CN107841498B - 一种鸡全血简便快速dna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鸡全血简便快速DNA提取方法，其提取方法包括将鸡全血加入抗凝剂后，再加入裂解液中混合，于56～60℃水溶锅放置20～30min，加入分离液，于70～80℃水溶锅放置20～30min后离心，取上清液转移到另一EP管中，再加入析出液，离心，留沉淀，加入洗涤液后混匀，离心；小心弃上清，收集沉淀室温干燥，加入TB缓冲液，即得鸡DNA提取液。本发明提取的DNA纯度和DNA完整性都能达到试验要求，浓度和纯度优于现有试剂盒提取的DNA。结合在鸡分子育种方面的应用，可证明该方法是一种成本低，操作简单，环境友好型的DNA提取方法。

Description

一种鸡全血简便快速DNA提取方法

技术领域

本发明设计生物检测技术领域，具体涉及一种鸡全血简便快速DNA提取方法。

背景技术

20 世纪 50年代 Watson 和 Crick 提出 DNA 双螺旋模型以来，分子生物学获得空前的发展，动物分子育种在生产中的应用越来越多。基因组DNA的提取在动物分子育种中是一项基础、重要的技术，直接关系到基因检测的效果。目前，有关家禽基因组DNA的提取方法较多，如试剂盒法、盐析法、蛋白酶消化法、有机溶剂提取法等都有研究，但各种方法都存在一定的优、缺点。

酚-氯仿法是提取DNA最为经典的方法，其原理是利用有机溶剂苯酚的蛋白变性，抑制DNase作用，蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，合并含 DNA 的水相，再利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀 DNA。该法在鸡DNA提取上也有应用，研究者利用该法提取迪卡系白壳蛋鸡及褐壳蛋鸡祖代鸡外周抗凝血DNA,已公开的专利：一种提取家禽基因组DNA的方法（CN101768588A）和一种提取禽类全血DNA的方法（CN101748119A），在提取过程使用到有机溶剂Tris饱和酚/氯仿。有机溶剂提取方法的优点是提取的DNA 保持天然状态。该方法提取DNA的缺点是耗时比较长，约在21h；提取过程多次使用对人体有害的氯仿，苯酚等有机试剂，影响研究操作人的工作情绪；操作过程多次加入有机溶剂，步骤繁琐，提取的DNA中可能含有有机试剂，影响进一步的试验研究工作。

盐析法提取DNA的原理是利用蛋白质和核酸在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。研究者用不同禽类品种 (金定鸭、长乐灰鹅、象洞鸡和闽南火鸡)为试验材料，采用 4种不同方法从其全血中提取 DNA，比较不同方法的 DNA 提取效率。结果表明：由于品种之间 DNA 存在差异，DNA 的质量和产率也有显著差异，金定鸭全血 DNA用树脂法效果最佳；长乐灰鹅和闽南火鸡全血 DNA 用酚-氯仿法效果最佳；而盐析法是提取象洞鸡全血DNA的最佳方法。盐析法提取DNA优点，减少了有机溶剂的使用，减少了对环境和试验人员的伤害，缺点是提取DNA纯度差。

吸附法提取DNA是利用核酸的吸附特性来获取组织DNA的方法。该方法的步骤是首先进行细胞的裂解和核酸，蛋白分离（如去污剂SDS, TLS,蛋白酶等），混合液经过吸附材料（树脂，玻璃等材料），核酸被吸附收集，经过特定洗脱液，收集核酸保存。该方法有开发成试剂盒产品，专供提取DNA。如TIANGEN生产的血液基因组DNA提取试剂盒，采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取血液中的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。1 h内即可获得超纯的基因组DNA。该方法的优点，提取的速度快。缺点是成本高，每个样本提取材料成本约3.5元，常在小批量的科研试验研究中使用，大量的检测，如鸡的分子育种过程中，需要成千上万份的检测，成本较大。

