CN113817035A - 一种从白酒酒槽中分级提取高粱谷蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从白酒酒槽中分级提取高粱谷蛋白的方法，包括如下步骤：1)将冷冻酒槽解冻后，依次进行干燥、粉碎、过筛、除脂、脉冲电场破壁和除糖处理；2)在步骤1)所得物中分别提取高粱清蛋白和高粱球蛋白、高粱醇溶蛋白、高粱谷蛋白；3)利用超滤和凝胶色谱法对所述高粱谷蛋白进行纯化，完成提取。该方法具有新型非热、无害、环保的特点。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物中功能性成分的有效提取领域。更具体地，涉及一种从白酒酒槽中分级提取高粱谷蛋白的方法。
背景技术
白酒是我国的国酒，具有悠久的历史。在我国白酒的生产量和消费量具有很高的比重。白酒在国民经济中有着非常重要的地位，与人民的生活息息相关。在白酒的生产过程中，通常以高粱作为单一原料或结合其他粮食如大米、小麦、玉米、小米、糯米等混合后共同发酵形成酒醅，并在高温条件下进行蒸馏取酒。自新中国成产之后，中国白酒产业发展迅速，年产量逐年增加。然而，白酒生产后带来的副产物也成比增加。对于副产物的处理也成为了迫在眉睫的问题。酒糟是白酒蒸馏后的固体副产物，目前主要用于牲畜饲料。考虑到其中较高的蛋白含量，对酒糟中的蛋白(以高粱蛋白为主)进行提取并加以利用可以在一定程度上提升酒糟的使用价值。
在国内，对酒糟中蛋白的再利用也有一定研究，如中国专利CN201911205845中公开了一种酒糟小分子肽用于调味酒的制备方法，综合利用和提取酒糟中水溶性蛋白质，选择关键蛋白酶水解蛋白质为小分子肽，经过活性肽膜过滤等纯化过程制备了小分子肽，用于调味酒中。申请号为CN201711204678的专利利用酒糟制备小分子肽并将其用于护肤品中，步骤包括真空挤压膨化、粉碎、过筛、蛋白提取、酶解蛋白和纯化等。然而，目前针对酒糟中高粱蛋白的研究和应用较少，仅停留在将其酶解为功能性肽段使用，并没有对酒糟中的蛋白种类和提取进行分级的探索。
高粱作为酒糟的主要组成部分，其蛋白主要分为四种，即清蛋白/球蛋白(4％-5％)、醇溶蛋白(60％-65％)和谷蛋白(30％-36％)。清蛋白和球蛋白中富含多种人体必需的氨基酸(如赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺以及精氨酸等)。然而，这两种蛋白含量相对较低。醇溶蛋白具有较高的含量，但其中必需氨基酸含量较少，谷蛋白虽含量虽低于醇溶蛋白，但却远高于清蛋白和球蛋白，且谷蛋白中同样含有人体所多种必需氨基酸。此外，谷蛋白即具有比清蛋白和球蛋白更高的含量，同时具有比醇溶蛋白更高的人体所需必需氨基酸的含量。谷蛋白在护肤品中具有美白祛斑，皮肤调理，抗氧化等作用。因此，高粱谷蛋白可以作为酒糟中提取的主要蛋白质，同时在提取过程中也可以实现清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的提取。
现有的在蛋白提取过程中，通常采用相应的辅助手段来提升提取量，如超声、微波、渗透压差等。然而，超声提取易受到衰减因素的制约和功率的限制，噪声较大；较大功率的微波会对人体造成危害；渗透膜需定期更换，造成材料的消耗以及环境的污染。因此，需要新型无害、环保、提取效率高的辅助手段用于蛋白的提取过程中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种弥补现有提取技术的不足，提供一种酒糟高粱蛋白分级提取的新型非热、无害、环保的方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种从白酒酒槽中分级提取高粱谷蛋白的方法，包括如下步骤：
