榜; 余向东
Original assignee: Zhejiang Century Condor Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Century Condor Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明公开一种血液DNA的快速提取方法。现有技术很繁琐而且耗时，且过去传统的方法抽提出的痕量DNA由于含量太少，很难用来进行分子诊断。本发明能够在很短时间内快速完成血液样本的DNA提取。采集来的全血样本首先加入细胞洗涤液，离心分离后得到残留细胞团，加入SDS、醋酸铵、盐酸胍、蛋白酶K置于60℃水浴15～30分钟，然后经纯化柱充分结合DNA，离心取沉淀物加入硅胶膜洗涤液洗涤两次，离心后加入TE缓冲液，最后得到含DNA的保存液。本发明具有较高的重复稳定性、较简单且不耗时、所得DNA质量高的优点。

Description

一种血液DNA的快速提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种血液DNA的快速提取方法，具体涉及一种全血样品DNA的快速提取方法，是分子生物学的最基本的步骤之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组技术等领域。

背景技术

血液DNA的提取和纯化是分子生物学的最基本步骤之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组技术等领域。经典的从血液样品中提取和纯化DNA是分为五个步骤：破碎红细胞、离心沉淀白细胞、破碎白细胞、沉淀去蛋白、分离和纯化DNA。目前常用的血液DNA提取的方法有两个：酚氯仿抽提法和Chelex-100法。前种方法一般可以得到质量和纯化较好的能够长时间保存的DNA，对满足基本的小规模分子实验工作需求已足够，但是这种方法耗时长，不适合大规模的分子临床检验工作，且实验过程所用到的苯酚、氯仿、异丙醇等试剂有毒害。后种方法常用于司法实践中微量DNA的提取，快速简便，但是此种方法得到的DNA模板浓度很低，容易降解，不易长期保存，不能浓缩DNA，对于量少质差的检材提取成功率偏低（杨静开.脱落细胞类DNA提取方法的研究应用[J].刑事技术.2009.(3):54-56），且此种方法很可能会出现下游PCR扩增不均匀，甚至扩增失败。所以这两种方法不易扩大规模，从而影响了后期工作的效率，目前称其为临床基因序列分析研究和应用的瓶颈，许多临床核酸技术的应用受制于快速大量制备血液DNA技术不足。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种快速简易、低成本、高可靠性的血液DNA提取方法，推进血液DNA技术推广，最终解决了以上提到的血液DNA提取技术不足问题，并使其可以顺利地应用于规模化的临床实践。我们的目的是用最简便快速的方法制备大量符合品质要求的血液DNA。

本发明为解决其技术问题，所采取的方法步骤如下：

步骤(1).细胞裂解分离

在全血样本中加入细胞洗涤液，其中全血样本与细胞洗涤液的体积比为5：14，颠倒混匀样本，常温孵育5～10min，期间间偶尔颠倒混一下离心管，13000～16000g转速常温离心1分钟，弃上清，得到残留细胞团；

所述的细胞洗涤液为浓度为20mM的Tris-HCl溶液，pH值为7.6；

步骤(2).消化沉淀

取20～30ul上述步骤(1)所得的残留细胞团，然后依次加入15ul体积分数为10﹪的十二烷基硫酸钠SDS、15ul浓度为8M的醋酸铵、600ul浓度为5M的盐酸胍、3ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，60℃水浴15～30分钟后，冰浴冷却至常温，然后在4～8℃下13000～16000rpm/min转速离心2～3min，得到离心后的上清液，该上清液为DNA抽提液；

步骤(3).纯化

将上述步骤(2)所得的DNA抽提液加入到2ml Eppendorf管中的纯化柱中，常温孵化2～5分钟，充分结合DNA，经纯化柱吸附后，离心分离，得到沉淀物；将沉淀物经硅胶膜洗涤液洗涤两次，离心分离，去除纯化柱中残存的硅胶膜洗涤液，得到洗涤后的沉淀物；然后再洗涤后的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解洗脱DNA后，离心分离，去除沉淀，得到含DNA的保存液；