加热煮沸法是利用DNA与蛋白的不同物理化学性质提取DNA，用加热法把细胞裂解，让基因组释放出来，冰浴后通过离心把细胞壁和一些蛋白离到管底,基因组会悬浮在上清中。研究者通过煮沸提取固始鸡和安卡鸡 F2 代抗凝血基因组 DNA，经核酸蛋白定量仪检测，DNA 的 OD₂₆₀ /OD₂₈₀达 1.77 ± 0.06，证明所提 DNA 质量较好，用于 PCR 扩增，也可以得到满意的扩增效果。但这种方法提取DNA，上清中还是存在一些蛋白的;煮沸的过程对DNA的完整性造成一定的损伤,在某些时候是会影响到PCR结果。该法对样本有选择性，鸡肉及凝集血等样本没见报道使用情况。

综上所述，急需一种实验操作简单，可重复性好、所用试剂安全、无毒，提取的速度快，提取纯度高，样本DNA提取成本低的综合有效的鸡血基因组DNA提取的方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术存在的问题，提供一种鸡全血简便快速DNA提取方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种鸡全血简便快速DNA提取方法，包括样本准备，样本裂解，样本分离DNA沉淀，DNA洗涤和制备DNA，具体制备步骤如下：

（1）样本准备：取鸡全血，加入抗凝剂，获得鸡抗凝血；

（2）样本裂解：将鸡抗凝血加入裂解液中混合，于56～60℃水溶锅放置20～30min，所述的鸡抗凝血与裂解液质量比为1：2.5，得鸡裂解血；

（3）样本分离DNA沉淀：将鸡裂解血加入分离液，于70～80℃水溶锅放置20～30min后，在4000 rpm离心机中离心分离10～15 min，取上清液转移到另一EP管中，得鸡分离血；

（4）DNA洗涤：在鸡分离血中加入析出液，于4000 rpm离心机中离心分离1～2 min，留沉淀，加入洗涤液后混匀，得鸡初级DNA提取液；

（5）制备DNA：将鸡初级DNA提取液于4000 rpm离心机中离心分离1～2 min；小心弃上清，收集沉淀室温干燥，加入TB缓冲液，即得鸡DNA提取液。

优选的，所述的抗凝剂为枸橼酸钠、Na₂EDTA·2H₂O或肝素钠。

优选的，所述的枸橼酸钠终浓度为0.38%，所述的Na₂EDTA·2H₂O浓度为1.5～2.2mg/mL，所述的肝素钠浓度为300~400单位/ml，采集血液，加入抗凝剂后，轻微晃动离心管，抗凝剂均匀接触血液；2～8 ℃备用或-20 ℃长期保存。

优选的，所述的裂解液为50mM Na2EDTA·2H2O、2% SDS、0.19M NaCl和蛋白酶 K终浓度0.4μg/μL。

优选的，其特征在于，所述的分离液为6M NaCl。

优选的，所述的析出液为90~95%乙醇。

优选的，所述的洗涤液为70% 乙醇和0.14 M NaCl。

优选的，所述的TB缓冲液由Tris、Na₂EDTA·2H₂O和硼酸组成，所述的Tris浓度为0.108g/ml，Na₂EDTA·2H₂O浓度为7.44×10^-3 g/ml，硼酸浓度为5.5×10^-2 g/ml。

优选的，所述的鸡DNA提取液在2～8 ℃备用或-20 ℃以下保存。

优选的，具体制备步骤如下：

（1）样本准备：取鸡全血，加入抗凝剂，获得鸡抗凝血；

（2）样本裂解：将100μL鸡抗凝血加入250μL裂解液中混匀，于56～60℃水溶锅放置20～30min，得鸡裂解血；

（3）样本分离DNA沉淀：将鸡裂解血加入600μL分离液，颠倒3～5次混匀，于70～80℃水溶锅放置20～30min后，在4000 rpm离心机中离心分离10～15 min，取200μL上清液转移到另一EP管中，得鸡分离血；

（4）DNA洗涤：在鸡分离血中加入400μL析出液，于4000 rpm离心机中离心分离1～2min，留沉淀，加入600μL洗涤液后上下颠倒3~5次混匀，得鸡初级DNA提取液；

（5）制备DNA：将鸡初级DNA提取液于4000 rpm离心机中离心分离1～2 min；弃上清，收集沉淀室温干燥，加入200μL TB缓冲液，即得鸡DNA提取液。