1)将冷冻的白酒酒槽解冻后，依次进行干燥、粉碎、过筛、除脂、脉冲电场破壁和除糖处理；
2)在步骤1)所得物中分别提取高粱清蛋白和高粱球蛋白、高粱醇溶蛋白、高粱谷蛋白；
3)利用超滤和凝胶色谱法对所述高粱谷蛋白进行纯化，完成提取。
本发明中，“白酒酒槽”是指米、麦、高粱等酿酒后剩余的残渣。
进一步地，步骤1)中，所述脉冲电场破壁的条件为：电场场强在0.76～4.02kV/cm、作用次数在20～100次、酒糟粉末与蒸馏水的物料比在1g:(6.7～80)mL，经脉冲电场处理后，使酒糟中植物细胞壁和细胞膜破碎，贮存蛋白流出。
进一步地，步骤1)中，所述除糖处理的条件为：向物料中加入纤维素酶、木聚糖酶、耐高温α-淀粉酶和葡聚糖苷酶，分别对物料中的多糖进行酶解，离心，除去酶解后的低分子量可溶性糖。
进一步地，所述离心采用的离心力6000～8000g、离心温度为0～4℃、离心时间10～15min，去除上清液。
进一步地，所述纤维素酶的酶解温度为30～45℃，pH为5.0～6.5，酶活力不小于50000U/g；
所述木聚糖酶的酶解温度为50～60℃，pH为5.5～6.0，酶活力不小于60U/g；
所述耐高温α-淀粉酶的酶解温度40～55℃，pH为5.5～6.5，酶活力不小于2000U/g；
所述葡聚糖苷酶解温度为50～55℃，pH为6.0～6.5，酶活力不低于500U/g。
进一步地，步骤2)中，采用浓度为0.1～0.2M的硫酸铵溶液提取高粱清蛋白和高粱球蛋白。过高浓度的硫酸铵会造成蛋白质盐析现象，使蛋白质溶解度降低，不利于清蛋白和球蛋白的提取。
进一步地，步骤2)中，采用含有0.05wt％DTT和0.5wt％醋酸的60wt％的叔丁醇水溶液提取高粱醇溶蛋白。
进一步地，步骤2)中，采用含有1～2wt％DTT和1～5wt％SDS的0.125M的氢氧化钠水溶液提取高粱谷蛋白。其中，DTT和SDS的加入量过多会因浓度过高而使蛋白质变性。
进一步地，步骤3)中，超滤采用的超滤膜分子量截留为3kDa；所述凝胶色谱法采用的凝胶色谱柱为HiLoad 26/600Superdex 75prep grade或Superdex 75Increase 10/300GL。凝胶色谱是纯化蛋白质的主要方式之一，其依据分子筛的阻碍作用，大分子量的物质不易进入凝胶颗粒内部的微孔中，只能在颗粒之间随着洗脱剂移动，因此首先被色谱柱洗脱出来。小分子物质体积较小，不仅可以在凝胶颗粒中扩散，还可以进入凝胶颗粒内部，因此在色谱柱上运动的时间较长，最后被洗脱出来。因此，凝胶色谱柱可以用来分离分子量有明显差别的蛋白，以及可以除掉小分子盐。此外，也可以根据不同蛋白在不同溶剂中溶解度的差异来选择洗脱液进行更有效的分离。
进一步地，步骤1)中，所述过筛的目数不大于40目；所述除脂的过程中，采用正己烷进行除脂，其中，酒糟粉末与正已烷的比例不低于1g:10mL。
本发明的有益效果如下：
本发明首先将冷冻酒糟45℃烘干，防止温度过高破坏蛋白质的结构，并利用万能粉碎机粉碎酒糟，过40目筛，并通过正已烷去除酒糟粉末中的脂类物质。超声、微波、膜渗透等方法通常作为蛋白提取的辅助手段。然而，超声提取易受到功率的制约、微波强度过高会对人体健康产生潜在的危害，渗透膜的更换易对环境造成污染。因此，高压脉冲电场作为新型辅助提取技术，被广泛应用到提取领域中。相比其他的提取技术，脉冲电声提取时间较短(单次作用小于1s)而且可以实现连续操作。其原理主要是采用电穿孔的模型，随着脉冲电场强度的增加，细胞膜两侧的跨膜电压随之增加。当电压超过细胞壁和细胞膜承受的临界值时，就会导致细胞壁和细胞膜发生不可逆的损伤。将除脂后的酒糟粉末与不同比例水混合，加入到脉冲电场处理室中，在不同的场强和电击次数的作用下破坏细胞壁和细胞膜，同时对细胞壁、细胞膜产生电极化、电击穿等，使细胞膜内的成分溶出，从而提高提取效率。
