KR101759204B1 - 샘플의 미생물을 분해하고 분석하기 위해 미생물의 핵산을 추출하고 정화하는 자동화된 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스로서,
- 공기 수집 모듈로서,
i. 상기 모듈 안으로 공기 스트림의 진입을 허용하며 공기 스트림을 교란하는 수단을 그 베이스에 구비하는 공기 진입 덕트를 구비하는 상부 부재와,
ⅱ. 생성된 공기 스트림이 빠져 나가게 하는 공기 배출 수단을 구비하는 하부 부재
를 포함하며,
상기 상부 부재 및 하부 부재는 공기 스트림이 공기 수집 모듈 내에서 생성될 수 있게 서로 일체형으로 만들어질 수 있는, 공기 수집 모듈과,
- 미생물을 분해하는 수단을 구비하는 미생물 보유 영역을 가지며 상기 공기 수집 모듈 내에 위치하는 대략 원통형 형상의 카트리지
를 포함하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스에 관한 것이다.

Description

샘플의 미생물을 분해하고 분석하기 위해 미생물의 핵산을 추출하고 정화하는 자동화된 시스템{AUTOMATED SYSTEM FOR THE LYSIS OF MICROORGANISMS IN A SAMPLE, AND FOR THE EXTRACTION AND PURIFICATION OF THE NUCLEIC ACIDS OF SAID MICROORGANISMS FOR ANALYSIS}

본 발명의 기술 분야는 생물학적 분석에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 먼저 미생물의 핵산을 추출하고 정화하기 위해 환경 또는 임상 샘플에 존재하는 미생물을 분해하는 디바이스에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 분석을 위하여 미생물의 핵산을 추출하고 정화하기 위해 미생물을 분해하는 자동화된 시스템에 관한 것이다.

병원에서 병원내 감염의 급증이 수 년 동안 관측되었다. 이들 감염은 장비와 표면의 소독과 공기 처리에 상당한 주의를 항상 기울임에도 불구하고 파괴되지 않고 병원 환경에 존재하는 병원성 미생물에 의해 병원 치료 중이어서 정의 상 면역이 저하된 사람의 오염으로 설명된다. 환경적으로 미생물 오염이 점점 더 빈번해 지는 것에 비춰, 환경적 규제를 개선하고 촉진하기 위한 디바이스와 방법의 개선이 건강 전문가에게 주요한 문제로 되고 있다.

병원내 감염의 문제에 더하여, 환경적 조건의 규제가 또한 수 년 동안 산업계에 특히 식품업계에 그리고 제약업계에 또는 화장품업계에 반복적으로 문제시 되고 있다. 식품업계에서, 병원성 미생물에 의해 제품의 오염 또는 심지어 원재료의 오염에서 발생할 수 있는 소비자 건강에 대한 막대한 피해는 잘 알려져 있다. 사실, Listeria 또는 Salmonella 종과 같은 박테리아로 인한 음식 중독이 이제 일반화되었다. 공기질의 규제도 또한 제약업계 또는 화장품업계의 품질 면의 접근에서 주요한 공정이다.

나아가, 이들 규제는 규정이 점점 더 엄격해지고 있어 점점 더 증가하는 요구조건에 부합하여야 한다.

환경 규제를 수행하는 건강 전문가 또는 제조업자들이 다루는 도구 중에서 미생물학적 공기 샘플러(air sampler)가 공기 중에 떠도는 미생물을 검출하기 위해 선택된 해법이다. 이들 디바이스들은 미생물학적 공기 오염의 측정이 요구되는 장소 내 적절한 지점들에 배치된다. 이들은 일반적으로 배양 매체(culture medium)에 연결된 공기 샘플러로 구성된다. 공기 샘플러에서 수집되는 공기는 배양 매질과 접촉하게 되고; 수집된 공기에 포함된 임의의 미생물은 배양 매질에 적층된다. 배양 매질은 회수되어 미생물의 성장을 촉진하기 위해 스토브에 배치된다. 따라서, 종래의 미생물학적 기술에 의해 미생물을 검출하고 식별하는 것이 가능하다.