优选的，所述的室温干燥时间为5~10min。

分子生物学研究首要考虑的问题是核酸的提取，是非常关键的过程。提取纯化核酸可分为三步：第一步，细胞破碎、第二步，除去样本中的蛋白，与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质、除去其他杂质核酸，第三步，核酸的纯化。提取DNA的纯度和产量直接影响后续的试验和研究。如PCR扩增、酶切反应和分子克隆等试验。在 DNA 的提取过程中要应注意以下几个问题：

a.防止核酸酶对核酸的降解。细胞内的核酸酶活力很高，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中 DNA 酶需要金属二价离子 Mg²⁺、Ca²⁺的激活，因此使用 EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子，基本可以抑制 DNA 酶活性。

b. 防止核酸变性或破坏。化学因素(酸、碱等)和物理因素(高温或机械剪切，包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，以及 DNA 样本的反复冻贮等)引起核酸变性或破坏。制备 DNA 最重要的是要防止张力剪切作用，因为DNA 分子特别长，容易断裂。如长时间高温煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。

c.DNA纯化过程，DNA沉淀要易于观察，以便及时将丢失的 DNA 回收。

d.DNA提取过程避免使用有毒有害的有机溶剂。苯酚、氯仿和异丙醇等有机溶剂虽然在除去蛋白过程中有很大的用处，同时也对环境和实验人员有很大的伤害。

e.节约DNA提取成本，才能利于技术的应用和推广。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：

本发明的裂解液(50mM Na₂EDTA·2H₂O、2% SDS、0.19M NaCl)在裂解样本时，通过体积调整，使NaCl终浓度到0.14 M，与使用前加入蛋白酶 K，增加了裂解细胞和蛋白酶消化的作用效果。通过56～60℃水浴锅使得与DNA结合的蛋白更容易分离。本发明为了使蛋白变性，更易与DNA分离，使DNA提取纯度更纯和浓度更大，加入高浓度NaCl，并采用70～80℃水浴锅，替代常规需要使用有机溶剂进行DNA和蛋白的分离，同时避免了煮沸对DNA的损伤和降解。本发明解决了DNA提取过程需要使用中有机溶剂作为分离介质的问题，不会对试验室，操作人员和环境造成损害。本发明也简化了DNA提取的步骤和时间，提取的DNA不会有机溶剂污染的现象，提高了后续的DNA试验效果。本发明可以提取抗凝的鸡血、同样适用凝集的鸡血和已经溶血的鸡血样。

本发明没有使用氯仿，酚等有毒、有害的有机溶剂，而是通过高浓度的NaCl替代。使用SDS和温度控制技术，达到裂解细胞的目的，提取DNA的目的，同时又减少对DNA的损伤，也极大减少了提取DNA的成本。本发明提取的DNA，可以肉眼能够观察提取的效果，提高操作人员的感官享受，提高工作效率。本发明提取方法是一种对人员安全，环境友好的鸡血液基因组DNA提取方法。

本发明提取DNA需要约1 h，与现有的有关鸡血液DNA提取技术，其耗时都在6h以上，大大的减少了实验操作时间，且该方法DNA无降解，纯度和浓度方面都能满足试验要求。

本发明提取的DNA纯度和DNA完整性都能达到试验要求，浓度和纯度优于现有试剂盒提取的DNA。结合在鸡分子育种方面的应用，可证明该方法是一种成本低，操作简单，环境友好型的DNA提取方法。

附图说明

图1是本发明提取与试剂盒提取DNA琼脂糖电泳图；其中：1、2、3、4本发明方法提取，5、6、7、8试剂盒提取，M:DNA分子标准（2000bp）。

图2是以广西麻公鸡血液DNA的提取及GHR基因检测电泳图；其中，M:Marka D2000，1、2、3、4、5、6、8、9、10、12：不含 GHR基因缺失，7、11：含 GHR基因缺失。

图3是以绿壳蛋鸡全血基因组DNA的提取及SLCO1B3基因检测电泳图；其中，M.Marka D2000，1、2、4、5、8、9：含纯SLCO1B3基因，3、7、10、12：含杂SLCO1B3基因；6：不含SLCO1B3基因。

