CN112080487B - 一种羊胰酶制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种羊胰酶制备方法,包括如下步骤:一、将冷冻羊胰脏解冻绞碎得胰浆糊状物;二、先向胰浆糊状物中加入CaCl2、NaCl、异丙醇,20℃下温育24h;然后再加入异丙醇后在20℃下温育48h;三、将第二步骤孵育后的胰浆糊状物与1.5~3倍体积的50mM NaCl溶液混合,加入淀粉,在15℃‑20℃下温和搅拌3小时,然后离心除去组织和杂块得胰酶清液;四、将胰酶清液超滤浓缩,温度15‑20℃下,超滤膜的最大分子截留值为5‑30 KDa;五、将超滤浓缩后的胰酶溶液与石油醚混合脱脂;分液后真空干燥处理胰酶浓缩物;六、喷雾干燥制得羊胰酶粉末。本发明的优点在于:降低胰酶制备的成本,减少有机溶剂使用,提高酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及羊胰酶制备方法。
背景技术
胰酶(Pancreatin),为助消化药,主要从动物的胰脏提取制备得到。胰酶的制备步骤主要包括:将动物胰脏破碎、激活提取、沉淀、脱脂和干燥。胰酶含有胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶等水解酶类活力,其主要用作治疗消化不良、食欲不振及肝、胰脏疾病引起的消化障碍的助消化药物。
目前国内外市场上的胰酶,大多是从猪胰脏提取制备的,缺少用于清真市场的牛、羊胰酶。在传统的胰酶提取工艺中,需使用大量的有机溶剂,其中10-20%用于提取、70-80%用于沉淀,这些有机溶剂包括乙醇、丙酮、异丙醇等。大量使用有机溶剂不仅在管理和安全上存在风险,还会导致胰酶制备的成本高昂。因此,急需开发一种能大大减少有机溶剂使用量的胰酶制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羊胰酶制备方法,其步骤简单,能有效减少有机溶剂的使用量。
为解决上述技术问题,本发明的解决方案包括:一种羊胰酶制备方法,包括如下步骤:
一、胰浆制备:将冷冻羊胰脏解冻并绞碎得胰浆糊状物;
二、孵育:先向胰浆糊状物中加入CaCl2、NaCl、异丙醇,20℃下温育24h;然后再加入异丙醇后在20℃下温育48h。异丙醇属于粘度降低剂,其能有效降低DNA浓度,从而有效减少胰脏粘膜的粘度。粘度降低剂也可采用丙酮、乙醇。
三、提取分离:将第二步骤孵育后的胰液与1.5~3倍体积的50mM NaCl溶液混合,加入淀粉,在15℃-20℃下温和搅拌3小时,然后离心除去组织和杂块得胰酶清液。淀粉有保持酶稳定性的作用,属于酶稳定剂。淀粉能稳定胰脏的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。
四、超滤浓缩:将胰酶清液超滤浓缩,温度15-20℃下,超滤膜的最大分子截留值为5-30 KDa。采用超滤膜进行浓缩,其相较于传统的采用大量有机溶剂沉淀来进行制备的方法相比,其优点在于:极大地减少了有机溶剂的使用量,从而极大地降低了胰酶制备成本,同时也能有效避免酶活性损失。
五、脱脂:将超滤浓缩后的胰酶溶液与石油醚混合脱脂;分液后真空干燥处理胰酶浓缩物,以除去残留的石油醚。萃取脱脂使用的有机溶剂通常还有甲基叔丁醚,正庚烷。
六、干燥:脱脂后的胰酶浓缩物干燥制得羊胰酶粉末。