所述的硅胶膜洗涤液为10mM Tris-HCl、1mM乙二胺四乙酸EDTA、20mM NaCl、体积分数为50﹪乙醇的混合液。

本发明得到的DNA片段长度大于20Kb，OD260/OD280比值大于1.7，可直接用于PCR和其它分子生物学用途。

本发明有较高的重复稳定性，不需重复实验，在200例志愿者血液DNA提取中，仅一次快速提取即得到高质量的模板DNA，在对EGFR第18、19、20、21号外显子的扩增中，所有提取的血液DNA模板均能成功进行扩增，得到与预计片段大小相同的产物，测序结果也证实了本发明的可靠性。本发明DNA的提取无需经过苯酚、氯仿、异丙醇等有害试剂抽提，可直接迅速取全血样本进行DNA提取。本发明方法具有较高的重复稳定性、操作简单且不耗时、所得DNA质量高的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

实施例1.现以正常人血液为例，非限定实施例叙述如下：

（1）取500ul新鲜的全血样本到2.0ml离心管里。离心管中加入1400ul的细胞洗涤液，颠倒混匀样本，常温孵育10min，期间偶尔颠倒混一下离心管。

（2）13000g转速离心1分钟，常温。

（3）弃上清，使管底残留细胞团20ul。

（4）重新震荡悬浮管内残留细胞团。

（5）向残留细胞团中依次加入15ul体积分数为10﹪的十二烷基硫酸钠SDS、15ul浓度为8M的醋酸铵、600ul浓度为5M的盐酸胍、3ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，60℃水浴15分钟。

（6）混合物冰浴冷却至常温，4℃下13000g rpm/min转速离心3min。

（7）取上清液，将上清液加入到置于2ml Eppendorf管中的纯化柱中，常温下孵化2min，盖上盖子，5000rpm/min离心1min，弃去滤出液。

（8）将纯化柱放在新的2ml Eppendorf管中，弃去含有滤出液的Eppendorf管，加入700μl硅胶膜洗涤液。盖上盖子，5000rpm/min离心1min，弃去含有滤出液的Eppendorf管。

（9）用硅胶膜洗涤液重复洗涤一次。

（10）将纯化柱放在新的2ml Eppendorf管中，开盖，最高转速离心1min。

（11）将纯化柱放到新的1.5ml Eppendorf管中，取100μl的TE缓冲液直接加到纯化柱底部的硅胶膜上，盖上盖子，常温下溶解5min，高速离心1min，得到从纯化柱中洗涤下来的DNA。

（12）从1.5ml Eppendorf管中轻轻取出洗涤下来的滤出液，重新加入到纯化柱上，常温下溶解5min，重新高速离心一次，得到DNA保存液。

（13）将DNA保存液置于-20℃保藏。

实施例2.现以正常人血液为例，非限定实施例叙述如下：

（1）取500ul冷冻的全血样本到2.0ml离心管里。离心管中加入1400ul的细胞洗涤液，颠倒混匀样本，常温孵育10min，期间偶尔颠倒混一下离心管。

（2）15000g转速离心1分钟，常温。

（3）弃上清，使管底残留细胞团25ul。

（4）重新震荡悬浮管内残留细胞团。

（5）向残留细胞团中依次加入15ul体积分数为10﹪的十二烷基硫酸钠SDS、15ul浓度为8M的醋酸铵、600ul浓度为5M的盐酸胍、3ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，60℃水浴20分钟。

（6）混合物冰浴冷却至常温，5℃下15000g rpm/min转速离心3min。

（7）取上清液，将上清液加入到置于2ml Eppendorf管中的纯化柱中，常温下孵化4min，盖上盖子，5000rpm/min离心1min，弃去滤出液。

（9）用硅胶膜洗涤液重复洗涤一次。

（13）将DNA保存液置于-20℃保藏。

实施例3.现以正常人血液为例，非限定实施例叙述如下：

（1）取500ul加入抗凝剂的全血样本到2.0ml离心管里。离心管中加入1400ul的细胞洗涤液，颠倒混匀样本，常温孵育10min，期间偶尔颠倒混一下离心管。

（2）16000g转速离心1分钟，常温。

（3）弃上清，使管底残留细胞团30ul。

（4）重新震荡悬浮管内残留细胞团。

（5）向残留细胞团中依次加入15ul体积分数为10﹪的十二烷基硫酸钠SDS、15ul浓度为8M的醋酸铵、600ul浓度为5M的盐酸胍、3ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，60℃水浴30分钟。