图4 是以广西黄公鸡血液基因组DNA的提取及TYR基因检测电泳图；其中，M.Marka2000，1、2、5、6、7、9、10、11、12：含TYR基因，3、4、8：不含TYR基因；“-”：阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1 本发明方法提取与试剂盒提的DNA比较

1.1 材料及试剂

广西矮脚三黄鸡母鸡与高脚公鸡杂交F1代公鸡；蛋白酶 K、无水乙醇、NaCl等购自南宁天地扬生物技术有限公司；TIANamp Blood DNA Kit试剂盒、购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 基因组 DNA 提取

选取3.8%枸橼酸钠，以抗凝剂：血液为1：9，采集4只F1代公鸡抗凝的血样，用以下二种方法分别提取DNA。

1.2.1 试剂盒法 按TIANamp Blood DNA Kit试剂盒方法进行，取 20 μL 抗凝血，加入20 μL Proteinase K溶液，混匀；加200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56 ℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮；加200 μL 无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000 rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500 μL已加入无水乙醇缓冲液GD, 12000 rpm，离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600 μL 已加入无水乙醇漂洗液PW，12000 rpm，离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复操作上步骤7；12000 rpm，离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100 μL 洗脱缓冲液TB，室温放置2～5min，12000 rpm，离心2 min，将溶液收集到离心管中（约1h）。

1.2.2 本发明方法提取DNA 取鸡抗凝血100μL，加入250μL裂解液(50mMNa₂EDTA·2H₂O、2% SDS、0.19M NaCl，使用前加入蛋白酶 K终浓度0.4μg/μL),颠倒3-5次，混匀，入56～60℃水浴锅30 min；加入600μL，6M NaCl，颠倒3～5次混匀，入70℃水浴锅30min；4000 rpm，10min，取上清200μL（含DNA）转移到另一新的1.5 mL EP管中，加入95% 乙醇400μL，颠倒3次；4000 rpm，2min，小心弃上清；加入600μL 70% 乙醇0.14 M NaCl、颠倒3～5次，4000 rpm,2min；小心弃弃上清，收集沉淀室温吹干，加入200μL TB缓冲液。

1.3 DNA样品纯度和浓度测量

紫外分光光度法：Nanno100微量分光光度仪测定, 读取260nm和280nm 的吸光度值A，计算DNA的含量，单位μg /mL，DNA 纯度以A260/A280 表示，纯度(A260/A280)应在标准的1.7～2.0之间。

1.4 DNA样品完整性测量

提取的DNA样本，经过浓度测量后，用TB液稀释成30～50ng/μL，取 6μL稀释后的DNA加入加 2μL 上样缓冲液，1%的琼脂糖电泳（含 GoldView 核酸染色剂，6μL/100mL），电压 110V，30min。在美国威泰克KETA G 凝胶成像系统下观察，拍照记录条带。

2 结果

2.1不同提取方法耗时和费用

二种DNA提取的方法综合来看，试剂盒法需要7个步骤的间断操作，提取DNA耗时约1h，费用约3～5元/样；本发明提取DNA需要6个步骤的间断操作，约1 h可提取DNA，费用约0.2元/样，过程简单，一般离心机就能满足需求。提取DNA试剂盒方法费用最高，高速离心机才能满足对转速的要求。综合来看，本发明费用低，步骤、设备要求简单。

2.2核酸蛋白定量仪检测结果

优质DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.7～2.0。核酸蛋白定量仪测定结果如表1所示，二种方法提取的鸡血基因组DNA的OD₂₆₀ /OD₂₈₀值都在1.7～2.0。数据结果用Excel进行浓度和纯度的单因素方差分析，试剂盒与本发明浓度和纯度比较，P值分别为0.0019和0.0062，差异显著。

表1 二种方法提取样本DNA的浓度、纯度及血液需要量

注：上表数据右上角字母表示，单因素方差分析结果P<0.05，差异显著。

本发明提取的DNA的OD₂₆₀ /OD₂₈₀值为1.847+0.063，DNA纯度最好。本发明与试剂盒法提取的DNA纯度和浓度上存在优势。

2.3 DNA样品完整性检测结果

两种方法分别提取4份鸡血液DNA，本发明提取分别标识1、2、3、4，试剂盒分别标识5、6、7、8；标识1、5是同份血样，2、6同份血样，3、7同份血样，4、8同份血样。提取DNA后稀释相似浓度，采用1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DNA条带。可见该法提取DNA 电泳DNA分子量大于2000pb，带最为致密，无明显降解；与试剂盒法无差异(见图 1)。

