CN109810968B - 胰酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种胰酶的制备方法，其步骤为胰脏解冻，用含0.1~2%病毒灭活剂的75%乙醇浸泡1~6小时，灭活病毒，沥干清洗，预处理的胰脏磨浆后加入磷酸三钠以及低浓度有机溶剂，加钙盐激活提取；分离过滤除内毒素等杂质；沉淀；干燥、粉碎得到产品。本发明的含过氧乙酸的75%乙醇胰脏预处理工艺能够快速渗透动物组织，同时在提取过程中加入磷酸盐、钙盐激活剂，形成磷酸钙，能够除去内毒素，更加有效达到病毒灭活目的，工艺简洁容易操作，制备出的胰酶酶活力、收率不受影响，过氧乙酸残留符合要求，极大增强胰酶药物的安全性。

Description

胰酶的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种胰酶的制备方法。

背景技术

胰酶系各国药典收载的助消化药，是从动物胰脏中提取的多种酶的混合物，主要成分为胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶。胰酶主要用于消化不良，食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障碍，同时也适用于先天性胰功能不全、腹部手术和外伤胰腺切除导致的胰功能不全。此外，胰酶中含有多种活性物质，可以作为基础原料从中提取多种生化药品，如胰激肽酶原，弹性蛋白酶，门冬酰胺酶，糜蛋白酶，羧肽酶等，此外，胰酶还被广泛用于细胞培养以生产治疗用生物制品如单抗、细胞因子等，具有重大的工业价值。

由于胰酶来源于动物猪的提取物，其原料中存在病毒污染的风险，比如目前流行的非洲猪瘟病毒。FDA、CFDA、EMA等各国法规中均有明确规定，原料药的制备工艺必须进行病毒灭活和病毒安全评价。2006年，FDA出版Guidance for Industry on ExocrinePancreatic Insufficiency Drug Products，其中对胰酶产品的病毒安全性作出如下描述（1）制造商需要对其进行完整的病毒风险评估（2）按照ICH Q5A的要求验证生产工艺的病毒去除/灭活能力。

而现有技术中，胰酶的生产过程包括：胰脏磨浆、激活、低浓度有机溶剂提取、沉淀丙酮脱脂、烘干，由于制造工艺的限制，胰酶生产中的低浓度有机溶剂提取、丙酮脱脂和烘干条件很难灭活一些理化抵抗力较高的非脂包膜病毒如PPV（猪细小病毒）、PCV（猪圆环病毒）和HEV（戊型肝炎病毒），使得以胰酶作为API、细胞培养原料大大增加了病毒污染的风险。而传统的病毒灭活方法如强碱、高温加热、辐照均会对酶活产生较大的影响。

在专利“一种胰酶的制备方法（CN 108795920 A）”中，公开了用过氧化氢对猪胰浆进行充分搅拌处理，然后加入触媒分解的过氧化氢。上述用过氧化氢处理的方法中，由于处理过程中胰脏已经磨浆部分胰酶激活释放，过氧化氢对胰酶酶活性具有较大影响，同时该专利所用过氧化氢病毒灭活效果、能力范围具有一定的局限。

在专利“在生产胰酶制剂过程中减少或灭活病毒和微生物内容物的方法（CN107849552 A）”中，公开了单纯采用过氧乙酸预先处理猪胰腺，然后清洗去掉残留的过氧乙酸，并从经处理的腺体组织中提取胰酶。上述用过氧乙酸处理的方法中，虽然已经将胰脏切至2~5英寸细条，由于病毒是寄生于细胞内部，该专利所述的方法只能灭活腺体组织表面的微生物，对于细胞内部的病毒灭活效果十分有限，具有一定的缺陷，而且工艺中灭火病毒没有进行去除步骤，对产品有安全风险。

专利US 2011/0268844 A1中公开了用4000、5000或6000巴的超高压处理5分钟处理胰酶制剂以灭活病毒。该方法的缺陷是高压处理对某些病毒的灭活作用是不确定的，而且，超高压设备成本昂贵，生产费用高，在生产实践中基本是不可取的。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种病毒灭活效果好的胰酶制备方法，。

技术方案：本发明提供了一种胰酶的制备方法，包含以下步骤：（1）原料预处理：将新鲜或解冻后的完整或切成2~5英寸长条的胰腺原料，浸泡在含0.1~2%病毒灭活剂的75%乙醇中，2~15℃下浸泡1~6小时；（2）磨浆：将预处理后的胰腺原料磨成胰浆；（3）激活、提取：向胰浆中加入1~2倍浓度为20~30%、pH为3~4的的乙醇水溶液，并加入磷酸三钠搅拌1~2h，然后加入醋酸钙，10～15℃下反应提取3~6h，得提取液；（4）将所述提取液冷冻离心分离去除杂质，然后经沉淀、脱脂、干燥、粉碎制得胰酶。

