CN113832143B - 一种蓝果忍冬dna的提取方法 - Google Patents

一种蓝果忍冬dna的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蓝果忍冬DNA的提取方法。所述方法包括研磨提取、水浴、抽提、沉淀等步骤，其中，研磨提取和水浴过程中均采用了改进CTAB缓冲液，1L改进CTAB缓冲液是向CTAB缓冲液中加入2‑2.5g微溶物制备得到的。本发明一方面利用微溶物的吸附作用吸附掉蓝果忍冬样品中的色素、多酚、蛋白质等物质，另一方面利用玻璃珠来吸附蛋白质等大分子物质和提高抽提效率，因此，本发明提供了一种蓝果忍冬专用的DNA提取方法，所得DNA溶液纯度高、浓度高。

Description

一种蓝果忍冬DNA的提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蓝果忍冬DNA的提取方法。
背景技术
蓝果忍冬是忍冬科植物，其叶面为暗绿色，叶背为黄绿色，叶柄被为糙毛，花下垂。蓝果忍冬在7月份左右会结蓝色或者蓝黑色的果子。蓝果忍冬的果实中富含黄酮、多酚、有机酸、氨基酸、花青素、蛋白质以及多种微量元素，因此具有很高的营养价值和食用价值。因此，研究其生理生态特性、基因遗传特性等尤为必要。
基因组DNA的提取和扩增是进行植物遗传基因研究的主要手段，由于其操作已经较为成熟，所以被广泛应用。基因组DNA的提取最常见的方法就是CTAB法，其包括研磨、DNA提取、酶解、蛋白质降解等多个步骤，耗时也较长。但是由于不同DNA提取对象中所含物质的不同，许多学者针对自己的研究对象的特性，改进了CTAB法。比如“郑云柯,胡翔宇,宋希强,等.石斛属植物基因组DNA提取方法的对比[J].热带生物学报,2015,6(002):168-172”一文就研究了6种石斛属植物的DNA提取方法，根据其研究结果，由于石斛中多糖和多酚物质的干扰，不同方法呈现不同的提取结果，改良CTAB法与改良SDS法具有较高的DNA得率以及较高的抗干扰能力，改良PEX法具有较高的抗干扰能力。
就蓝果忍冬这个研究对象而言，由于蓝果忍冬的果实具有果皮和果肉两部分，其果皮易碎，果皮中富含的纤维素以及果皮果肉中富含多酚类物质，都会影响DNA的纯度，因此，需要开发一种针对蓝果忍冬的DNA提取方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种蓝果忍冬DNA的提取方法。
本发明的目的是提供一种蓝果忍冬DNA的提取方法，包括：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取捣碎物，向其中加入改进CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L改进CTAB缓冲液是向CTAB缓冲液中加入2-2.5g微溶物制备得到的，使用前充分混合；
S2，水浴：向研磨物中加入β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65±1℃水浴1-2h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液和0.5-1g的玻璃珠，反复混匀，11000-12000rpm离心10-15min，取上清；所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成的；
S4，沉淀：向S3的上清中加入异丙醇，混匀，冷冻条件下放置至少2h，11000-12000rpm离心10-15min，弃上清，用乙醇溶液清洗DNA沉淀，风干，用溶剂溶解DNA。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，所述微溶物为氢氧化钙、氢氧化镁中的一种或两种。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，所述捣碎物与改进CTAB提取液的用量比为1-2g:2-5mL。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，1L的CTAB缓冲液的配方为0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol KCl、10g CTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，β-巯基乙醇与捣碎物的比例为15-20μL:1-2g。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，S3中，玻璃珠的直径为0.8-1mm。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，S3中，混匀的方式为：将装有物料的容器反复上下颠倒，上下颠倒的次数为50-100次。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，S4中，冷冻条件下为-20℃。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，S4中，乙醇溶液的体积分数为70-75％。
优选的，上述蓝果忍冬DNA的提取方法，S4中，溶剂为ddH2O或者1×TE缓冲液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明一方面利用微溶物的吸附作用吸附掉蓝果忍冬样品中的色素、多酚等物质，另一方面，本发明选择的微溶物的添加量是略高于其溶解度的量，可以吸附并除去部分蛋白质，未溶解的物料与液氮研磨相配合，具有加速细胞破碎的效果。由于微溶物的微溶效果，其在水溶的溶解性不稳定，当蓝果忍冬样品在液氮和Tris-HCl、EDTA等成分的作用下，溶液的成分和极性在不断发生变化，则微溶物与溶液中物质分子间的范德华力大小也在发生着变化，易产生沉淀而与水分离，当微溶物从水从析出沉淀时，则可进一步清除溶于水的色素、多酚、蛋白质等大分子物质，且微溶物的溶解和析出固体的过程导致提取液的极性也发生变化，则捣碎的蓝果忍冬样品受到这种极性变化后，易析出DNA小分子，进而提高了最终DNA产品中的DNA浓度。