植物细胞壁中含有纤维素、淀粉和木聚糖等糖类物质，水不溶性纤维素和木聚糖可以通过离心的方式除去，为除去水溶性的纤维素、淀粉和木聚糖，纤维素酶可以将纤维素水解为葡萄糖，耐高温α-淀粉酶可以将淀粉水解成麦芽糖和葡萄糖；木聚糖酶可以将木聚糖水解为木寡糖、木二糖。在脉冲电场处理液中依次加入纤维素酶、耐高温α-淀粉酶、木聚糖酶和葡糖苷酶，并在适宜酶解作用条件下进行水解，将酒糟中的纤维素、淀粉、木质素等转化小分子可溶性糖并通过离心除去，从而提高酒糟蛋白的纯度，便于后续分离。
蛋白的提取是根据不同种类蛋白在不同类型溶剂中的溶解度差异进行分离。高粱蛋白主要有四种，即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。其中清蛋白易溶于水，球蛋白易溶于低浓度盐溶液，因此可以使用低浓度盐溶液如硫酸铵提取出清蛋白和球蛋白。醇溶蛋白易溶于有机溶剂，可以使用乙醇、乙酸和叔丁醇等进行提取。谷蛋白易溶于稀酸或稀碱溶液，酒糟中高粱谷蛋白经过实验测定其等电点在pH 4.0左右，可以使用稀碱溶液进行提取。在提取过程中，加入微量的DTT和SDS可以展开谷蛋白的空间结构，从而提高谷蛋白的提取量。
进一步的，本发明中使用超滤膜可以有效保留大分子量蛋白的同时除去小分子量的盐、低分子量多肽和糖，从而达到纯化的目的。用凝胶色谱可以进一步有效地除去蛋白溶液中的杂质和脱色，使用凝胶色谱不需要像制备液相一样使用相当高的压强，对设备的要求相对较低，操作方便，进样量较大，分离效果理想。
本发明依次将酒糟烘干粉碎过筛，高压脉冲电场结合酶法和不同溶剂对酒糟高粱蛋白进行了分级提取，可以在同一工艺流程中，根据蛋白的使用需求提取择制备不同种类的高粱蛋白。采用超滤和凝胶色谱对所得酒糟高粱谷蛋白进行纯化，可以进一步得到纯度较高的酒糟高粱谷蛋白。本发明还解析出了酒糟高粱谷蛋白的氨基酸序列、空间结构、理化性质、抗氧化能力和降血压能力。该分离方法能够提升酒糟的附加值，同时采用了新型提取技术高压脉冲电场，提取速度快、整体制备工艺方法简单，提取方法和获得的蛋白种类灵活，易于实现工业化生产。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出高压脉冲电场提取设备EX-1900的实物图。
图2示出脉冲电场的提取原理示意图。
图3示出实例1中酒糟高粱谷蛋白的HiLoad 26/600Superdex 75prep grade凝胶色谱图。
图4示出实例2中酒糟高粱谷蛋白的Superdex 75Increase 10/300GL凝胶色谱图。
图5A-图5I示出实施例4中酒糟高粱谷蛋白酶解肽各肽段二级质谱图。
图6示出实施例4中酒糟高粱谷蛋白空间结构图。
图7示出实施例4中酒糟高粱谷蛋白黏度值。
图8示出实施例4中酒糟高粱谷蛋白亚基分布。
图9示出实施例4中酒糟高粱谷蛋白紫外光谱图。
图10示出实施例4中酒糟高粱谷蛋白红外光谱图。
图11示出实施例4中酒糟高粱谷蛋白圆二色谱图。
图12示出实施例4中糟高粱谷蛋白抗氧化活性。
图13示出实施例4中酒糟高粱谷蛋白血管紧张素转化酶活性半抑制浓度值。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
为便于比较本发明中的蛋白提取量，实施例和对比例使用相同来源同一批次的酒糟。
实施例1
一种提高白酒酒糟中高粱谷蛋白含量的分级提取方法，包括以下内容：
1、主要试剂及样品
浓香型白酒酒糟来自某酒业股份有限公司，取样后置于-20℃保存备用；
超纯水取自Millipore-Q系统；
正已烷(色谱纯)、叔丁醇和氢氧化钠购于麦克林公司；