그럼에도 불구하고 이들 디바이스는 사용되는 기술과 연관된 주요한 단점을 가지고 있다. 이 단점은 분석 결과를 얻는데 많은 시간이 든다는 것이다. 사실, 미생물학, 특히 세균학에 있던 종래 기술의 사용은 식별을 하기 위해 특정 배양 매질 상에서 세포가 성장하거나 심지어 자생하는 단계에 필요한 배양 시간(incubation times)을 요구한다. 그 결과, 병원내 감염 또는 음식 중독을 일으킨 병원균을 검출하고 식별하고자 할 때, 결과를 얻는데 드는 시간이 상대적으로 길거나 심지어 너무 길다.

이런 타입의 디바이스의 다른 타입은 배양 매질의 사용이 박테리아의 종(species)과 속(genera)을 식별하는 것을 가능하게 하더라도, 일반적으로 이것이 하나의 동일한 박테리아 종의 계통(strain)을 구별하지 못한다는 것이다. 이제, 미생물의 병원성은 해당 계통에 따라 상당히 변할 수 있다는 것이 알려져 있다.

나아가, 이런 유형의 디바이스는 생존할 수는 있으나 배양될 수 없는 공기 중에 떠도는 미생물을 검출할 수는 없다는 단점이 있다.

나아가, 공기 중에 떠도는 입자, 특히 미생물을 회수하도록 의도된 디바이스들이 있다. 따라서, 문헌 GB-2 254 024호는 사이클론 효과(cyclone effect)에 기초한 원리에 따라 공기 중에 떠도는 입자를 수집하는 디바이스를 기술한다. 이 디바이스가 미생물을 포함하여 공기 중에 떠도는 입자를 수집하는데 적합한 것으로 발견된다 하더라도, 이것은 이렇게 얻어진 샘플을 처리하는데 특히 분석에 사용되는 유전 물질을 추출하는데에는 사용된 적이 없다.

보다 일반적으로, 임상적 샘플에 대하여든 또는 환경적 샘플에 대하여든 상관없이 미생물을 식별하는 능력 및/또는 결과를 전달하는 속도에 있어 가장 관련있는 기술은 의심의 여지 없이 분자 진단 기술이다. 미생물의 유전 물질과, 특히 관심 있는 특정 시퀀스(sequence : 염기서열)를 분석한 것에 기초하는 이 기술은 배양 단계를 생략할 수 있게 하므로 기록 시간(record time)에 미생물의 식별을 매우 정확히 얻는 것을 가능하게 한다.

그럼에도 불구하고, 이러한 기술의 사용은 특정 제한이 있는데, 그 중 가장 중요한 것은 분석을 수행하기 위해 회수가능한 공기 중에 존재하는 미생물의 양이 잠재적으로 제한되어 있다는 것이다. 사실, 특정 임상적 샘플 뿐만 아니라 환경적 샘플이 미생물에 상대적으로 열악하다는 것이 알려져 있다. 그 결과, 유전 물질의 작은 양만이 이 원재료로부터 얻어진다. 핵산을 추출하는데 사용되는 기술의 성능이 수율 면에서 결정적인 파라미터가 된다.

나아가, 미생물을 분해하는 현존하는 기술의 대부분은 모든 미생물에 일반적으로 적용되는 것이 아니고 및/또는 수동적인 단계를 처리하기 위해 자격 있는 사람의 개입을 요구한다.

문헌 WO-A-2005/038025호는 특히 공기 샘플로부터 나온 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 기술한다. 본 방법은 3가지의 상이한 분해 방법, 즉 화학적 분해 방법, 열 충격에 의한 분해 방법 및 기계적 분해 방법의 사용을 포함한다. 이 방법이 핵산을 추출하는 효율을 최적화시켜 분석에 이용가능한 유전 물질의 양을 확실히 증가시킬 수 있다 하더라도, 이러한 효율은 여전히 회수된 미생물의 양에 따라 좌우된다. 그러나, 이 미생물의 회수를 최적화하는 것에 대해서는 이 문헌에 전혀 기술된 것이 없다.

