CN111205979A - 一种rna提取装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种RNA提取装置及方法，包括活塞式注射器、塑料离心管、设置在塑料离心管中的离心柱、混合离心管，混合离心管包括管体和管盖，在管盖上设置有通孔，在通孔内设置有硅胶柱，在管体内腔的上部设置有顶部分隔层，中下部设置有中间分隔层，顶部分隔层和中间分隔层将管体的内腔分为上腔、中腔和下腔，在上腔内预先放置有研磨球，在中腔内预先放置有TRIzol，在下腔内预先放置有氯仿。本发明在提取RNA的过程中操作者无需直接吸取和接触有机溶剂，操作过程中不向大气环境中释放有毒挥发物，保护了实验人员的健康；同时本发明通过研磨球实现对块状组织样本和难裂解组织样本的机械切割、研磨，以更加快速、充分地释放RNA。

Description

一种RNA提取装置及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种RNA提取装置及方法。
背景技术
RNA又称核糖核酸Ribonucleic Acid是生命过程中的关键物质之一。提取高纯且完整的RNA有助于研究者全面了解RNA转录、剪切和降解过程中的调控机制。目前RNA提取主要有硅胶结合法、磁珠结合法、CTAB或PVP法、氯化铯密度梯度离心法等。其中TRIzol法是目前最为广泛的RNA提取方法之一，该方法具有RNA产量大、成本低、通用性好等显著优点，广泛应用于从动物、植物、真菌、细菌和病毒等不同来的组织和细胞中提取RNA。
TRIzol和氯仿是TRIzol法中提取RNA的关键试剂。TRIzol可抑制RNA酶的活力，保证RNA的完整性，同时可以裂解组织和细胞并溶解RNA。TRIzol充分裂解组织和细胞后，添加氯仿可以进一步促进蛋白质变性，经高速离心后，TRIzol、氯仿和裂解细胞的混合液可初步分为下层有机相、中间蛋白层和上部含有RNA的水相。
TRIzol中含有苯酚、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇等有毒物质；氯仿具有麻醉作用，对心、肝、肾均有严重损害。然而目前TRIzol法提取RNA的过程中，操作人员需要用移液器多次移取TRIzol和氯仿，存在有毒有害试剂挥发和泄露的风险，危害操作人员身体健康并造成污染环境。
在精密分子生物学实验中微量的蛋白质污染和DNA污染就有可能干扰实验结果。由于生物组织样品中富含蛋白质和DNA等杂质，且RNA自身也可与蛋白质和DNA相互结合，常规RNA提取方法难以通过一步法直接获得高纯度RNA。常规的RNA提取方法均需配合蛋白质污染消除步骤和DNA污染消除步骤。向RNA提取物中添加蛋白酶K和DNase I是目前最为常见的蛋白污染和DNA污染的消除方法，但是向RNA溶液中额外添加蛋白酶K和DNase I这一步骤自身也会引入新的蛋白酶污染，并可能干扰下游的逆转录和PCR实验结果。如何在消除蛋白和DNA污染的同时彻底去除或避免蛋白酶K和DNase I污染，是提高RNA提取质量的关键问题之一。
热灭活是最为常用和简便的酶失活方法。蛋白酶K在100摄氏度处理10分钟，DNaseI在65摄氏度处理10分钟就可以彻底失活，但是长时间高温加热处理也会导致RNA样品降解和破坏；苯酚-氯仿法提取是最为严格的去除和失活蛋白酶K和DNase I的方法，但是该方法操作繁琐且非常耗时；EDTA法虽然可以通过螯合金属离子，使DNase I失活并降低蛋白酶K的活性，但EDTA可能螯合金属离子并影响后续的逆转录和PCR反应。硅胶结合法和磁珠结合法等RNA纯化法，虽然可以利用硅胶柱和磁珠结合一定长度范围内的RNA，再通过洗脱液去除绝大部分蛋白酶K和DNase I，但硅胶柱表面和磁珠表面还会残留微量的蛋白酶K和DNaseI，并且常规硅胶柱和磁珠对超长和超短的RNA序列的结合效率较低，干扰后续精密实验结果。