SDS、DTT和BCA试剂盒购于索莱宝公司；
硫酸铵购于西陇科学有限公司；
ABTS试剂盒购于南京建成生物工程研究所；
DPPH、ORAC、亚铁螯合和羟基自由基试剂盒购于上海聪羿生物有限公司；
血管紧张素转化酶购于索莱宝公司。
2、主要仪器
高压脉冲电场提取设备EX-1900购于西南科技公司，其实物图如图1所示，图1中，1为放电开关；2为上电极板；3为处理室；4为调节高度元件；5为控制面板；6为接地下电极板；
电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；
高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；
顶置搅拌器40digital，日本IKA公司；
高速冷冻离心机(CR22N)，株式会社日立制作所；
真空离心浓缩仪(RVC 2-25CDplus)，德国Christ公司；
真空冻干机(Alpha 1-4LSCbasic)，德国Christ公司；
凝胶色谱柱HiLoad 26/600Superdex 75prep grade或Superdex 75Increase 10/300GL，美国GE Superdex公司；
液相色谱-飞行时间质谱联用仪，美国赛默飞公司；
液相色谱(1260)，美国安捷伦公司；
黏度仪(Z2210-0389)，美国Brookfield Viscometer公司；
红外光谱，德国Bruck公司；
紫外光谱，日本Shimadzu公司；
圆二色谱，日本Jasco公司；
酶标仪，美国分子公司。
3、提取方法
1)前处理：将冷冻酒糟在45℃下烘干，使用万能粉碎机粉碎，过40目筛，得到酒糟粉末；
2)除脂：称取步骤1)中得到的粉末90g与正已烷以1g：10mL的比例混合，进行搅拌除脂，并在45℃下烘干；
3)脉冲电场辅助提取：将步骤2)中得到的除脂酒糟粉末与水以质量比1:20的比例加入到脉冲电场的处理室中，在2.43kV/cm的电场强度下，电击提取60次，通过高压脉冲电场充分打破细胞膜和细胞壁，其中，脉冲电场提取原理如图2所示；
4)除糖：在步骤3)中经脉冲电场处理的酒糟水溶液中加入纤维素酶和耐高温α-淀粉酶，加入量为酒糟粉末重量的0.05％，酶活力分别为50000U/g和2000U/g，温度为40℃，酶解时间为12h，pH为6.0；随后加入木聚糖酶和葡糖苷酶，加入量为酒糟粉末重量的0.1％，酶活力分别为60000U/mg和500U/g，酶解温度为50℃，酶解时间为12h。酶解后，4℃，8000g离心力下，离心10min去除上清液，获得除糖酒糟粉末；
5)蛋白的分级提取，清蛋白和球蛋白提取：首先在步骤4)中的除糖酒糟粉末中以1:10的比例加入0.15M的硫酸铵水溶液，进行酒糟高粱清蛋白和球蛋白的提取，提取时间为6h，温度为37℃，离心，分离清蛋白和球蛋白提取液与酒糟粉末；
6)醇溶蛋白提取：将步骤5)中的酒糟粉末以1:10的比例加入到含有0.05％DTT和0.5％醋酸的60％叔丁醇中提取酒糟高粱醇溶蛋白，提取时间为6h，温度为37℃，离心，分离醇溶蛋白提取液与酒糟粉末；
7)谷蛋白的提取：将步骤6)中的酒糟粉末以1:10的比例加入到含有1％SDS和1％DTT的0.125M氢氧化钠水溶液中提取酒糟高粱谷蛋白，提取时间为12小时/次，反复提取4次，温度为37℃，离心，获得谷蛋白提取液。通过真空浓缩仪在35℃浓缩谷蛋白提取液，浓缩时间为12h，压力为0.02MPa。
8)超滤：将步骤7)中浓缩后的提取液进行分子量为3kDa的超滤，离心力为4000g，离心时间为10min，得超滤液；