2、本发明在抽提的步骤中加入了玻璃珠，一方面是利用玻璃珠表面的空隙来吸附溶液中的蛋白质等大分子物质，另一方面，在反复颠倒混匀的过程中，玻璃珠具有震荡加速混合作用，其可使有机溶剂组成的抽提液与含DNA的水相物之间产生大量微泡，增加抽提液与水相的接触面积，则可使水相中的非DNA杂质溶入抽提液中，进而提高所提取的DNA的浓度和纯度。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
传统的CTAB法提取植物中DNA的步骤如下：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取2.00g捣碎物，向其中加入5ml CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L CTAB缓冲液采用常规的配方0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol NaCl、10g CTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0；
S2，水浴：将研磨物加入到EP离心管中，向研磨物中加入20μL的β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65℃水浴1h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液，所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成，将EP离心管上下反复颠倒混匀50次，12000rpm离心10min，取上清；
S4纯化：向S3的上清中加入等体积的纯化液，所述纯化液是由氯仿、异戊醇按照24:1的体积比例混合而成，将EP离心管再上下反复颠倒混匀50次，12000rpm离心10min，取上清；
S5，沉淀：向S4的上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置2h，12000rpm离心15min，弃上清，用体积分数75％乙醇清洗DNA沉淀，风干，用80μL ddH2O溶解DNA，溶液外观呈棕色，-20℃保存备用。
本发明对上述方法所提取的DNA溶液进行了纯度分析，纯度是紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，并计算OD260/OD280值、OD260/OD230值所得，每个实验做三个平行，取平均值。结果显示，OD260/OD280值为2.23，OD260/OD230值为1.95，这两组数据均不在本领域允许的较佳纯度值范围内。本发明还对上述方法所的DNA溶液浓度进行了测试，做三个平行，取平均值，结果显示，DNA浓度值为510.42ng/μL。
本发明提供了一种蓝果忍冬DNA的提取方法，解决了上述传统的CTAB法提取蓝过忍冬DNA时的缺陷，提高了DNA的纯度和浓度。具体包括以下实施例。
实施例1
一种蓝果忍冬DNA的提取方法，包括以下步骤：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取2.00g捣碎物，向其中加入5ml改进CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L改进CTAB缓冲液采用常规的配方0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol KCl、2g氢氧化钙、10g CTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0；
S2，水浴：将研磨物加入到EP离心管中，向研磨物中加入20μL的β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65℃水浴1h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液和直径0.8-1mm玻璃珠0.5g，所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成，将EP离心管上下反复颠倒混匀50次，12000rpm离心10min，取上清；
S4，沉淀：向S3的上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置2h，12000rpm离心15min，弃上清，用体积分数75％乙醇清洗DNA沉淀，风干，用80μL ddH2O溶解DNA，溶液外观呈透明状态，-20℃保存备用。
本实施例采用与传统CTAB法相同的测试方法，对所提取的DNA溶液进行了纯度和浓度分析，结果显示，OD260/OD280值为1.81，OD260/OD230值为2.12，这两组数据均在本领域允许的较佳纯度值范围内，DNA浓度值为918.11ng/μL。
实施例2
一种蓝果忍冬DNA的提取方法，包括以下步骤：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取1.00g捣碎物，向其中加入2ml改进CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L改进CTAB缓冲液采用常规的配方0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol KCl、2g氢氧化镁、10g CTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0；