进一步地,前述的羊胰酶制备方法,其中,第二步的孵育步骤中,先向胰浆中加入CaCl2、NaCl和异丙醇,CaCl2的加入量为胰浆质量的0.5%~2%,NaCl的加入量为胰浆质量的0.1%~1%,异丙醇的加入量为胰浆质量的10%,20℃下温育24h;然后再加入异丙醇,异丙醇的加入量为胰浆质量的15%,在20℃下温育48h。
进一步地,前述的羊胰酶制备方法,其中,第五步的脱脂步骤中,石油醚的加入量为超滤浓缩后的胰酶溶液体积的1.0~2.0倍。
进一步地,前述的羊胰酶制备方法,其中,第六步的干燥步骤中,采用喷雾干燥法,进行干燥。
进一步地,前述的羊胰酶制备方法,其中,第三步的提取分离步骤中,淀粉的加入量为胰浆糊状物质量的0.01%-1%,优选1%。
更进一步地,前述的羊胰酶制备方法,其中,第五步的脱脂步骤中,将超滤浓缩后的胰酶溶液与石油醚混合脱脂一次,时间60分钟,温度控制在15℃-20℃。
更进一步地,前述的羊胰酶制备方法,其中,第四步骤中,超滤膜的最大分子截留值为30 KDa。
本发明优点在于:一、提供了一种新的羊胰酶制备方法,通过使用超滤浓缩和喷雾干燥步骤,与传统的使用高浓度有机溶剂沉淀的方法相比,其不仅能有效减少有机溶剂的使用,还能有效避免酶活性的显著损失。二、羊胰脏为屠宰业中常见的下水废料,几无用处,利用羊胰脏制备胰酶,除了能大大提高经济价值外,还能减少废弃物的排放,更为环保。
具体实施方式
下面通过具体实施例对羊胰酶制备方法做详细说明。
实施例一:羊胰酶制备方法,包括以下步骤:
一、胰浆制备:1Kg冷冻的羊胰脏解冻并用绞肉机绞碎得胰浆糊状物。
二、孵育:向胰浆糊状物中加入6g CaCl2、5g NaCl和100mL异丙醇,20℃下温育24h。再加入150mL异丙醇然后将20℃下温育48h。
三、提取分离:将孵育后的胰浆糊状物与2L pH值为6.0的50mM NaCl溶液混合。将10g 淀粉加入胰浆糊状物中继续温育,温和搅拌3小时,温度为15-20℃。然后将胰液离心除去组织和杂块,得到3L的胰酶清液。
四、超滤浓缩:胰酶清液经30KDa超滤膜进行超滤浓缩,超滤在120分钟内完成,回收浓缩液0.5L。
五、脱脂:加入800mL石油醚混合脱脂,分液,羊胰酶浓缩液抽真空30分钟,去除残余石油醚。
六:转移羊胰酶浓缩液,喷雾干燥得到150g羊胰酶粉。
胰酶回收:150g
蛋白酶活性:104 USP.U/mg
淀粉酶活性:108 USP.U/mg
脂肪酶活性:12.8 USP.U/mg
干燥失重:2.0 %。
实施例二:羊胰酶制备方法,包括以下步骤:
一、胰浆制备:20 Kg冷冻的羊胰脏解冻并用绞肉机绞碎得胰浆糊状物。
二、孵育:向胰浆糊状物中加入200g CaCl2、80g NaCl和2000mL异丙醇20℃下温育24h。再加入3000mL异丙醇,然后将20℃下温育48h。
三、提取分离:将孵育后的胰浆糊状物与40L pH值为6.0的50mM NaCl溶液混合。将200g淀粉加入胰液中继续温育,温和搅拌3小时,温度为15-20℃。然后将胰浆糊状物离心除去组织和杂块,得到60L的胰酶清液。
四、超滤浓缩:胰酶清液经30KDa超滤膜进行超滤浓缩,超滤在120分钟内完成,回收浓缩液12L。
五、脱脂;加入18L石油醚混合脱脂,分液,羊胰酶浓缩液抽真空30分钟,去除残余石油醚。
六、转移羊胰酶浓缩液,喷雾干燥,进口温度200℃,出口温度~70℃,得到3.12Kg羊胰酶粉。
胰酶回收:3.12 Kg
蛋白酶活性:106 USP.U/mg