문헌 US-5,707,861호는 미생물과 같은 살아있는 세포를 분쇄하는 디바이스를 기술한다. 이 디바이스는 유리 비드를 사용하나 이에 더하여 미생물을 포함하는 튜브들과 이 튜브들을 고정하는 지지대에 있는 홀 사이에 존재하는 갭으로 인한 진동 효과에 의해 세포를 분해하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 이런 종류의 디바이스는 세포 분해를 최적화하여 유전 물질의 추출을 최적화하는 것을 가능하게 한다. 이 디바이스 및 이에 의해 사용되는 방법은 전술된 것과 동일한 제한을 가지고 있는데, 즉 이들은 회수되는 미생물의 양에 여전히 좌우된다. 나아가, 이들은 세포 파편으로부터 핵산을 분리하기 위하여 핵산을 농축하는 후속 단계를 요구하는 추가적인 단점을 가지고 있다. 마지막으로, 이들은 농축 단계의 종료시에 핵산을 수동적으로 회수할 것을 요구한다.

이들 문제들은 문헌 US-5,567,050호에 기술된 디바이스에서도 또한 발생한다.

보다 일체화된 시스템이 또한 기술되어 있다. 따라서, 문헌 WO-A-2004 /018704호는 공기로부터 미생물을 수집하고 이들을 식별하기 위해 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭 기술을 사용하는 디바이스 및 이와 연관된 방법을 기술한다. 이 시스템은 특히 우편 분류 센터(postal sorting centers)에 생물학적 오염에 의한 의도된 공격을 다루기에 적절하다. 이 시스템은 우편을 보내는 회로를 따라 위치하는 공기 샘플러, 사이클론 효과에 의해 입자를 필터링하고 분리하는 디바이스, 액체 샘플에 있는 입자들을 농축하고 회수하는 디바이스 및 샘플의 부분을 Cepheid 사로부터 GeneXpert^TM PCR 분석 카트리지로 전달하는 디바이스로 구성된다. 이후 카트리지는 공기로부터 수집된 미생물 또는 미생물들을 식별하기 위해 별도의 자동 생물학적 분석기로 수동으로 전달된다.

이 시스템은 전술된 디바이스와 방법과 연관된 매우 많은 기술적 문제를 해결하는 것을 가능하게 하지만, 그럼에도 불구하고 이것은 몇몇 주요 단점을 가지고 있다. 이들 단점 중 제 1 단점은 분석 카트리지로 전달하기 전에 샘플을 처리(수집, 분리, 농축/회수)하는 시스템이 상대적으로 복잡하고 비싸다는 것이다. 다른 단점은 핵산의 분해와 정화를 수행할 수 있는 GeneXpert^TM 카트리지가 없다는 것이다. 그러나, 제 2 단점은 수집된 미생물이 액체 샘플에 회수되는데 이 중 일부분만이 분석된다는 것이다. 이것은 미생물 전부, 그리하여 핵산의 전부를 회수하지 않는 위험이 매우 높아, 분석의 관련성을 크게 제한할 수 있다는 것을 의미한다. 나아가, 그 복잡성에도 불구하고, 이 시스템은 GeneXpert^TM 자동 분석기로 카트리지를 수동으로 전달할 것을 요구한다.

