CN110982813B - 一种从曲料中提取丝状真菌总rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，包括步骤：1)预处理：筛选原料颗粒完整、饱满的固态发酵曲料样品，进行冷冻处理；2)初步研磨：将球状助研磨体加入步骤1)所得固态发酵曲料中，加入液氮并进行研磨，使曲料表面的菌体剥离脱落，同时保持曲料中原料颗粒完整；3)在初步研磨后，将原料颗粒除去，得到菌体混合物；4)充分研磨步骤3)所得菌体混合物，获得含菌体RNA的粉末料；5)向步骤4)所得粉末料中加入总RNA提取剂，提取总RNA，即得。本发明的方法适用于从曲料等复杂基质中提取丝状真菌的总RNA，该方法提取的丝状真菌总RNA纯度高、完整性好。

Description

一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法

技术领域

本发明涉及RNA提取技术领域，尤其是一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法。

背景技术

制曲是豆豉、酱油及豆酱发酵生产的必要过程，其中，酱油和豆酱的制曲过程是大豆、小麦等原材料在米曲霉、酱油曲霉等丝状真菌分泌的多种酶作用下被逐步降解的过程，其中米曲霉的使用最为广泛。在这个过程中，米曲霉分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，目前的研究集中于酶活等理化性质鉴定，但是对其深层分子机理和表达调控研究甚少，其中曲料中真菌总RNA的提取技术是分子机理和表达调控研究的基础。

现行的常规真菌总RNA提取方法主要包括CTAB法、热酚法、异硫氰酸胍法、Trizol法等，另外还可以使用柱离心法对RNA进行纯化。发明专利CN101638651B公布了一种改良Trizol法提取植物组织总RNA的方法，该方法特征在于用常规的Trizol法提取RNA后，加入氯仿/异戊醇再次抽提，并用异丙醇和醋酸钠沉淀RNA。该方法不适用于从曲料这种复杂基质中去除大豆、小麦大颗粒等成分，破碎菌丝细胞壁效率低，因此总RNA提取质量不佳。发明专利CN107267497B公布了一种通用型总RNA抽提试剂盒，改良的异硫氰酸胍法适用于植物根、果实等富含多酚、多糖的组织总RNA的提取，但是硅基质柱法无法满足曲料大培养体系抽提RNA的需要。

然而，常规的细胞总RNA提取方法不适用于曲料，曲料中总RNA难以提取的主要原因有三点：第一，对于固态发酵曲料而言，菌丝和孢子附着生长在曲料表面，常规提取方法难以实现分离及富集；第二，制曲过程中产生多种次级代谢产物，曲霉包含丰富的内源性RNase，导致提取过程有严重的RNA降解现象；第三，曲料中的丝状真菌的细胞壁结构包含几丁质、葡聚糖等难去除的多糖，RNA提取时能否有效的破壁严重影响RNA的提取质量。曲料中丝状真菌总RNA的提取尚未发展出成熟的技术，导致制曲基础研究的滞后。

从实验室水平的液体、固体培养基中提取RNA与从生产工艺水平的固态发酵曲料中提取RNA面临的困难有相似之处，也有很大区别。相同点在于：两者都必须将菌体与培养基质分离才能进行后续操作，其相似来自微生物培养体系的复杂性和现有核酸提取技术的原理限定；

不同点在于：实验室培养水平要分离菌体容易实现，从液体培养基中提取RNA可采用过滤法、而从固体培养基中提取RNA可采用直接刮取菌丝或用玻璃纸隔离，甚至改变培养介质和条件都能实现，而实验室培养体系下总RNA的提取方法不能直接套用在固态发酵曲料中真菌总RNA的提取，其原因有三：

1、生产工艺是固定的，不能改变制曲过程，只能从制备的成曲曲料着手；

2、RNA提取过程会改变RNA转录调控的状态，影响转录组测序的结果，最好的方式是原位处理提取，应避免使用复杂的前处理方法；

3、曲霉附着在曲料表面，虽然是好氧菌，但是其菌丝扎根向大豆内部生长，大豆、淀粉、菌体、孢子互相包裹粘黏，导致“去除培养基”成为主要的技术瓶颈。

CN101434630B、CN105779442B记载的方法准确描述应为“涡旋振荡+玻璃珠匀浆”。其核心在于利用高频振动破碎细胞，加入玻璃珠增加机械剪切力，如前所述，然而采用此类方法从固态发酵曲料中进行真菌总RNA的提取，不能获得合格的样品。