实施例2 广西麻公鸡的DNA提取及其GHR基因检测

一、试验材料和试剂

材料：本试验采样广西麻公鸡12只。

试剂：3.8%枸橼酸钠(称3.8g枸橼酸钠，加入90mL去离子水中，溶解后，定容到100mL，高压蒸汽灭菌，2～8℃冷藏、备用) ，裂解液（50mM Na₂EDTA·2H₂O、2% SDS、0.19MNaCl；使用前加入蛋白酶 K终浓度0.4μg/μL)，分离液，洗涤液，析出液，自配制，试剂为分析纯级别。

二、试验方法

1、模板制备

a)鸡翅膀静脉采集约900 μL全血，加入离心管（已加入3.8%枸橼酸钠抗凝剂100μL）中，盖上离心管盖，混匀，2～8℃冷藏备用。

b)打开离心管盖，取100μL采集的抗凝血，加到离心管（已加入250μL裂解液）中，盖上离心管盖，混匀；

c)盖严离心管盖子后，放入55～65℃水浴锅中，温育20～30min；

d)从水浴锅中取出离心管，打开盖子，加入600μL分离液，颠倒3～5次混匀，入80℃水浴锅30min；

e)离心管放入离心机中，4000 rpm，离心10min，打开离心管的盖子，取上层水相200μL（含DNA）转移到另一新的1.5 mL EP管中(该管中包含400μL析出液) ，盖严离心管的盖子，上下颠倒3次，离心管溶液中可发现有絮状析出物；

f)离心管放入离心机中，4000 rpm，离心1min，发现离心管的管底有白色或者淡黄色沉淀；

h)打开离心管的盖子，小心除去上清，留管底沉淀，再加入洗涤液600μL，盖严离心管盖，上下颠倒3次，轻弹离心管管底，让管底沉淀悬浮。

i)离心管放入离心机中，4000 rpm，离心1～2min ，依然可发现离心管的管底有白色或者淡黄色沉淀；

j)打开离心管的盖子，小心除去上清，留管底沉淀，室温干燥5 min后，加入200μLTB缓冲液，立即检测或～20℃保存。

2、DNA样品鉴定

紫外分光光度法：Nanno100微量分光光度仪测定, 读取260nm和280nm 的吸光度值A，计算DNA的含量，单位ng/μL，DNA 纯度以A 260 /A 280 表示，纯度(A 260/A280)应在标准的1.7～2.0之间。

3、PCR试验

PCR体系：2×taq PCR master mix 10μL，引物(10μM)各1μL，DNA 模板(100 ng /μL)2μL，最后加灭菌超纯水补足至20μL。

PCR引物：根据矮小型鸡GHR基因缺失区特性，利用Primer 5.0及Oligo6.0设计2对计引物。GHR1F:5’-TCCCAGACTACACTTCTATTCA-3’,GHR1R:5’-CGGGGACAGATCAAAGACAATAC-3’,GHR2F:5’-ACCTCCAAAGAAATCTGTCGAG-3’,GHR2R:5’-TGGCCAAATCCTGAAGTC CT-3’以上引物由上海生物工程技术有限公司合成。

PCR反应条件：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 35 s，72 ℃延伸30 s，34 个循环，72 ℃延伸 10 min，最后 4 ℃保存。PCR反应在威泰克 SEDI G ThermoCycler内进行。

4、PCR产物观察

用 2 %琼脂糖凝胶,取 5μL PCR产物上样, 在美国威泰克KETA G 凝胶成像系统下观察，拍照记录条带。

三、试验结果

1、DNA样品鉴定

核酸蛋白定量仪测定结果如表2所示，本发明法提取的DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.885+0.034，平均质量浓度840.354 ng/μL。说明本发明法提取鸡血基因组DNA的纯度和浓度都达到要求。