因此如何高效、低成本的从生物组织和细胞中提取高纯度的RNA，仍是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对上述问题提供了一种RNA提取装置及方法。
为达到上述目的本发明采用了以下技术方案：
一种RNA提取装置，包括活塞式注射器、塑料离心管以及可以放入塑料离心管中的离心柱，在所述离心柱内固定设置有过滤层，所述离心柱根据过滤层的不同材质进一步分为微孔陶瓷滤层离心柱和硝酸纤维素滤膜离心柱，还包括混合离心管，所述混合离心管包括管体和螺纹连接在管体上端的管盖，在所述管盖上设置有通孔，在所述通孔内设置有硅胶柱，用于密封通孔，所述管体内腔的上部内凹形成支撑台，在所述支撑台上设置有顶部分隔层，在所述管体内腔的中下部固定设置有支撑环，在所述支撑环上设置有中间分隔层，顶部分隔层和中间分隔层将管体的内腔从上到下依次分为上腔、中腔和下腔三个独立的空间，在所述上腔内预先放置有研磨球，在所述中腔内预先放置有TRIzol，在所述下腔内预先放置有氯仿。
进一步，在所述活塞式注射器的针头外表面设置有通气槽，以再抽取含有RNA的水相时保证混合离心管内外的大气压平衡，更方便的抽取含有RNA的水相。
再进一步，在所述管体与管盖之间设置有密封垫。
更进一步，在所述硅胶柱的上端一体设置有限位台，以保护硅胶柱不掉落至管体内部。
更进一步，在所述管盖的上表面通孔处螺纹连接有保护盖，用于防止硅胶柱掉出。
更进一步，所述顶部分隔层为1-3mm厚的镍钛-热致形状记忆合金，40摄氏度-50摄氏度瞬时受热后可扭曲缩聚为团状；所述中间分隔层为0.1-0.5mm的玻璃；所述研磨球为直径2-5mm的316或304不锈钢球。
更进一步，所述过滤层为微孔陶瓷过滤层或硝酸纤维素滤膜，所述微孔陶瓷过滤层的过滤孔径为5-100微米，所述硝酸纤维素滤膜的过滤孔径为0.1-0.5微米。
一种RNA提取方法，包括以下步骤：
1)将混合离心管和组织样品在液氮环境中预冷，打开管盖，放入组织样品，关闭管盖，将混合离心管放到振荡组织研磨仪中，启动振荡组织研磨仪，研磨球震动过程中通过机械碰撞和挤压将组织样品粉碎；
2)将混合离心管放入水温为40摄氏度-50摄氏度的温控仪中，顶部分隔层受热蜷曲成团，释放出TRIzol，将混合离心管上下颠倒数次使组织粉末与TRIzol充分混合，静置3-15分钟；
3)将混合离心管放入振荡组织研磨仪中，启动振荡组织研磨仪，研磨球高速震动过程中击碎中间分隔层，释放出氯仿，研磨球进一步通过高速振荡和碰撞将氯仿和TRIzol充分混合，关闭振荡组织研磨仪，取出混合离心管，放入水平转子离心机进行高速离心，混合离心管内混合物在离心力和氯仿的作用下，分为下层有机相、中间蛋白层和上部含有RNA的水相；
4)将微孔陶瓷滤层离心柱放入塑料离心管中，并将此塑料离心管标记为一号离心管，打开混合离心管上的保护盖，将活塞式注射器的针头从硅胶柱插入至混合离心管中，将含有RNA的水相液体抽出，并放入微孔陶瓷滤层离心柱内，将含有微孔陶瓷滤层离心柱的一号离心管放入水平转子离心机，10000rpm离心1分钟后，取出微孔陶瓷滤层离心柱，在一号离心管中放入100mg携带有DNase I的磁珠和100微升的双用缓冲液，温浴15分钟；
5)将一号离心管放置在强磁铁上，吸取上清液移至新的塑料离心管中，并标记此塑料离心管为二号离心管，在二号离心管中加入100mg携带有蛋白酶K的磁珠，温浴15分钟；