综上所述，现有的总RNA提取方法并不适用于从曲料这种复杂基质中提取RNA。固态发酵制曲的培养基质成分复杂，丝状真菌的菌丝和孢子难以被有效分离和富集，从源头上限制了曲料中丝状真菌总RNA的高质量(纯度高、完整性好)提取，因此，需要一种能有效富集菌丝与孢子方法，但是目前并没有技术能够有效克服该瓶颈。目前国内也没有从曲料中提取丝状真菌的总RNA提取方法的相关发明专利报道。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，该方法通过安全、迅速、简单的操作，从含有RNA的固态发酵曲料中选择性的提取高纯度、完整性好的丝状真菌总RNA。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，包括如下步骤：

1)预处理：

筛选原料颗粒完整、饱满的固态发酵曲料样品，进行冷冻处理；

2)初步研磨：

将球状助研磨体加入步骤1)所得固态发酵曲料中，加入液氮进行研磨，使曲料表面的菌体剥离脱落，同时保持曲料中原料颗粒完整；

其中，原料颗粒为固态发酵的常规原料，例如黄豆颗粒、黑豆颗粒、小麦颗粒等；

3)菌丝和孢子富集：

在初步研磨后，将所述原料颗粒除去，得到菌体混合物；

由此，达到富集菌丝和孢子的目的；

除去的方法为常规分离方法，优选为人工挑选除去；

4)获得含菌体RNA的粉末料：

充分研磨步骤3)所得菌体混合物，获得含菌体RNA的粉末料；

5)提取总RNA：

向步骤4)所得粉末料中加入总RNA提取剂，提取总RNA，即得。

需要说明的是，本申请的发明人前期通过直接液氮研磨、冻干、缓冲液洗涤、涡旋振荡、玻璃珠匀浆、液体裂解等方法进行样品前处理，然而得到的RNA质量都低于样品测序要求，或者说公开的RNA提取方法，包括经典核酸提取方法不能直接应用于固态发酵曲料中丝状真菌总RNA的提取，公开的提取方法例如中国授权专利CN100537590-RNA提取方法、RNA提取试剂及生物材料的分析方法中公开了从全血、血清、培养细胞等生物材料中提取总RNA的方法，直接将生物材料进行溶解如采用乳钵、超声波、微波、匀浆器等物理方法，或表面活性剂、蛋白变性剂等化学方法，或蛋白分解酶等生化方法以及上述组合方法进行，未公开如何将生物材料进行有效分离，而本专利申请中采用的物料为固态发酵曲料，固态发酵曲料由发酵大豆颗粒表面包裹着曲料小麦颗粒组成，即曲料小麦颗粒附着在发酵大豆颗粒表皮上，丝状真菌附着生长在固态发酵曲料表面，因为发酵大豆颗粒中含有的多糖、多酚等物质严重影响RNA的提取，并且发酵大豆颗粒的存在，在充分研磨时影响物料的充分破碎裂解。

本申请发明人通过对比发现，若将冷冻处理过的固态发酵曲料未经发酵大豆颗粒分离步骤，直接研磨获取含丝状真菌RNA物料，所获取的物料颗粒感强，在研磨破碎阶段无法实现物料充分的破碎裂解，最终导致提取的丝状真菌总RNA纯度低、完整性差，不能满足进一步的样品测序分析的需要，发酵大豆颗粒的存在直接影响了RNA的得率和质量，而采用本发明方法所获取的含丝状真菌RNA物料细腻，可很好的实现物料破碎裂解，提取的丝状真菌总RNA纯度高、完整性好，满足样品测序分析的需要，因此，曲料中丝状真菌RNA的提取首先需将固态发酵曲料中的发酵大豆颗粒进行分离。