9)凝胶色谱：将步骤8)中得到超滤液通过凝胶色谱HiLoad 26/600Superdex75prep grade进行纯化，首先用含有0.15M氯化钠的中性水溶液以0.8mL/min的流速洗脱一个柱体积，随后用含有0.15M氯化钠的pH 8.5的碱性水溶液以0.8mL/min洗脱两个柱体积，结果如图3所示，最后合并洗脱液，真空浓缩后，冻干得酒糟高粱谷蛋白粉末4.88g。
10)纯度测定：通过BCA法测得酒糟高粱谷蛋白的纯度为87.04％。
实施例2
其与实施例1的区别在于：
步骤3)中除脂酒糟粉末与水以1:20的比例加入到脉冲电场的处理室中，在3.26kV/cm的电场强度下，电击提取80次，进行细胞壁和细胞膜的破碎。
步骤4)中加入纤维素酶和α-淀粉酶，温度为45℃，酶解时间为24h，pH为6.5；随后加入木聚糖酶和葡聚糖苷酶，酶解时间为24h。酶解后，4℃下8000g，离心15min去除上清液，获得除糖酒糟粉末；
步骤7)中酒糟粉末以1:15的比例加入到含有1％SDS和1％DTT的0.125M氢氧化钠水溶液中提取酒糟高粱谷蛋白，提取时间为12小时/次，反复提取4次，温度为37℃，离心，获得谷蛋白提取液。通过真空浓缩仪在35℃浓缩谷蛋白提取液，浓缩时间为16h，压力为0.02MPa；
步骤8)中超滤离心力为4200g；
步骤9)中凝胶色谱Superdex 75Increase 10/300GL进行纯化，首先用含有0.15M氯化钠的中性水溶液以0.4mL/min的流速洗脱一个柱体积，随后用含有0.15M氯化钠的pH8.5的水溶液以0.4mL/min洗脱两个柱体积，结果如图4所示，最后合并洗脱液，真空浓缩后，冻干得酒糟高粱谷蛋白粉末5.02g。
按照实施例1中的方法进行检测，本实施例中所得酒糟高粱谷蛋白的纯度为88.11％。
实施例3
其与实施例1的区别在于：
步骤3)中除脂酒糟粉末与水以3:20的比例加入到脉冲电场的处理室中，在3.26kV/cm的电场强度下，电击提取80次，进行细胞壁和细胞膜的破碎。
步骤4)中加入纤维素酶和α-淀粉酶，温度为45℃，酶解时间为24h，pH为6.5；随后加入木聚糖酶和葡聚糖苷酶，酶解时间为24h。重复酶解三次，酶解后，4℃下10000g，离心15min去除上清液，获得除糖酒糟粉末；
步骤5)和6)中清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白提取时间均为8h；
步骤7)中酒糟粉末以1:15的比例加入到含有1％SDS和1％DTT的0.125M氢氧化钠水溶液中提取酒糟高粱谷蛋白，提取时间为24小时/次，反复提取4次，温度为37℃，离心，获得谷蛋白提取液。通过真空浓缩仪在35℃浓缩谷蛋白提取液，浓缩时间为16h，压力为0.02MPa；
步骤8)中超滤离心力为4500g；
步骤9)中凝胶色谱Superdex 75Increase 10/300GL进行纯化，首先用含有0.15M氯化钠的中性水溶液以0.2mL/min的流速洗脱一个柱体积，随后用含有0.15M氯化钠的pH8.5的碱性水溶液以0.2mL/min洗脱两个柱体积，最后合并洗脱液，真空浓缩后，冻干得酒糟高粱谷蛋白粉末5.76g；
按照实施例1中的方法进行检测，本实施例中所得酒糟高粱谷蛋白的纯度为94.89％。
对比例1
参照实力例1，与实例1不同的是，蛋白提取过程中采用的是超声辅助碱提法，超声30min，功率400W；
本实例中所得酒糟高粱谷蛋白的提取量为2.82g；
参照实例1中的检测方法，本实施例制备得到酒糟高粱谷蛋白的纯度为82.21％。
对比例2
其与实施例1的区别在于，步骤5)、6)和7)提取后都进行30min的超声辅助提取，功率为400W；
本实例中所得酒糟高粱谷蛋白的提取量为2.98g；
参照实例1中的检测方法，本实施例制备得到酒糟高粱谷蛋白的纯度为83.25％。
对比例3