6)将硝酸纤维素滤膜离心柱放入至新的塑料离心管中，并将此塑料离心管标记为三号离心管，将二号离心管放置在强磁铁上，吸取上清液至硝酸纤维素滤膜离心柱内，将含有硝酸纤维素滤膜离心柱的三号离心管放入水平转子离心机，10000rpm离心1分钟后，取出硝酸纤维素滤膜离心柱；三号离心管内的剩余RNA液体可通过真空冷冻干燥法直接浓缩或乙醇沉淀法浓缩，乙醇沉淀法浓缩的具体方法为向三号离心管内加入体积为剩余RNA液体两倍的无水乙醇，沉淀30分钟后，再经过高速离心，移走上清液，目的RNA留在三号离心管管壁上，最后经室温干燥即获得纯品RNA。
进一步，所述步骤4)和步骤5)中的双用缓冲液的配方是：50-500mM Tris-HCl(pH值7.5-8.5)、20-600mM硫酸镁和10-500mM氯化钙。
再进一步，所述步骤4)中携带有DNase I的磁珠和步骤5)中携带有蛋白酶K的磁珠的制备方法如下：
吸取1毫升含有10毫克/毫升的羧基磁珠至离心管中，磁珠直径为1-5微米，强磁铁放置离心管底部1分钟，吸取剩余液体；加入3毫升2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，即pH＝5.5的MES缓冲液，充分振荡混匀并清洗后，强磁铁放置离心管底部1分钟，吸取剩余缓冲液完成一次MES缓冲液清洗，再次使用MES缓冲液清洗羧基磁珠两次；向含有羧基磁珠的离心管中加入5毫升新鲜MES缓冲液，称取20毫克碳二亚胺加入，振荡混匀30分钟后，再次使用MES缓冲液清洗羧基磁珠两次；加入20毫克的DNase I或蛋白酶K，25摄氏度反应24小时，使用MES缓冲液清洗两次，放置于4摄氏度保存，避免剧烈震动和离心。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
1、本发明在提取RNA的过程中操作者无需直接吸取和接触有机溶剂，操作过程中不向大气环境中释放有毒挥发物，保护了实验人员的健康；
2、本发明通过研磨球实现对块状组织样本和难裂解组织样本的机械切割、研磨，以更加快速、充分地释放RNA；
3、本发明通过镍钛-热致形状记忆材料的形变实现了破碎后的组织粉末能够自动加入到TRIzol液中，避免了组织粉末转移过程中的样品损失和潜在污染；
4、本发明在RNA提取完毕后有机溶剂可在离心管中长期保存，降低有毒有害物质泄漏的风险，方便后续无害化处理；
5、本发明通过微孔陶瓷过滤层先一步将高速离心后得到的上层水相液体中残存的蛋白沉淀或蛋白碎屑过滤，提高了RNA的纯度，降低了后续蛋白降解的困难程度；
6、本发明通过携带有DNase I的磁珠和携带有蛋白酶K的磁珠，分别将RNA溶液中的微量DNA和蛋白质彻底消化，并可通过磁铁吸引聚集和硝酸纤维素滤膜过滤将残留的磁珠彻底去除，从而在彻底去除蛋白质污染和DNA污染的同时，彻底避免在RNA溶液中残留DNase I和蛋白酶K，达到制备高纯度RNA的目的；
7、本发明的RNA提取过程不涉及RNA的吸附及洗脱操作，避免了磁珠结合法和硅胶柱结合法对超长和超短序列结合能力较差的技术难题，可最大程度的保存生物体内的超长和超短序列RNA的完整信息。
附图说明
图1为本发明混合离心管的结构示意图；
图2为本发明活塞式注射器的结构示意图；
图3为本发明塑料离心管和离心柱组装的结构示意图；
图中活塞式注射器—1、塑料离心管—2、离心柱—3、过滤层—4、混合离心管—5、通气槽—101、管体—501、管盖—502、通孔—503、硅胶柱—504、支撑台—505、顶部分隔层—506、支撑环—507、中间分隔层—508、研磨球—512、密封垫—513、限位台—514、保护盖—515。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明的技术方案，下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