따라서, 본 발명의 제 1 목적은 선택적으로 식물 상태에서 또는 포자 형태로 미생물이 박테리아이든, 바이러스이든 또는 균류이든 상관없이 매우 다양한 미생물에 대해 환경적 샘플과 임상적 샘플 모두에 효과적인 범용 분해 디바이스, 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 일체화된 방식으로 분석하기 위해 미생물로부터 핵산을 추출하고 이 핵산을 회수하기 위하여 공기와 같은 환경적 샘플에 또는 임상적 샘플에 포함된 미생물을 효과적으로 분해하기에 적합한 디바이스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 공기 샘플에 포함된 미생물 전부를 수집하기에 적합한 디바이스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 수동적인 단계의 수와 복잡성을 최소화하는 간단한 디자인의 디바이스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 극히 콤팩트한 디바이스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 외적으로 오염될 위험 없이 위에 나열된 여러 단계들이 일어나는 폐쇄된 디바이스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 오퍼레이터에 의해 샘플을 전달할 필요 없이 상기 단계들이 일어나서 샘플의 오염을 방지하는 디바이스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 사람의 개입을 제한하고 샘플 처리의 추적 가능성을 개선하는 디바이스 및 시스템을 제공하는 것이다.

마지막으로, 본 발명의 다른 목적은 원심력이나 필터링과 같은 추가적인 선처리 단계 없이, 예를 들어 증폭 및 검출 단계를 포함하는 분자 진단 단계에서 직접 사용될 수 있는 완충액(buffer)에 표적 핵산을 공급할 수 있는 디바이스 및 자동화된 시스템을 제공하는 것이다.

상기 목적들은 특히 본 발명에 의해 달성되며, 본 발명은 첫째, 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스로서,

- 공기 수집 모듈로서,

ⅰ. 상기 모듈 안으로 공기 스트림의 진입을 허용하며 그 베이스에 공기 스트림을 교란시키는 수단을 구비하는 공기 진입 덕트를 가지는 상부 부재와,

ⅱ. 생성된 공기 스트림을 빠져나가게 하는 공기 배출 수단을 구비하는 하부 부재를 구비하며,

상기 상부 부재와 하부 부재는 공기 스트림이 상기 공기 수집 모듈 내에 생성될 수 있도록 서로 일체형으로 제조될 수 있는, 공기 수집 모듈과,

- 상기 공기 수집 모듈 내에 위치하며, 미생물을 분해하는 수단을 구비하는 미생물 보유 영역을 가지는 대략 원통형 형상의 카트리지

를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 미생물을 수집하는 디바이스의 카트리지의 미생물 보유 영역은 미생물을 보유하고, 제 위치에서 분해하는 수단을 구비하고 액체의 존재에서 용해될 수 있는 물질을 더 포함한다.

본 발명에 따른 디바이스에서, 상기 공기 스트림을 교란시키는 수단은 공기 진입 덕트의 보어(bore)의 중심에 위치하는 첨두 아치 형상의 콘(30)과, 공기 진입 덕트의 내부면에 상기 첨두 아치 형상의 부분을 연결하는 적어도 하나의 블레이드를 포함한다.

유리하게는, 상기 공기 수집 모듈은 공기를 재순환시키는 회로를 공기를 흡입하는 디바이스에 연결하도록 의도된다.

본 발명은 또한 미생물을 분해하는 디바이스로서,

- 미생물 보유 영역을 가지며 고정자 역할을 수행하는 대략 원통형 형상의 카트리지와;

- 상기 카트리지 안에 배치될 수 있고 회전 수단을 구비하는 회전자

를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물을 분해하는 디바이스에 관한 것이다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 디바이스는 상기 카트리지와 일체형으로 상기 회전자를 유지하는 캡을 더 포함한다.

유리하게는, 상기 회전 수단은 블라인드 덕트의 벽에 만들어진 그루브로 구성되고, 상기 그루브는 상기 회전자를 회전시키는 수단의 트랜스미션 샤프트의 단부를 수용하도록 의도되고 대각선으로 맞은편에 위치한다.

상기 미생물을 분해하는 디바이스의 주목할만한 특징에 따르면, 상기 카트리지의 내부 직경은 상기 회전자의 외부 직경보다 커서, 회전자가 카트리지 내에 장착될 때, 카트리지의 내부벽에서 회전자의 외부벽을 분리하는 거리는 분해 수단이 이 틈새 공간에 위치하게 할만큼 충분히 크고 분해 수단이 상기 벽들 중 하나 또는 다른 하나의 벽과 접촉할 만큼 충분히 작다.