（6）混合物冰浴冷却至常温，8℃下16000g rpm/min转速离心2min。

（7）取上清液，将上清液加入到置于2ml Eppendorf管中的纯化柱中，常温下孵化5min，盖上盖子，5000rpm/min离心1min，弃去滤出液。

（9）用硅胶膜洗涤液重复洗涤一次。

（13）将DNA保存液置于-20℃保藏。

实施例1～3得到的DNA保存液经琼脂糖凝胶电泳检测，实施例1～3DNA保存液中的DNA片段长度均大于20Kb；该DNA保存液经紫外分光光度法测定，其纯度OD260/OD280比值均大于1.7，DNA浓度（ng/μL ）= OD260 × 50ng/μL均大于50ng/ul。

实施例1～3所用的细胞洗涤液为浓度为20mM的Tris-HCl溶液，pH值为7.6；硅胶膜洗涤液为10mM Tris-HCl、1mM乙二胺四乙酸EDTA、20mM NaCl、体积分数为50﹪乙醇的混合液。

实施例4.本发明提取的DNA片段具有较高的重复稳定性：

（1）对200例志愿者进行血液采集，得到200人的新鲜全血样本；

（2）对上述步骤（1）采集到的200人的新鲜全血样本分别进行DNA提取，具体操作与实施例1相同；

（3）将上述步骤（2）提取到的200人的DNA片段进行紫外分光光度法检测，测定260nm波长、280nm波长下的吸光度值，这200人的血液DNA模板纯度OD260/OD280比值均大于1.7，DNA浓度（ng/μL ）= OD260 × 50ng/μL均大于50ng/ul；对该200人的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，这200人的血液DNA模板长度均大于20Kb。

通过实施例4可知，根据本发明方法可一次快速提取即得到高质量的模板DNA，且在对EGFR第18、19、20、21号外显子的扩增中，所有提取的200人血液DNA模板均能成功进行扩增，得到的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测其长度为400～450bp，与预计片段大小相同的产物，对EGFR第18、19、20、21号外显子扩增产物进行测序，测序结果与NCBI基因数据库上的序列一致，也证实了本发明的可靠性。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims

1. 一种血液DNA的快速提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1).细胞裂解分离：

在全血样本中加入细胞洗涤液，其中全血样本与细胞洗涤液的体积比为5：14，颠倒混匀样本，常温孵育5～10min，常温下13000～16000g转速离心1分钟，弃上清，得到残留细胞团；

步骤(2).消化沉淀：

步骤(3).纯化：

将上述步骤(2)所得的DNA抽提液加入到2ml Eppendorf管中的纯化柱中，常温孵化2～5分钟，充分结合DNA，经纯化柱吸附后，离心分离，得到沉淀物；将沉淀物经硅胶膜洗涤液洗涤两次，离心分离，去除纯化柱中残存的硅胶膜洗涤液，得到洗涤后的沉淀物；然后再洗涤后的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解洗脱DNA后，离心分离，去除沉淀，得到含DNA的保存液。

2.如权利要求1所述的一种血液DNA的快速提取方法，其特征在于步骤(1)所述的细胞洗涤液为浓度为20mM的Tris-HCl溶液，pH值为7.6。

3.如权利要求1所述的一种血液DNA的快速提取方法，其特征在于步骤(3)所述的硅胶膜洗涤液为10mM Tris-HCl、1mM乙二胺四乙酸EDTA、20mM NaCl、体积分数为50﹪乙醇的混合液。