如图1至图3所示，一种RNA提取装置，包括活塞式注射器1、混合离心管5、塑料离心管2和可以放入塑料离心管2中的离心柱3，在所述活塞式注射器1的针头外表面设置有通气槽101，在所述离心柱3内固定设置有过滤层4，所述离心柱3根据过滤层的不同材质进一步分为微孔陶瓷滤层离心柱和硝酸纤维素滤膜离心柱，在所述过滤层4上还可设置压紧板，以压紧过滤层4，使过滤层4与离心柱3内壁紧密接触，以防止从侧壁缝隙漏液。所述过滤层4为微孔陶瓷过滤层或硝酸纤维素滤膜，所述微孔陶瓷过滤层上的过滤孔径为5-100微米，所述硝酸纤维素滤膜的过滤孔径为0.1-0.5微米。所述混合离心管5包括管体501和螺纹连接在管体501上端的管盖502，在所述管体501与管盖502之间设置有密封垫513。在所述管盖502上设置有通孔503，在所述通孔503内设置有硅胶柱504，用于密封通孔503，在所述硅胶柱504的上端一体设置有限位台514，以保护硅胶柱504不掉落至管体501内部。在所述管盖502的上表面通孔503处螺纹连接有保护盖515，用于防止硅胶柱504掉出。所述管体501内腔的上部内凹形成支撑台505，在所述支撑台505上设置有顶部分隔层506，在所述管体501内腔的中下部固定设置有支撑环507，在所述支撑环507上设置有中间分隔层508，顶部分隔层506和中间分隔层508将管体501的内腔从上到下依次分为上腔、中腔和下腔三个独立的空间，在所述上腔内预先放置有研磨球512，在所述中腔内预先放置有TRIzol，在所述下腔内预先放置有氯仿。所述顶部分隔层506为1-3mm厚的镍钛-热致形状记忆合金，40摄氏度-50摄氏度瞬时受热后可扭曲缩聚为团状；所述中间分隔层508为0.1-0.5mm的玻璃；所述研磨球512为直径2-5mm的316或304不锈钢球。
一种RNA提取方法，包括以下步骤：
1)将混合离心管5和组织样品在液氮环境中预冷，打开管盖502，放入组织样品，关闭管盖502，将混合离心管5放到振荡组织研磨仪中，启动振荡组织研磨仪，研磨球512震动过程中通过机械碰撞和挤压将组织样品粉碎；
2)将混合离心管5放入水温为40摄氏度-50摄氏度的温控仪中，顶部分隔层506受热蜷曲成团，释放出TRIzol，将混合离心管5上下颠倒数次使组织粉末与TRIzol充分混合，静置3-15分钟；
3)将混合离心管5放入振荡组织研磨仪中，启动振荡组织研磨仪，研磨球512高速震动过程中击碎中间分隔层508，释放出氯仿，研磨球512进一步通过高速振荡和碰撞将氯仿和TRIzol充分混合，关闭振荡组织研磨仪，取出混合离心管5，放入水平转子离心机进行高速离心，混合离心管5内混合物在离心力和氯仿的作用下，分为下层有机相、中间蛋白层和上部含有RNA的水相；
4)将微孔陶瓷滤层离心柱放入塑料离心管2中，并将此塑料离心管2标记为一号离心管，打开混合离心管5上的保护盖515，将活塞式注射器1的针头从硅胶柱504插入至混合离心管5中，将含有RNA的水相液体抽出，并放入微孔陶瓷滤层离心柱内，将含有微孔陶瓷滤层离心柱的一号离心管放入水平转子离心机，10000rpm离心1分钟后，取出微孔陶瓷滤层离心柱，在一号离心管中放入100mg携带有DNase I的磁珠和100微升的双用缓冲液，温浴15分钟；双用缓冲液的配方是：50-500mM Tris-HCl(pH值7.5-8.5)、20-600mM硫酸镁和10-500mM氯化钙。
5)将一号离心管放置在强磁铁上，吸取上清液移至新的塑料离心管2中，并标记此塑料离心管2为二号离心管，在二号离心管中加入100mg携带有蛋白酶K的磁珠，温浴15分钟；