나아가, 본 발명은 미생물을 분해하고 미생물의 핵산을 정화하는 시스템으로서,

- 본 발명에 따른 미생물을 분해하는 디바이스를 위치시키는 수단과;

- 상기 위치시키는 수단에 분해 디바이스가 놓일 때 회전자를 회전시키는 수단과;

- 핵산을 수용하는 적어도 하나의 용기와;

- 액체를 흡입하고 배출하는 적어도 하나의 수단과;

- 미생물을 분해하는 수단과 정화된 핵산을 수용하는 용기와 액체를 흡입하고 배출하는 수단과 유체 연통 가능하게 연결된 다방향 밸브

를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물을 분해하고 미생물의 핵산을 정화하는 시스템에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 미생물을 분해하고 미생물의 핵산을 정화하는 시스템은 자화 수단을 더 포함한다. 본 시스템은 가열 수단을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 실시예에 따르면, 상기 다방향 밸브는 흡입-배출 수단을 포함한다.

본 발명은 또한 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 방법으로서,

a) 본 발명에 따른 미생물을 수집하는 디바이스를 얻기 위해 카트리지 내 보유 영역이 공기 수집 모듈의 공기 진입 덕트와 연통가능하게 상기 공기 수집 모듈 내에 카트리지를 배치하는 단계와,

b) 임의의 적절한 수단에 의해 상기 공기 수집 모듈 안으로 공기를 주입하는 단계와,

c) 상기 카트리지의 보유 영역에 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 공기 중에 떠도는 미생물을 분해하는 방법으로서,

a) 본 발명에 따른 미생물을 수집하는 디바이스를 얻기 위해 카트리지 내의 보유 영역이 공기 수집 모듈의 공기 진입 덕트와 연통 가능하게 공기 수집 모듈 내에 카트리지를 배치하는 단계와,

b) 임의의 적절한 수단에 의해 공기 수집 모듈 안으로 공기를 주입하는 단계와,

c) 상기 카트리지의 보유 영역에 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 단계와,

d) 공기 수집 모듈로부터 카트리지를 제거하는 단계와,

e) 미생물을 분해하는 디바이스를 얻기 위해 카트리지 내에 회전자를 배치하는 단계와,

f) 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템에 미생물을 분해하는 디바이스를 위치시키는 단계와,

g) 카트리지의 미생물 보유 영역에 위치된 분해 수단을 매달기 위해 카트리지 내에 용리 액체를 주입하는 단계와,

h) 미생물을 분해하는 수단을 회전시키는 상기 회전자의 회전 수단에 의해 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 미생물을 기계적으로 분해하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 분해하는 방법에 관한 것이다.

"용리 액체(elution liquid)"란 우수한 상태로 핵산을 분해하거나 심지어 핵산을 추출하고 회수하기에 적합한 임의의 액체를 의미한다. 이 액체는 일반적으로 완충액(buffer)이다. 본 발명에 따른 방법의 적용이 분석을 위하여 핵산을 추출하고 이를 회수하기 위한 것인 경우에 상기 완충액은 핵산의 보존을 가능하게 한다. 이런 종류의 액체는 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법으로서,

a) 본 발명에 따른 미생물을 수집하는 디바이스를 얻기 위해 카트리지 내 보유 영역이 공기 수집 모듈의 공기 진입 덕트와 연통 가능하게 공기 수집 모듈 내에 카트리지를 배치하는 단계와,

b) 임의의 적절한 수단에 의해 공기 수집 모듈 안으로 공기를 주입하는 단계와,

c) 카트리지의 보유 영역에 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 단계와,

d) 공기 수집 모듈로부터 카트리지를 제거하는 단계와,

e) 카트리지에 회전자를 배치하는 단계와,

f) 카트리지에 포함된 분해 수단을 매달기 위해 흡입-배출 수단에 의해 카트리지에 용리 액체를 주입하는 단계와,

g) 분해 수단을 회전시키는 상기 회전자의 회전 수단에 의해 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 미생물을 기계적으로 분해하는 단계와,

h) 분해 동안 방출된 상기 미생물의 핵산을 포함하는 용리 액체를 흡입하는 단계와,

i) 핵산을 수용하고 정화하기 위해 용기에 용리 용액을 분배하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 방법은 핵산을 세척하고 정화하는 단계를 더 포함한다.