优选地，所述步骤1)中曲料为豆豉、酱油或豆酱固态发酵所得曲料。

优选地，所述步骤1)中冷冻处理的温度为-75～-86℃，更优选为-80℃。

优选地，所述步骤1)中冷冻预处理2h以上。

优选地，所述步骤2)中单个球状助研磨体体积不超过单个曲料体积的1/1000。由此，球状助研磨体从曲料缝隙中滑落并平铺至曲料底部；将研磨棒置于球状助研磨体表面并轻轻移动研磨棒，研磨棒在移动过程中不离开球状助研磨体表面，与研磨体表面始终保持接触，固态发酵曲料散落在研磨棒的棒体周围，通过研磨棒的棒体移动促进固态发酵曲料颗粒之间发生摩擦、碰撞，从而使曲料表面的菌体剥离脱落。

优选地，所述步骤2)中球状助研磨体包括但不限于球体，还可以是椭圆球，更优选为玻璃珠，最优选为惰性玻璃珠。

优选地，所述步骤2)中球状助研磨体的总体积为曲料样品体积的8～12％，更优选为10％。

优选地，所述步骤2)中球状助研磨体的直径为0.3～0.8mm，更优选为0.5mm。需要说明的是，本发明在初步研磨的过程中使用球状助研磨体并非为了振荡剪切破碎效果，其作用详细说明如下：球状助研磨体分布在曲料的下方，能够有效吸收和缓冲研杵的作用力，很大程度的减缓研杵对大豆和小麦颗粒的冲击，但同时使研磨的接触面积变大，并能提供一定的摩擦力，足以让曲料表面受力，使菌体和孢子从曲料上剥离；同时能尽量保持曲料原料颗粒的完整，以便在初步研磨后去除，否则固态发酵曲料中的原料颗粒中的多糖和多酚等物质会严重影响RNA的提取。

优选地，所述步骤2)中，在研磨的同时持续加入液氮以保持低温。

优选地，所述步骤5)中总RNA提取剂包括但不限于Trizol试剂。

优选地，所述步骤5)中加入总RNA提取剂后，采用氯仿进行抽提、异丙醇沉淀RNA以及乙醇洗涤RNA。

综上所述，本发明的有益效果为：

1)本发明通过球状助研磨体初步研磨曲料后高效分离、富集曲料中的菌丝和孢子，降低曲料中其他基质对提取总RNA的影响；

2)本发明克服了提取过程中丝状真菌破壁后RNA易降解的瓶颈，抑制内源性RNase的活性，同时除去多糖、蛋白质及细胞壁残留；

3)本发明方法适用于从曲料等复杂基质中提取丝状真菌的总RNA，该方法提取的丝状真菌总RNA纯度高、完整性好。

附图说明

图1为实施例1酱油酿造的固态发酵曲料小量提取的RNA琼脂糖凝胶电泳图，其中，琼脂糖浓度为1％，缓冲液为1×TAE缓冲液；

图2为对比例1不使用玻璃珠研磨曲料小量提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳图，其中，琼脂糖浓度为1％，缓冲液为1×TAE缓冲液。

具体实施方式

在一些实施例中，本发明针对曲料体系的复杂组成，采用材料超低温冷冻预处理的方法，增加样品的硬度使之更容易研磨，并加入惰性玻璃珠助研磨，初步研磨将菌丝、孢子与大豆原材料分离，达到富集的效果；继续充分研磨菌体和孢子，使得丝状真菌细胞破碎，释放细胞内的核酸；Trizol含有异硫氰酸胍和饱和酚，能够迅速裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸等物质解聚得到释放，Trizol中的0.1％8-羟基喹啉可以抑制RNase，维持RNA的稳定性，与氯仿联用可增强抑制作用。

在一些实施例中，本发明以丝状真菌的曲料为材料，建立了一种适合用于从富含多糖、糖蛋白和内源性RNase的曲料基质中提取总RNA的方法，其中，曲料样品经过超低温冷冻前处理，在玻璃珠助研磨下，使用液氮研磨分离、富集菌丝和孢子，得到菌体粉末，在蛋白质变性剂抑制RNase作用条件下，采用了在酸性pH中RNA比DNA更容易进入水相的原理，用氯仿进行抽提去除DNA和蛋白质，并用异丙醇和乙醇沉淀RNA、去除多糖，得到RNA样品。