6)将硝酸纤维素滤膜离心柱放入至新的塑料离心管2中，并将此塑料离心管2标记为三号离心管，将二号离心管放置在强磁铁上，吸取上清液至硝酸纤维素滤膜离心柱内，将含有硝酸纤维素滤膜离心柱的三号离心管放入水平转子离心机，10000rpm离心1分钟后，取出硝酸纤维素滤膜离心柱；三号离心管内的剩余RNA液体可通过真空冷冻干燥法直接浓缩或乙醇沉淀法浓缩，乙醇沉淀法浓缩的具体方法为向三号离心管内加入体积为剩余RNA液体两倍的无水乙醇，沉淀30分钟后，再经过高速离心，移走上清液，目的RNA留在三号离心管管壁上，最后经室温干燥即获得纯品RNA。
上述步骤4)中携带有DNase I的磁珠和步骤5)中携带有蛋白酶K的磁珠的制备方法如下：
吸取1毫升含有10毫克/毫升的羧基磁珠至离心管中，磁珠直径为1-5微米，强磁铁放置离心管底部1分钟，吸取剩余液体；加入3毫升2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，即pH＝5.5的MES缓冲液，充分振荡混匀并清洗后，强磁铁放置离心管底部1分钟，吸取剩余缓冲液完成一次MES缓冲液清洗，再次使用MES缓冲液清洗羧基磁珠两次；向含有羧基磁珠的离心管中加入5毫升新鲜MES缓冲液，称取20毫克碳二亚胺加入，振荡混匀30分钟后，再次使用MES缓冲液清洗羧基磁珠两次；加入20毫克的DNase I或蛋白酶K，25摄氏度反应24小时，使用MES缓冲液清洗两次，放置于4摄氏度保存，避免剧烈震动和离心。
以上显示和描述了本发明的主要特征和优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种RNA提取装置，包括活塞式注射器(1)、塑料离心管(2)以及可以放入塑料离心管(2)中的离心柱(3)，在所述离心柱(3)内固定设置有过滤层(4)，所述离心柱(3)根据过滤层的不同材质进一步分为微孔陶瓷滤层离心柱和硝酸纤维素滤膜离心柱，其特征在于：还包括混合离心管(5)，所述混合离心管(5)包括管体(501)和螺纹连接在管体(501)上端的管盖(502)，在所述管盖(502)上设置有通孔(503)，在所述通孔(503)内设置有硅胶柱(504)，用于密封通孔(503)，所述管体(501)内腔的上部内凹形成支撑台(505)，在所述支撑台(505)上设置有顶部分隔层(506)，在所述管体(501)内腔的中下部固定设置有支撑环(507)，在所述支撑环(507)上设置有中间分隔层(508)，顶部分隔层(506)和中间分隔层(508)将管体(501)的内腔从上到下依次分为上腔、中腔和下腔三个独立的空间，在所述上腔内预先放置有研磨球(512)，在所述中腔内预先放置有TRIzol，在所述下腔内预先放置有氯仿。
2.根据权利要求1所述的一种RNA提取装置，其特征在于：在所述活塞式注射器(1)的针头外表面设置有通气槽(101)。
3.根据权利要求1所述的一种RNA提取装置，其特征在于：在所述管体(501)与管盖(502)之间设置有密封垫(513)。
4.根据权利要求1所述的一种RNA提取装置，其特征在于：在所述硅胶柱(504)的上端一体设置有限位台(514)，以保护硅胶柱(504)不掉落至管体(501)内部。
5.根据权利要求4所述的一种RNA提取装置，其特征在于：在所述管盖(502)的上表面通孔(503)处螺纹连接有保护盖(515)，用于防止硅胶柱(504)掉出。
6.根据权利要求5所述的一种RNA提取装置，其特征在于：所述顶部分隔层(506)为1-3mm厚的镍钛-热致形状记忆合金，40摄氏度-50摄氏度瞬时受热后可扭曲缩聚为团状；所述中间分隔层(508)为0.1-0.5mm的玻璃；所述研磨球(512)为直径2-5mm的316或304不锈钢球。
7.根据权利要求6所述的一种RNA提取装置，其特征在于：所述过滤层(4)为微孔陶瓷过滤层或硝酸纤维素滤膜，所述微孔陶瓷过滤层的过滤孔径为5-100微米，所述硝酸纤维素滤膜的过滤孔径为0.1-0.5微米。