바람직하게는, 전술된 미생물을 분해하고 핵산을 추출하는 본 방법은 카트리지의 보유 영역에 농축된 미생물을 성장시키는 것으로 구성되는 추가적인 단계(d')를 포함한다.

유리하게는, 상기 성장은 2 내지 24시간의 범위의 시간 동안 스토브에서 카트리지를 배양하여 달성된다.

바람직하게는, 전술된 미생물을 분해하고 핵산을 추출하는 본 방법의 단계 f) 내지 단계 i)는 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템에 사용된다.

본 발명은 또한, 미생물을 분해하는 방법으로서,

a) 카트리지의 보유 영역에 미생물이 농축되는 카트리지를 얻는 단계와,

b) 카트리지에 회전자를 배치하는 단계와,

c) 카트리지의 미생물 보유 영역에 위치한 분해 수단을 매달기 위해 카트리지에 용리 액체를 주입하는 단계와,

d) 미생물을 분해하는 수단을 회전시키는, 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 미생물을 기계적으로 분해하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 미생물을 분해하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법으로서,

a) 보유 영역에 미생물이 농축되는 카트리지를 얻는 단계와,

b) 카트리지에 회전자를 배치하는 단계와,

c) 카트리지의 미생물 보유 영역에 위치하게 분해 수단을 매달기 위해 카트리지에 용리 액체를 주입하는 단계와,

d) 미생물을 분해하는 수단을 회전시키는 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 미생물을 기계적으로 분해하는 단계와,

e) 분해 동안 방출된 미생물의 핵산을 포함하는 용리 액체를 흡입하는 단계와,

f) 핵산을 수용하고 정화하기 위해 용기에 용리 액체를 분배하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다.

일 실시예에서 본 발명은, 핵산을 세척하고 정화하는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 더 나아가 액체 샘플에 포함된 미생물을 분해하는 방법으로서,

a) 보유 영역 부근의 카트리지 내에 미생물을 포함하는 액체 샘플을 주입하여 상기 액체 샘플이 카트리지의 미생물 보유 영역에 위치된 분해 수단에 매달리게 하는 단계와,

b) 카트리지 내에 회전자를 배치하는 단계와,

c) 미생물을 보유하는 분해 수단을 회전시키는 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 미생물을 기계적으로 분해하는 단계로서, 상기 회전은 카트리지의 미생물 보유 영역에 위치된 분해 수단을 매달리게 하는, 미생물을 기계적으로 분해하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 액체 샘플에 포함된 미생물을 분해하는 방법에 관한 것이다.

"액체 샘플(liquid sample)"은 미생물을 포함할 수 있는 임의의 액체 샘플을 의미한다. 이것은 사람 또는 동물 기원의 액체 샘플일 수 있다. 상기 샘플은 예를 들어 소변, 전체 혈액, 혈장 또는 임의의 다른 신체의 유체일 수 있다. 액체 샘플은 음료와 같은 음식 기원일 수 있다. 이것은 또한 물과 같은 환경 기원일 수 있다. 나아가, 액체 샘플은 또한 flockedSWABS 라는 이름으로 COPAN사에서 시판하는 것과 같은 스와브(swab) 형태의 표면 샘플링 디바이스에 존재하는 임의의 미생물이 전달 액체에서 스와브를 교반하는 것에 의해 다시 떠 있는 상태의 소위 전달 액체일 수 있다.