在一些实施例中，本发明提供了一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，包括步骤：称取制曲40小时的曲料约50g，-80℃放置冻结后转移到预冷的研钵中，加入0.5mm直径灭菌玻璃珠没过研钵底部，使用玻璃珠的总体积约为曲料体积的10％，单个玻璃珠体积不超过单个曲料体积的1/1000，用研杵研磨曲料进行初步处理，菌丝和孢子从曲料表面剥离脱落到液氮中，用液氮预冷的药匙将大颗粒的大豆和小麦颗粒挑出研钵，菌丝和孢子继续由玻璃珠助研磨直至成粉末状，该样品处理方法可有效去除曲料中的培养基质，提高菌丝、孢子的破壁效率；加入Trizol试剂破碎细胞，溶解细胞中的其他成分，抑制细胞RNase，解聚释放核酸等物质；加入氯仿离心后RNA进入水相，再利用异丙醇沉淀水相中的RNA，乙醇洗涤杂质，去除多糖，得到高质量、完整的RNA样品。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为体积浓度。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。

下面对本发明中涉及的主要试剂和前处理进行必要的介绍。

1.主要试剂

Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇(DEPC处理水配制)、RNase-free水【使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.1％(v/v)，过夜搅拌后高温加压灭菌】。

2.RNA提取实验前的准备

1)尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前用0.1DEPC水溶液在37℃下处理12小时，然后在120℃下加压灭菌30分钟。

2)使用的0.5mm玻璃珠要进行高温加压灭菌或酸性溶液浸泡处理。

3)使用的无菌水要用0.1％的DEPC处理后再进行高温加压灭菌。

4)使用一次性塑料手套、头套和口罩进行所有试剂配制和实验操作，避免RNase污染。

实施例1

本发明中从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法的一种实施例，包括如下步骤：

a)曲料样品前处理

1)称取制曲时间40小时的曲料(来自酱油酿造中固态发酵)50g，转移到超低温冰箱中冷冻，-80℃条件下放置4小时，冻结的样品变硬使得更易研磨；

2)将曲料转移到用液氮预冷的研钵中，除去样品中残留的水分；

b)曲料样品的研磨和匀浆

3)加入0.5mm直径的灭菌玻璃珠没过研钵底部，单个玻璃珠体积不超过单个曲料体积的1/1200，使用玻璃珠的总体积约为曲料体积的10％，用研杵研磨，期间不断加入液氮保持低温；

4)大豆表面的菌丝和孢子被分离，在液氮中沉降留在研钵中，将大豆和小麦大颗粒分离出研钵，留下大部分的菌丝、孢子与玻璃珠的接触面积变大，继续研磨直至样品成粉末状以充分破碎细胞；

需要说明的是：孢子在曲料的表面萌发成熟呈黄绿色，菌体附着在固态发酵曲料基质表面，一头向大豆内部生长，通过研磨达到两个效果：1、剥离曲料表面的菌体和孢子，浸泡在液氮中实现沉降；2、将大豆表面的物质分离后，大豆呈淡黄色，便于挑选去除大豆和小麦大颗粒。

5)称取样品粉末约3g转移至50mL离心管中，加入20mL Trizol试剂充分匀浆，室温静置5分钟；

6)在12000g和4℃的条件下离心5分钟，弃去沉淀，小心吸取上清液，转移到新的离心管中；

c)总RNA的提取

7)向样品匀浆液中加入5mL氯仿，涡旋振荡溶液呈乳白色，室温静置5分钟；

8)在12000g和4℃的条件下离心15分钟，吸取上清液转移到新的离心管中；

9)向上清液中加入20mL异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温下静置10分钟；

10)在12000g和4℃的条件下离心10分钟，离心管底部出现RNA沉淀；

d)RNA沉淀的清洗

11)弃去上清，加入20mL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管壁；

12)在7500g和4℃的条件下离心5分钟，弃去上清；

e)RNA的溶解

13)室温干燥沉淀8分钟，除去残留的乙醇，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

应用本实施例的方法，得到酱油酿造的固态发酵曲料的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳质量检测，电泳结果(参见图1)显示RNA完整性好，无蛋白质和酚污染，无明显降解现象。在紫外分光光度计上测定A260/A280的吸光度比值为1.96，28S条带的亮度约等于18S的2倍，满足转录组测序的样品检测需要。