S2，水浴：将研磨物加入到EP离心管中，向研磨物中加入15μL的β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65℃水浴1.5h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液和直径0.8-1mm玻璃珠0.5g，所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成，将EP离心管上下反复颠倒混匀70次，11000rpm离心15min，取上清；
S4，沉淀：向S3的上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置2h，11000rpm离心15min，弃上清，用体积分数70％乙醇清洗DNA沉淀，风干，用40μL 1×TE缓冲液溶解DNA，溶液外观呈透明状态，-20℃保存备用。
本实施例采用与传统CTAB法相同的测试方法，对所提取的DNA溶液进行了纯度和浓度分析，结果显示，OD260/OD280值为1.82，OD260/OD230值为2.11，这两组数据均在本领域允许的较佳纯度值范围内，DNA浓度值为461.02ng/μL。
实施例3
一种蓝果忍冬DNA的提取方法，包括以下步骤：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取2.00g捣碎物，向其中加入5ml改进CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L改进CTAB缓冲液采用常规的配方0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol KCl、1.25g氢氧化钙、1.25g氢氧化镁、10g CTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0；
S2，水浴：将研磨物加入到EP离心管中，向研磨物中加入15μL的β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65℃水浴2h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液和直径0.8-1mm玻璃珠1g，所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成，将EP离心管上下反复颠倒混匀100次，12000rpm离心15min，取上清；
S4，沉淀：向S3的上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置2h，12000rpm离心10min，弃上清，用体积分数75％乙醇清洗DNA沉淀，风干，用80μL ddH2O溶解DNA，溶液外观呈透明状态，-20℃保存备用。
本实施例采用与传统CTAB法相同的测试方法，对所提取的DNA溶液进行了纯度和浓度分析，结果显示，OD260/OD280值为1.83，OD260/OD230值为2.12，这两组数据均在本领域允许的较佳纯度值范围内，DNA浓度值为923.47ng/μL。
为了证明本发明的效果，我们进行了如下实验：
对照组1
一种蓝果忍冬DNA的提取方法，包括以下步骤：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取2.00g捣碎物，向其中加入5ml改进CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L改进CTAB缓冲液采用常规的配方0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol KCl、2g氢氧化钙、10g CTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0；
S2，水浴：将研磨物加入到EP离心管中，向研磨物中加入20μL的β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65℃水浴1h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液，所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成，将EP离心管上下反复颠倒混匀50次，12000rpm离心10min，取上清；
S4，沉淀：向S3的上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置2h，12000rpm离心15min，弃上清，用体积分数75％乙醇清洗DNA沉淀，风干，用80μL ddH2O溶解DNA，溶液外观呈透明状态，-20℃保存备用。
本实施例采用与传统CTAB法相同的测试方法，对所提取的DNA溶液进行了纯度和浓度分析，结果显示，OD260/OD280值为1.97，OD260/OD230值为2.03，这两组数据均在本领域允许的较佳纯度值范围内，DNA浓度值为842.12ng/μL。
对照组2
一种蓝果忍冬DNA的提取方法，包括以下步骤：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取2.00g捣碎物，向其中加入5ml CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L CTAB缓冲液采用常规的配方0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol KCl、10gCTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0；