优选地，所述病毒灭活剂为以下任意一种或其组合：过氧乙酸、过氧化氢、次氯酸钠、过碳酸盐、苯甲酸、丁酸过氧酸。

优选地，所述磷酸盐为磷酸钠盐、磷酸钾盐以及磷酸铵盐。

优选地，加入的所述磷酸盐的量为乙醇水溶液和胰浆总体积的0.5%~1.5%（w/v）。

优选地，在所述步骤（3）中，所述钙盐为醋酸钙或氯化钙。

优选地，加入的所述钙盐的量为乙醇水溶液和胰浆总体积的0.5%~1.5%（w/v）。

优选地，在所述步骤（4）中，胰酶沉淀的方法是：提取液冷冻离心得到乳悬液，0~5℃向乳悬液中加入乙醇至含75%乙醇浓度，沉淀，收集沉淀得到胰酶。

优选地，在所述步骤（4）中，胰酶脱脂的方法是：向上述胰酶沉淀中加入5倍量的丙酮，0~5℃下脱脂2~3次，脱脂沉淀装袋，用螺旋千斤顶压榨至袋内残留物呈块状且无水滴滴出为止，然后再加压 0.5～1小时，得胰酶块状物。

优选地，在所述步骤（4）中，胰酶干燥的条件为：维持真空压力500～750mmHg，温度35～45℃，干燥 12～ 24小时。

有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优势：

（1）胰腺原料采用含0.1%~2%病毒灭活剂（如过氧乙酸等）的75%乙醇浸泡处理，由于乙醇具有良好渗透性，使得病毒灭活剂（如过氧乙酸等）和乙醇能够渗透到胰腺细胞内部，有利于病毒灭活剂（如过氧乙酸等）和病毒的充分接触；同时由于75%乙醇对胰脏的自溶起到一定的抑制。因此，本发明在避免发生自溶后的胰脏中加入病毒灭活剂（如过氧乙酸等），从而可以灭活细胞内部的病毒，使得灭活效果更加彻底，同时尽可能避免胰酶活性受到影响。

（2）另外，虽然病毒灭活剂（如过氧乙酸等）和75%乙醇可以灭活病毒，为了提高胰酶产品安全性，应尽可能将灭活病毒、内毒素除去，因此本发明在提取过程中加入磷酸盐（磷酸三钠）和钙盐（醋酸钙）进行反应提取，离心分离除去大部分内毒素，从而可以避免胰酶中过多残留病毒。

（3）本发明中的沉淀、脱脂、干燥步骤采用低温下75%浓度乙醇沉淀、丙酮或乙醇脱水制备胰酶时能够去除残留病毒灭活剂（过氧乙酸等）等残留物。

综上，本发明的含病毒灭活剂的75%乙醇可以在较短时间内渗透至胰脏组织细胞内部和病毒充分接触，从而更有效达到病毒灭活的目的，另外，提取过程中加入磷酸盐和钙盐进行反应提取，经冷冻离心分离除去大部分内毒素，从而可以避免胰酶中过多残留病毒，极大的增强了药物的病毒安全性，使得胰酶产品可以符合各国药典和动物来源的生化药物法规方面的苛刻要求。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的介绍。

实施方式1：

胰酶的制备包括依次进行的如下步骤：

（1）鲜冻原料 ：25kg胰脏和十二指肠 ；

（2）原料预处理 ：将鲜冻的原料解冻，浸泡在50L含0.5%过氧乙酸的75%乙醇中，5℃下浸泡6小时，沥干清洗；

（3）磨浆：将预处理后胰脏原料磨成胰浆；

（4）激活、提取：向胰浆中加入50L的pH为3~4的、浓度为25%的乙醇水溶液，按体积加入250g的磷酸三钠，搅拌2小时后，加入250g的醋酸钙，在温度为10～15℃下搅拌反应提取6小时；

（5）沉淀：提取液冷冻离心分离取出杂质，收集胰脏提取离心液，离心液加入乙醇至含75%乙醇浓度，沉淀胰酶，离心收集沉淀；

（6）脱脂干燥：上述沉淀加入5倍量的丙酮0~5℃下脱脂3小时，脱脂沉淀装袋用螺旋千斤顶压榨至袋内残留物呈块状且无水滴滴出为止，得胰酶块状物；干燥条件为：维持真空压力500～750mmHg，温度35～45℃，干燥12～24小时；

（7）粉碎 ：将干燥的胰酶用除尘粉碎机粉碎成胰酶粉。

实验数据证明，胰酶收率达到12%，其主要指标胰蛋白酶含量4000u/g , 胰淀粉酶120000u/g，胰脂肪酶含量50000u/g，细菌内毒素小于0.5EU/mg。