表2 本发明法提取样本数量、DNA的浓度、纯度及血液需要量

2、PCR产物

电泳图片(图2)显示获得的基因组DNA 进行PCR扩增，产物经2%琼脂糖电泳检测后见可见471，271bp两条相应的清晰、致密的条带，与DNA分子量标准相比，与预期片段大小，阳性对照一致。可见所提取的DNA均已达到分子生物学实验的要求。

实施例3 绿壳蛋鸡全血基因组DNA的提取及SLCO1B3基因检测

一、试验材料和试剂

材料：绿壳蛋公鸡12只。

试剂: Na₂EDTA·2H₂O(称1.5g,加入90mL去离子水中，溶解后，定容到100ml，高压蒸汽灭菌，2～8℃冷藏、备用) ，裂解液(同实施例2)

二、试验方法

1、模板制备

a)鸡翅膀静脉采集约900 μL全血，加入离心管（已加入1.5% Na₂EDTA·2H₂O钠抗凝剂100μL）中，盖上离心管盖，混匀，2～8℃冷藏备用。

b)以下制取DNA模板的步骤同实施例2。

2、DNA样品鉴定

紫外分光光度法：步骤同实施例2。

3、PCR试验

PCR体系：2×taq PCR master mix 10μL，引物(10μM)各1μL，DNA 模板(100 ng /μL)2μL，最后加灭菌超纯水补足至20μL。

PCR引物：根据鸡的绿壳性状是SLCO1B3基因特性确定，利用Primer 5.0及Oligo6.0设计3条引物。

SLCO1B3-F1:5’-TTTGACCAGCGTAGATAA-3’,SLCO1B3-R1:5’-ATGTTAGCAGTGTAGTTG-3’,SLCO1B3-R2:5’-TAGGTTCCGAACGCGATGT-3’以上引物由上海生物工程技术有限公司合成。

PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min； 95 ℃ 30 s， 58 ℃退火温度，30 s，72 ℃30 s，共计36个循环； 72 ℃延伸5 min， PCR扩增产物4 ℃保存待用。PCR反应在威泰克SEDI G Thermo Cycler内进行。

4、PCR产物观察

步骤同实施例2。

三、试验结果

1、DNA样品鉴定

核酸蛋白定量仪测定结果如表3所示，本发明法提取的DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.881+0.058，平均质量浓度538.195 ng/μL。说明本发明法提取鸡血基因组DNA的纯度和浓度都达到要求。

表3 本发明法提取样本数量、DNA的浓度、纯度及血液需要量

2、PCR产物

电泳图片(图3)显示获得的基因组DNA 进行PCR扩增，产物经2%琼脂糖电泳检测后见可见425bp，340bp两条相应的清晰、致密的条带，与DNA分子量标准相比，与预期片段大小，阳性对照一致。可见所提取的DNA均已达到。

实施例4广西黄公鸡血液基因组DNA的提取及TYR基因检测

一、试验材料和试剂

材料：广西黄公鸡12只。

试剂: 5mL肝素钠抗凝真空管，裂解液(同实施例2)

二、试验方法

1、模板制备

a)鸡翅膀静脉采集约2mL全血，打入肝素钠抗凝真空管，旋转混匀，2～8℃冷藏备用。

b) 打开真空管盖，取100μL采集的抗凝血，加到离心管（已加入200μL裂解液）中，盖上离心管盖，混匀；

c)以下DNA模板制备步骤同实施例2。

2、DNA样品鉴定

紫外分光光度法：同实施例2。

3、PCR

PCR体系：2×taq PCR master mix 10μL，引物(10μM)各1μL，DNA 模板(100 ng /μL)2μL，最后加灭菌超纯水补足至20μL。

PCR引物：根据鸡群隐性白基因是TYR基因特性确定，利用Primer 5.0及Oligo 6.0设计3条引物。TYR-8F:5’-CCTCTGGCTCTATTTGACTACACAGT-3’,TYR-8PR1:5’-CAAAACCATAAATAGCACTGGAAATAG-3’,TYR-8PR2:5’-TTGAGATACTGGAGGTCTTTAGAAATG-3’以上引物由上海生物工程技术有限公司合成。