实施例2

本发明中从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法的一种实施例，包括如下步骤：

a)曲料样品前处理

1)称取制曲时间30小时的曲料(来自豆豉酿造中固态发酵)60g，转移到超低温冰箱中冷冻，-75℃条件下放置5小时，冻结的样品变硬使得更易研磨；

2)将曲料转移到用液氮预冷的研钵中，除去样品中残留的水分；

b)曲料样品的研磨和匀浆

3)加入0.8mm直径的灭菌玻璃珠没过研钵底部，单个玻璃珠体积不超过单个曲料体积的1/1000，使用玻璃珠的总体积约为曲料体积的12％，用研杵研磨，期间不断加入液氮保持低温；

4)大豆表面的菌丝和孢子被分离，在液氮中沉降留在研钵中，使用液氮预冷的药匙将大豆和小麦颗粒挑出研钵，留下大部分的菌丝、孢子与玻璃珠的接触面积变大，继续研磨直至样品成粉末状以充分破碎细胞；

5)称取样品粉末2g转移至50mL离心管中，加入15mL Trizol试剂充分匀浆，室温静置7分钟；

6)在12000g和4℃的条件下离心3分钟，弃去沉淀，小心吸取上清液，转移到新的离心管中；

c)总RNA的提取

7)向样品匀浆液中加入7mL氯仿，涡旋振荡溶液呈乳白色，室温静置5分钟；

8)在12000g和4℃的条件下离心12分钟，吸取上清液转移到新的离心管中；

9)向上清液中加入25mL异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温下静置10分钟；

10)在12000g和4℃的条件下离心11分钟，离心管底部出现RNA沉淀；

d)RNA沉淀的清洗

11)弃去上清，加入18mL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管壁；

12)在7500g和4℃的条件下离心4分钟，弃去上清；

e)RNA的溶解

13)室温干燥沉淀7分钟，除去残留的乙醇，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

应用本实施例的方法，得到酱油酿造的固态发酵曲料的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳质量检测，电泳结果显示RNA完整性好，无蛋白质和酚污染，无明显降解现象。在紫外分光光度计上测定A260/A280的吸光度比值为1.99，28S条带的亮度约等于18S的2倍，满足转录组测序的样品检测需要。

实施例3

本发明中从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法的一种实施例，包括如下步骤：

a)曲料样品前处理

1)称取制曲时间50小时的曲料(来自豆酱酿造中固态发酵)40g，转移到超低温冰箱中冷冻，-86℃条件下放置3小时，冻结的样品变硬使得更易研磨；

2)将曲料转移到用液氮预冷的研钵中，除去样品中残留的水分；

b)曲料样品的研磨和匀浆

3)加入0.3mm直径的灭菌玻璃珠没过研钵底部，单个玻璃珠体积不超过单个曲料体积的1/1500，使用玻璃珠的总体积约为曲料体积的8％，用研杵研磨，期间不断加入液氮保持低温；

4)大豆表面的菌丝和孢子被分离，在液氮中沉降留在研钵中，使用液氮预冷的药匙将大豆和小麦大颗粒挑出研钵，留下大部分的菌丝、孢子与玻璃珠的接触面积变大，继续研磨直至样品成粉末状以充分破碎细胞；

5)称取样品粉末约4g转移至50mL离心管中，加入25mL Trizol试剂充分匀浆，室温静置3分钟；

6)在12000g和4℃的条件下离心7分钟，弃去沉淀，小心吸取上清液，转移到新的离心管中；

c)总RNA的提取

7)向样品匀浆液中加入9mL氯仿，涡旋振荡溶液呈乳白色，室温静置5分钟；

8)在12000g和4℃的条件下离心18分钟，吸取上清液转移到新的离心管中；

9)向上清液中加入30mL异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温下静置10分钟；

10)在12000g和4℃的条件下离心10分钟，离心管底部出现RNA沉淀；

d)RNA沉淀的清洗

11)弃去上清，加入23mL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管壁；

12)在7500g和4℃的条件下离心8分钟，弃去上清；

e)RNA的溶解

13)室温干燥沉淀10分钟，除去残留的乙醇，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

应用本实施例的方法，得到酱油酿造的固态发酵曲料的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳质量检测，电泳结果显示RNA完整性好，无蛋白质和酚污染，无明显降解现象。在紫外分光光度计上测定A260/A280的吸光度比值为2.01，28S条带的亮度约等于18S的2倍，满足转录组测序的样品检测需要。