实施方式2：

（1）鲜冻原料：25kg胰脏和十二指肠 ；

（2）原料预处理：将鲜冻的原料解冻，浸泡在50L含1%过氧乙酸的75%乙醇中，5℃下浸泡6小时，沥干清洗；

（3）磨浆：将预处理后胰脏原料磨成胰浆；

（4）激活、提取：向胰浆中加入50L的pH为3~4的、浓度为25%的乙醇水溶液，按体积加入500g的磷酸三钠，搅拌2小时，加入500g的醋酸钙，在温度为10～15℃下搅拌反应提取6小时；

（5）沉淀：提取液冷冻离心，收集胰脏提取离心液，离心液加入乙醇至含75%乙醇浓度，沉淀胰酶，离心收集沉淀；

（6）脱脂干燥：上述沉淀加入5倍量的丙酮0~5℃下脱脂3小时，脱脂沉淀装袋用螺旋千斤顶压榨至袋内残留物呈块状且无水滴滴出为止，得胰酶块状物； 干燥条件为：维持真空压力500～750mmHg，温度35～45℃，干燥12～24小时；

（7）粉碎：将干燥的胰酶用除尘粉碎机粉碎成胰酶粉。

实验数据证明，胰酶收率达到12%，其主要指标胰蛋白酶含量4000u/g，胰淀粉酶120000u/g，胰脂肪酶含量50000u/g，细菌内毒素小于0.3EU/mg。

实施方式3：

（1）鲜冻原料：25kg胰脏和十二指肠；

（2）原料预处理：将鲜冻的原料解冻，浸泡在50L含1.5%过氧乙酸的75%乙醇中，5℃下浸泡6小时，沥干清洗；

（3）磨浆：预处理后胰脏原料磨成胰浆；

（4）激活、提取：向胰浆中加入50L的pH为3~4的、浓度为25%的乙醇水溶液，按体积加入750g的磷酸三钠，搅拌2小时，加入750g的醋酸钙，温度10～15℃，搅拌反应提取6小时；

（5）沉淀：提取液冷冻离心，收集胰脏提取离心液，离心液加入乙醇至含75%乙醇浓度，沉淀胰酶，离心收集沉淀；

（6）脱脂干燥：上述沉淀加入5倍量的丙酮0~5℃下脱脂3小时，脱脂沉淀装袋用螺旋千斤顶压榨至袋内残留物呈块状且无水滴滴出为止，得胰酶块状物；干燥条件为：维持真空压力500～750mmHg，温度35～45℃，干燥12～24小时；

（7）粉碎：将干燥的胰酶用除尘粉碎机粉碎成胰酶粉。

实验数据证明，胰酶收率达到12%，其主要指标胰蛋白酶含量3800u/g，胰淀粉酶110000u/g，胰脂肪酶含量48000u/g，细菌内毒素小于0.2EU/mg。

上述各实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种胰酶的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）原料预处理：将新鲜或解冻后的完整或切成2~5英寸长条的胰腺原料，浸泡在含0.1~2%病毒灭活剂的75%乙醇中，2~15℃下浸泡1~6小时；所述病毒灭活剂为以下任意一种或其组合：过氧乙酸、过氧化氢、次氯酸钠、过碳酸盐、苯甲酸、丁酸过氧酸；

（2）磨浆：将预处理后的胰腺原料磨成胰浆；

（3）激活、提取：向胰浆中加入1~2倍浓度为20~30%、pH为3~4的的乙醇水溶液，并加入磷酸盐搅拌1~2h，然后加入钙盐，10～15℃下反应提取3~6h，得提取液；

（4）将所述提取液冷冻离心分离去除杂质，然后经沉淀、脱脂、干燥、粉碎制得胰酶。

2.根据权利要求 1 所述的胰酶的制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，所述磷酸盐为磷酸钠盐、磷酸钾盐以及磷酸铵盐。

3.根据权利要求 2所述的胰酶的制备方法，其特征在于，加入的所述磷酸盐的量为乙醇水溶液和胰浆总体积的0.5%~1.5%。

4.根据权利要求 1 所述的胰酶的制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，所述钙盐为醋酸钙或氯化钙。

5.根据权利要求 4所述的胰酶的制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，加入的所述钙盐的量为乙醇水溶液和胰浆总体积的0.5%~1.5%。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的胰酶的制备方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，胰酶沉淀的方法是：提取液冷冻离心得到乳悬液，0~5℃向乳悬液中加入乙醇至含75%乙醇浓度，沉淀，收集沉淀得到胰酶。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的胰酶的制备方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，胰酶脱脂的方法是：向上述胰酶沉淀中加入5倍量的丙酮，0~5℃下脱脂2~3次，脱脂沉淀装袋，用螺旋千斤顶压榨至袋内残留物呈块状且无水滴滴出为止，然后再加压 0.5～1小时，得胰酶块状物。

8.根据权利要求 1 至5中任一项所述的胰酶的制备方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，胰酶干燥的条件为 ：维持真空压力500～750mmHg，温度35～45℃，干燥 12～ 24小时。

9.根据权利要求 1 至5中任一项所述的胰酶的制备方法，其特征在于，所述胰腺原料为胰脏和/或十二指肠。