其与实施例1的区别在于，步骤5)、6)和7)提取后都进行45min的超声辅助提取，功率为400W；
本实例中所得酒糟高粱谷蛋白的提取量为3.31g；
参照实例1中的检测方法，本实施例制备得到酒糟高粱谷蛋白的纯度为88.55％。
实施例4
酒糟高粱谷蛋白结构分析及性质表征
以实施例3中得到的酒糟高粱谷蛋白为例进行氨基酸序列、空间结构的鉴定和活性的测定。
将酒糟高粱谷蛋白配置成2mg/mL溶液，通过胰蛋白酶(15ng/μL)进行酶解，所得肽段通过液相色谱-飞行时间质谱仪进行序列的测定，分析条件为：预柱：300μm i.d.×5mm，Acclaim PepMap RPLC C18,5μm,
分析柱：150μm i.d.×150mm，Acclaim PepMap RPLCC18，1.9μm，
流动相A：0.1％甲酸，2％ACN；流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；流速：600nL/min；每个组分分析时间：66min；梯度洗脱程序为：0-2min，4-8％B；2-45min，8-28％B；45-55min，28-40％B；55-56min，40-95％B；56-66min，95％B。所得肽段结果如图5所示，通过UniProt蛋白谱库进行同源蛋白质的比对，根据匹配度最高的蛋白质的氨基酸序列通过Robetta在线预测工具进行三维结构的预测，结果如图6所示；
黏度测定：将酒糟高粱谷蛋白配置为1mg/mL溶液，通过黏度仪在23℃下进行黏度测定，仪器参数：扭矩，50.5％；转速，165rpm；测量时间，120s；剪切力，3.71dyne cm-2；剪切速率，198.1s-1；精度，±0.04mPa·s，结果如图7；
蛋白亚基分布：将酒糟高粱谷蛋白配置为1mg/mL溶液，通过Tskgel SW2000柱(分离范围：15-150kDa)进行分子量分布测定，测定程序：进样量40μL；流动相：0.1M磷酸缓冲盐(含有0.1M氯化钠)；流速，0.5mL/min；紫外吸收波长，214和280nm；内标，白细胞介素-8(8kDa),胰蛋白酶(24kDa),胃蛋白酶(35kDa),牛血清蛋白(66kDa),和α-淀粉酶(97kDa)；结果如图8；
紫外光谱测定：将酒糟高粱谷蛋白配置为0.1mg/mL溶液，在200-400nm吸收波长下进行测定，以牛血清蛋白作为标准品，结果如图9；
红外光谱测定：2mg酒糟高粱谷蛋白置于红外光谱仪样品台上，在800-4000cm-1波长下进行测定；结果如图10；
圆二色谱测定：将酒糟高粱谷蛋白配置为2.5mg/mL溶液，于2.0mm石英比色皿中，在195-300nm下进行测定，扫描频率，50nm/min；扫描次数，10次，结果如图11。
抗氧化活性的测定：将酒糟高粱谷蛋白配置成0.125、0.25、0.625、0.9375和1.25mg/mL浓度的溶液，通过ABTS、DPPH、ORAC、亚铁螯合力、羟基自由基试剂盒进行测定，结果如图12；
血管紧张素转化酶抑制活性(ACE)测定：将酒糟高粱谷蛋白配置成0.005、0.01、0.1、0.5、1、5和10mg/mL浓度的溶液，将50μL样品与50μL ACE混合37℃下孵育5min，随后加入150μL8.3 mM马脲酰组氨酰亮氨酸(溶剂为0.1M Tris-盐酸缓冲盐)，37℃下反应60min，通过250μL 1M盐酸终止反应，用1.5mL乙酸乙酯萃取马尿酸，随后在80℃下烘干，1mL去离子水复溶，通过液相色谱结合XBridge peptide BEH C18反相色谱柱进行测定马尿酸含量的变化，分析条件：流动相，A相，水(含0.05％三氟乙酸)；B相，乙腈(含0.05％三氟乙酸)；流速，0.05mL/mi；洗脱程序：0-10min，5-60％B；10-12min，60％B；12-15min 60-5％B；检测波长，228nm；结果如图13；