对比例1不使用玻璃珠研磨曲料的总RNA提取方法

a)曲料样品前处理

1)称取制曲时间40小时的酱油固态发酵曲料50g，转移到超低温冰箱中冷冻，-80℃条件下放置4小时；

2)将曲料转移到用液氮预冷的研钵中，除去样品中残留的水分；

b)曲料样品的研磨和匀浆

3)直接用研杵研磨，期间不断加入液氮保持低温，直至样品成淡黄色粉末状；

4)称取样品粉末约3g转移至50mL离心管中，加入20mL Trizol试剂充分匀浆，室温静置5分钟；

5)在12000g和4℃条件下离心5分钟，小心吸取上清液，转移到新的离心管中；

c)总RNA的提取

6)向样品匀浆液中加入5mL氯仿，涡旋振荡溶液呈乳白色，室温静置5分钟；

7)在12000g和4℃的条件下离心15分钟，吸取上清液转移到新的离心管中；

8)向上清液中加入20mL异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温下静置10分钟；

9)在12000g和4℃的条件下离心10分钟，离心管底部出现RNA沉淀；

d)RNA沉淀的清洗

10)弃去上清，加入20mL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管壁；

11)在7500g和4℃的条件下离心5分钟，弃去上清；

e)RNA的溶解

12)室温干燥沉淀几分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

应用本对比例的方法，得到不使用玻璃珠研磨的固态发酵曲料的总RNA。本对比例实施过程中，由于没有加入玻璃珠直接液氮研磨曲料，有大量大豆、小麦颗粒碎片留在研磨体系中，经充分研磨最终粉末呈淡黄色。经琼脂糖凝胶电泳质量检测，电泳结果(参见图2)显示RNA的18S、28S两个条带清晰，但是有一定降解现象，18S条带的亮度大约是28S条带的2倍，不符合高质量RNA的28S：18S≈2:1的质量要求。在紫外分光光度计上测定A260/A280的吸光度比值为2.07。

可见，在不使用玻璃珠研磨的条件下，使用常规Trizol法从曲料这类复杂基质中提取总RNA极易降解，RNA质量较低。

本发明将实施例1与对比例1的过程及结果进行了比较，参见表1。

表1实施例1与对比例1过程及结果差异

需要说明的是，关于表1中RNA的质量，28S和18S是真核生物核糖体RNA的两个主要亚基，在体内含量较多。RNA提取过程中可能发生降解，降解成分子量较小的5S条带片段，28S/18S即为衡量提取的RNA完整性的指参考，如果28S/18S为1.8～2.0表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生。电泳条带上应是28S在上，18S在下，且亮度为28S是18S的两倍。吸光度值A260/A280＝1.9～2.2，以条带清晰不弥散、无降解、无拖尾为佳。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (14)

1.一种从曲料中提取丝状真菌总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）预处理：

筛选原料颗粒完整、饱满的固态发酵曲料样品，进行冷冻处理；

2）初步研磨：

将球状助研磨体加入步骤1）所得固态发酵曲料中，加入液氮并进行研磨，使曲料表面的菌体剥离脱落，同时保持曲料中原料颗粒完整；

3）在初步研磨后，将所述原料颗粒除去，得到菌体混合物；

4）充分研磨步骤3）所得菌体混合物，获得含菌体RNA的粉末料；

5）向步骤4）所得粉末料中加入总RNA提取剂，提取总RNA，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中曲料为豆豉、酱油或豆酱固态发酵所得曲料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中冷冻处理的温度为-75～-86℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中冷冻处理的温度为-80℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中冷冻预处理2h以上。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中单个球状助研磨体体积不超过单个曲料体积的1/1000。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中球状助研磨体为玻璃珠。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述玻璃珠为惰性玻璃珠。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中球状助研磨体的总体积为曲料样品体积的8～12%。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中球状助研磨体的总体积为曲料样品体积的10%。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中球状助研磨体的直径为0.3～0.8mm。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中球状助研磨体的直径为0.5mm。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中总RNA提取剂为Trizol试剂。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中加入总RNA提取剂后，采用氯仿进行抽提、异丙醇沉淀RNA以及乙醇洗涤RNA。

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