淀粉酶活性:103 USP.U/mg
脂肪酶活性:8.7 USP.U/mg
干燥失重:5.3% 。
实施例三:羊胰酶制备方法,包括以下步骤:
一、胰浆制备:将200Kg冷冻的羊胰脏部分解冻并用绞肉机绞碎得胰浆糊状物。
二、孵育:向胰浆糊状物中加入2Kg CaCl2、2Kg NaCl和20 L异丙醇20℃下温育24h。再加入30 L异丙醇然后将20℃下温育48h。
三、提取分离:将孵育后的胰浆糊状物与400 L pH值为6.0的50mM NaCl溶液混合。将2Kg淀粉加入胰浆糊状物中继续温育,温和搅拌3小时,温度为15-20℃。然后将胰浆糊状物离心除去组织和杂块,得到600 L的胰酶清液。
四、超滤浓缩:胰酶清液经10KDa超滤膜进行超滤浓缩,超滤在150分钟内完成,回收浓缩液160 L。
五、脱脂;加入200 L石油醚混合脱脂,分液,羊胰酶浓缩液抽真空30分钟,去除残余石油醚。
六、转移羊胰酶浓缩液,喷雾干燥得到28 Kg羊胰酶粉。
胰酶回收:28 Kg
蛋白酶活性:98 USP.U/mg
淀粉酶活性:100 USP.U/mg
脂肪酶活性:6.6USP.U/mg
干燥失重:3.7%。
本发明优点在于:一、提供了一种新的羊胰酶制备方法,通过使用超滤浓缩和喷雾干燥步骤,与传统的使用高浓度有机溶剂沉淀的方法相比,其不仅能有效减少有机溶剂的使用,还能有效避免酶活性的显著损失。二、羊胰脏为屠宰业中常见的下水废料,几无用处,利用羊胰脏制备胰酶,除了能大大提高经济价值外,还能减少废弃物的排放,更为环保。
Claims (3)
1.一种羊胰酶制备方法,包括如下步骤:
一、胰浆制备:将冷冻羊胰脏解冻并绞碎得胰浆糊状物;
二、孵育:先向胰浆糊状物中加入CaCl2、NaCl和异丙醇,CaCl2的加入量为胰浆质量的0.5%~2%,NaCl的加入量为胰浆质量的0.1%~1%,异丙醇的加入量为胰浆质量的10%,20℃下温育24h;然后再加入异丙醇,异丙醇的加入量为胰浆质量的15%,在20℃下温育48h;
三、提取分离:将第二步骤孵育后的胰浆糊状物与1.5~3倍体积的50mM NaCl溶液混合,加入淀粉,在15℃ -20℃下温和搅拌3小时,然后离心除去组织和杂块得胰酶清液;淀粉的加入量为胰浆糊状物质量的1%;
四、超滤浓缩:将胰酶清液超滤浓缩,温度15-20℃下,超滤膜的最大分子截留值为5-30KDa;
五、脱脂:将超滤浓缩后的胰酶溶液与石油醚混合脱脂;分液后真空干燥处理胰酶浓缩物,以除去残留的石油醚;石油醚的加入量为超滤浓缩后的胰酶溶液体积的1.0~2.0倍;
六、干燥:脱脂后的胰酶浓缩物采用喷雾干燥法,进行干燥,制得羊胰酶粉末。
2.根据权利要求1所述的羊胰酶制备方法,其特征在于:第五步的脱脂步骤中,将超滤浓缩后的胰酶溶液与石油醚混合脱脂一次,时间60分钟,温度控制在15℃-20℃。
3.根据权利要求1或2所述的羊胰酶制备方法,其特征在于:第四步骤中,超滤膜的最大分子截留值为30 KDa。
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牛羊胰酶提取、胰蛋白酶纯化及其酶学特性研究;李君兰;中国博士学位论文全文数据库(电子期刊);B018-5 * |
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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