综上，通过具体案例，可以看出，采用本发明提供的提取方法，可以在同一工艺流程中，制备得到更高含量的酒糟高粱谷蛋白。同时也可以针对提取过程中得到的高粱清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白加以利用。测定了酒糟高粱谷蛋白的空间结构和功能特性。使酒糟的附加值得到了进一步提升。在整个提取过程中工艺简单，能耗较低，对人体健康无明显影响，操作易于控制，在提取过程中可以根据所需蛋白进行提取，易于实现工业化生产。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (9)
1.一种从白酒酒槽中分级提取高粱谷蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将冷冻的白酒酒槽解冻后，依次进行干燥、粉碎、过筛、除脂、脉冲电场破壁和除糖处理；
2)在步骤1)所得物中分别提取高粱清蛋白和高粱球蛋白、高粱醇溶蛋白、高粱谷蛋白；
3)利用超滤和凝胶色谱法对所述高粱谷蛋白进行纯化，完成提取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述脉冲电场破壁的条件为：电场场强在0.76～4.02kV/cm、作用次数在20～100次、酒糟粉末与蒸馏水的物料比在1g:(6.7～80)mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述除糖处理的条件为：向物料中加入纤维素酶、木聚糖酶、耐高温α-淀粉酶和葡聚糖苷酶，分别对物料中的多糖进行酶解，离心，除去酶解后的低分子量可溶性糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶的酶解温度为30～45℃，pH为5.0～6.5，酶活力不小于50000U/g；
所述木聚糖酶的酶解温度为50～60℃，pH为5.5～6.0，酶活力不小于60U/g；
所述耐高温α-淀粉酶的酶解温度40～55℃，pH为5.5～6.5，酶活力不小于2000U/g；
所述葡聚糖苷酶解温度为50～55℃，pH为6.0～6.5，酶活力不低于500U/g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用浓度为0.1～0.2M的硫酸铵溶液提取高粱清蛋白和高粱球蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用含有0.05wt％DTT和0.5wt％醋酸的60wt％的叔丁醇水溶液提取高粱醇溶蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用含有1～2wt％DTT和1～5％wtSDS的0.125M的氢氧化钠水溶液提取高粱谷蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，超滤采用的超滤膜分子量截留为3kDa；所述凝胶色谱法采用的凝胶色谱柱为HiLoad 26/600Superdex 75prep grade或Superdex 75Increase 10/300GL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述过筛的目数不大于40目；所述除脂的过程中，采用正己烷进行除脂，其中，酒糟粉末与正已烷的比例不低于1g:10mL。
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