S2，水浴：将研磨物加入到EP离心管中，向研磨物中加入20μL的β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65℃水浴1h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液和直径0.8-1mm玻璃珠0.5g，所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成，将EP离心管上下反复颠倒混匀50次，12000rpm离心10min，取上清；
S4，沉淀：向S3的上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置2h，12000rpm离心15min，弃上清，用体积分数75％乙醇清洗DNA沉淀，风干，用80μL ddH2O溶解DNA，溶液外观呈透明状态，-20℃保存备用。
本实施例采用与传统CTAB法相同的测试方法，对所提取的DNA溶液进行了纯度和浓度分析，结果显示，OD260/OD280值为1.99，OD260/OD230值为2.00，这两组数据均在本领域允许的较佳纯度值范围内，DNA浓度值为788.61ng/μL。
对照组3
一种蓝果忍冬DNA的提取方法，包括以下步骤：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取2.00g捣碎物，向其中加入5ml CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L CTAB缓冲液采用常规的配方0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol KCl、10gCTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0；
S2，水浴：将研磨物加入到EP离心管中，向研磨物中加入20μL的β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65℃水浴1h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液，所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成，将EP离心管上下反复颠倒混匀50次，12000rpm离心10min，取上清；
S4，沉淀：向S3的上清中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置2h，12000rpm离心15min，弃上清，用体积分数75％乙醇清洗DNA沉淀，风干，用80μL ddH2O溶解DNA，溶液外观呈透明状态，-20℃保存备用。
本实施例采用与传统CTAB法相同的测试方法，对所提取的DNA溶液进行了纯度和浓度分析，结果显示，OD260/OD280值为2.05，OD260/OD230值为2.12，这两组数据均在本领域允许的较佳纯度值范围内，DNA浓度值为557.85ng/μL。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种蓝果忍冬DNA的提取方法，其特征在于，包括：
S1，研磨提取：取蓝果忍冬果实，捣碎，然后取捣碎物，向其中加入改进CTAB提取液，混匀，再加入液氮研磨；
1L改进CTAB缓冲液是向CTAB缓冲液中加入2-2.5g微溶物制备得到的；
所述微溶物为氢氧化钙、氢氧化镁中的一种或两种；
S2，水浴：向研磨物中加入β-巯基乙醇，混匀，研磨物置于65±1℃水浴1-2h；
S3，抽提：向S2反应结束的物料中加入等体积的抽提液和0.5-1g的玻璃珠，混匀，11000-12000rpm离心10-15min，取上清；所述抽提液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照25:24:1的体积比例混合而成的；玻璃珠的直径为0.8-1mm；
S4，沉淀：向S3的上清中加入异丙醇，混匀，冷冻条件下放置至少2h，11000-12000rpm离心10-15min，弃上清，用乙醇溶液清洗DNA沉淀，风干，用溶剂溶解DNA。
2.根据权利要求1所述的蓝果忍冬DNA的提取方法，其特征在于，所述捣碎物与改进CTAB提取液的用量比为1-2g:2-5mL。
3.根据权利要求2所述的蓝果忍冬DNA的提取方法，其特征在于，1L的CTAB缓冲液的配方为0.1mol Tris-HCl、0.1mol EDTA、1.5mol KCl、10g CTAB，溶剂为双蒸水，pH调节至8.0。
4.根据权利要求3所述的蓝果忍冬DNA的提取方法，其特征在于，β-巯基乙醇与捣碎物的比例为15-20μL:1-2g。
5.根据权利要求1所述的蓝果忍冬DNA的提取方法，其特征在于，S3中，混匀的方式为：将装有物料的容器反复上下颠倒，上下颠倒的次数为50-100次。
6.根据权利要求5所述的蓝果忍冬DNA的提取方法，其特征在于，S4中，冷冻条件下为-20℃。
7.根据权利要求6所述的蓝果忍冬DNA的提取方法，其特征在于，S4中，乙醇溶液的体积分数为70-75％。
8.根据权利要求1所述的蓝果忍冬DNA的提取方法，其特征在于，S4中，溶剂为ddH2O或者1×TE缓冲液。
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"玻璃珠法提取基因组DNA";戈海泽 等;《天津医科大学学报》;第12卷(第2期);第313-314页 *

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