8.利用权利要求7所述RNA提取装置的一种RNA提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将混合离心管(5)和组织样品在液氮环境中预冷，打开管盖(502)，放入组织样品，关闭管盖(502)，将混合离心管(5)放到振荡组织研磨仪中，启动振荡组织研磨仪，研磨球(512)震动过程中通过机械碰撞和挤压将组织样品粉碎；
2)将混合离心管(5)放入水温为40摄氏度-50摄氏度的温控仪中，顶部分隔层(506)受热蜷曲成团，释放出TRIzol，将混合离心管(5)上下颠倒数次使组织粉末与TRIzol充分混合，静置3-15分钟；
3)将混合离心管(5)放入振荡组织研磨仪中，启动振荡组织研磨仪，研磨球(512)高速震动过程中击碎中间分隔层(508)，释放出氯仿，研磨球(512)进一步通过高速振荡和碰撞将氯仿和TRIzol充分混合，关闭振荡组织研磨仪，取出混合离心管(5)，放入水平转子离心机进行高速离心，混合离心管(5)内混合物在离心力和氯仿的作用下，分为下层有机相、中间蛋白层和上部含有RNA的水相；
4)将微孔陶瓷滤层离心柱放入塑料离心管(2)中，并将此塑料离心管(2)标记为一号离心管，打开混合离心管(5)上的保护盖(515)，将活塞式注射器(1)的针头从硅胶柱(504)插入至混合离心管(5)中，将含有RNA的水相液体抽出，并放入微孔陶瓷滤层离心柱内，将含有微孔陶瓷滤层离心柱的一号离心管放入水平转子离心机，10000rpm离心1分钟后，取出微孔陶瓷滤层离心柱，在一号离心管中放入100mg携带有DNaseI的磁珠和100微升的双用缓冲液，温浴15分钟；
5)将一号离心管放置在强磁铁上，吸取上清液移至新的塑料离心管(2)中，并标记此塑料离心管(2)为二号离心管，在二号离心管中加入100mg携带有蛋白酶K的磁珠，温浴15分钟；
6)将硝酸纤维素滤膜离心柱放入至新的塑料离心管(2)中，并将此塑料离心管(2)标记为三号离心管，将二号离心管放置在强磁铁上，吸取上清液至硝酸纤维素滤膜离心柱内，将含有硝酸纤维素滤膜离心柱的三号离心管放入水平转子离心机，10000rpm离心1分钟后，取出硝酸纤维素滤膜离心柱；三号离心管内的剩余RNA液体可通过真空冷冻干燥法直接浓缩或乙醇沉淀法浓缩，乙醇沉淀法浓缩的具体方法为向三号离心管内加入体积为剩余RNA液体两倍的无水乙醇，沉淀30分钟后，再经过高速离心，移走上清液，目的RNA留在三号离心管管壁上，最后经室温干燥即获得纯品RNA。
9.根据权利要求8所述的一种RNA提取方法，其特征在于：所述步骤4)和步骤5)中的双用缓冲液的配方是：50-500mM Tris-HCl、20-600mM硫酸镁和10-500mM氯化钙。
10.根据权利要求8所述的一种RNA提取方法，其特征在于：所述步骤4)中携带有DNaseI的磁珠和步骤5)中携带有蛋白酶K的磁珠的制备方法如下：
吸取1毫升含有10毫克/毫升的羧基磁珠至离心管中，磁珠直径为1-5微米，强磁铁放置离心管底部1分钟，吸取剩余液体；加入3毫升2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，即pH＝5.5的MES缓冲液，充分振荡混匀并清洗后，强磁铁放置离心管底部1分钟，吸取剩余缓冲液完成一次MES缓冲液清洗，再次使用MES缓冲液清洗羧基磁珠两次；向含有羧基磁珠的离心管中加入5毫升新鲜MES缓冲液，称取20毫克碳二亚胺加入，振荡混匀30分钟后，再次使用MES缓冲液清洗羧基磁珠两次；加入20毫克的DNaseI或蛋白酶K，25摄氏度反应24小时，使用MES缓冲液清洗两次，放置于4摄氏度保存，避免剧烈震动和离心。
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