PCR反应条件：95 ℃预变性 3 min； 95 ℃ 30 s，适宜退火温度 30 s，72 ℃ 1min，共计35个循环； 72 ℃延伸5 min， PCR扩增产物4 ℃保存待用。PCR反应在威泰克SEDI G Thermo Cycler内进行。

4、PCR产物观察

同实施例2。

三、试验结果

1、DNA样品鉴定

核酸蛋白定量仪测定结果如表4所示，本发明法提取的DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.766+0.098，平均质量浓度208.431 ng/μL。说明本发明法提取鸡血基因组DNA的纯度和浓度都达到要求。

表4本发明法提取样本数量、DNA的浓度、纯度及血液需要量

2、PCR产物

电泳图片(图4)显示获得的基因组DNA 进行PCR扩增，产物经2%琼脂糖电泳检测后见可见481bp、325bp两条相应的清晰、致密的条带，与DNA分子量标准相比，与预期片段大小，阳性对照一致。可见所提取的DNA均已达到分子生物学实验的要求。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。

Claims (7)

1.一种鸡全血简便快速DNA提取方法，包括样本准备，样本裂解，样本分离DNA沉淀，DNA洗涤和制备DNA，其特征在于，具体制备步骤如下：

（1）样本准备：取鸡全血，加入抗凝剂，获得鸡抗凝血；

（2）样本裂解：将鸡抗凝血加入裂解液中混合，于56～60℃水溶锅放置20～30min，所述的鸡抗凝血与裂解液质量比为1：2.5，得鸡裂解血；

（3）样本分离DNA沉淀：将鸡裂解血加入分离液，于70～80℃水溶锅放置20～30min后，在4000 rpm离心机中离心分离10～15 min，取上清液转移到另一EP管中，得鸡分离血；

（4）DNA洗涤：在鸡分离血中加入析出液，于4000 rpm离心机中离心分离1～2 min，留沉淀，加入洗涤液后混匀，得鸡初级DNA提取液；

（5）制备DNA：将鸡初级DNA提取液于4000 rpm离心机中离心分离1～2 min；弃上清，收集沉淀室温干燥，加入TB缓冲液，即得鸡DNA提取液；

所述的抗凝剂为枸橼酸钠、Na₂EDTA·2H₂O或肝素钠；所述的枸橼酸钠终浓度为0.38%，所述的Na₂EDTA·2H₂O浓度为1.5～2.2 mg/mL，所述的肝素钠浓度为300~400单位/ml；

所述的裂解液为50mM Na2EDTA·2H2O、2% SDS、0.19M NaCl和蛋白酶 K终浓度0.4μg/μL；

所述的分离液为6M NaCl。

2.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的析出液为90～95%乙醇。

3.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的洗涤液为70%乙醇和0.14 M NaCl。

4.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的TB缓冲液由Tris、Na₂EDTA·2H₂O和硼酸组成，所述的Tris浓度为0.108g/ml, Na₂EDTA·2H₂O浓度为7.44×10^-3 g/ml，硼酸浓度为5.5×10^-2 g/ml。

5.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的鸡DNA提取液在2～8 ℃备用或-20 ℃以下保存。

6.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，具体制备步骤如下：

（1）样本准备：取鸡全血，加入抗凝剂，获得鸡抗凝血；

（2）样本裂解：将100μL鸡抗凝血加入250μL裂解液中混匀，于56～60℃水溶锅放置20～30min，得鸡裂解血；

（3）样本分离DNA沉淀：将鸡裂解血加入600μL分离液，颠倒3～5次混匀，于70～80℃水溶锅放置20～30min后，在4000 rpm离心机中离心分离10～15 min，取200μL上清液转移到另一EP管中，得鸡分离血；

（4）DNA洗涤：在鸡分离血中加入400μL析出液，于4000 rpm离心机中离心分离1～2min，留沉淀，加入600μL洗涤液后上下颠倒3~5次混匀，得鸡初级DNA提取液；

（5）制备DNA：将鸡初级DNA提取液于4000 rpm离心机中离心分离1～2 min；弃上清，收集沉淀室温干燥，加入200μL TB缓冲液，即得鸡DNA提取液。

7.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的室温干燥时间为5~10min。

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