본 발명은 또한 액체 샘플에 포함된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법으로서,

a) 보유 영역 부근에 카트리지 내 미생물을 포함하는 액체 샘플을 주입하여 액체 샘플이 카트리지의 미생물 보유 영역에 위치된 분해 수단에 매달리는 단계와,

b) 카트리지 내 회전자를 배치하는 단계와,

c) 분해 수단을 회전시키는 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 미생물을 기계적으로 분해하는 단계로서, 상기 회전은 카트리지의 미생물 보유 영역에 위치된 분해 수단을 매달리게 하는, 미생물을 기계적으로 분해하는 단계와,

d) 분해 동안 방출된 미생물의 핵산을 포함하는 액체 샘플을 주입하는 단계와,

e) 핵산을 수용하고 정화하기 위해 용기에 액체 샘플을 분배하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 액체 샘플에 포함된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가 세포 조직의 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법으로서,

a) 용리 액체의 존재에서 카트리지 내에 세포 조직의 샘플을 주입하는 단계와,

b) 카트리지 내에 회전자를 배치하는 단계와,

c) 카트리지 내에 포함된 분해 수단을 회전시키는 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 세포 조직의 세포를 기계적으로 분해하는 단계와,

d) 분해 동안 방출된 세포로부터 나온 핵산을 포함하는 용리 액체를 흡입하는 단계와,

e) 핵산을 수용하고 정화하기 위해 용기에 용리 액체를 분배하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 세포 조직의 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 방법은 핵산을 세척하고 정화하는 단계를 더 포함한다.

"조직 샘플(tissue sample)"은 핵산을 추출하는 것이 가능한 사람 또는 동물 기원의 임의의 조직 샘플을 의미한다. 이 샘플은 예를 들어 기관, 근육 또는 피부의 생체 검사에 의해 얻어질 수 있다. 이들 조직은 건강한 것이거나 병원성, 특히 종양인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 핵산을 추출하는 모든 방법은 유리한 실시예에 따라 증폭과 같은 후속적인 처리를 고려하여 핵산을 정화하는 추가적인 단계를 가질 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 이 정화 단계는 분해 단계에서 소금으로 핵산과 다른 세포 구성성분 사이에 분리를 가능하게 한다. 이 단계는 일반적으로 핵산을 농축하는 것을 가능하며 DNA 또는 RNA를 정화하도록 적응될 수 있다. 이것은 자성 입자에 의하여 수행될 수 있다. 일례로서, 흡착 또는 공유 결합(특허 US 4,672,040 및 US 5,750,338 참조)에 의해 올리고뉴클레오티드로 선택적으로 코팅된 자성 입자를 사용하여 세척 단계에 의해 자성 입자에 들러붙는 핵산을 정화하는 것이 가능하다. 핵산을 정화하는 단계는 특히 핵산의 후속적인 증폭이 요구되는 경우 유리하다. 이 자성 입자의 특히 흥미있는 실시예는 특허 출원 WO-A-97/45202 및 WO-A-99/35500호에 기술되어 있다. 핵산을 정화하는 방법의 다른 흥미있는 예는 컬럼의 형태 또는 불활성 입자의 형태{Boom R. 등, J. Clin. Microbiol., 1990, No. 28(3), p. 495-503} 또는 자성 입자의 형태{Merck: MagPrp(등록상표) Silica, Promega: MagneSil^TM, 상자성 입자}로 실리카를 사용하는 것이다. 다른 널리 사용되는 방법들은 컬럼 또는 상자성 입자 포맷에 이온 교환 수지에 기초한다(Whatman: DEAE-Magarose)(Levison PR 등, J. Chromatography, 1998, p. 337-344). 매우 관련 있으나 본 발명에서 독점하는 것은 아닌 다른 방법은 금속 산화물 지지부(Xtrana사로부터: Xtra-Bind^TM 매트릭스)에 흡착하는 것이다.

나아가, 전술된 여러 방법에서, 일단 회전자가 카트리지에 배치되면, 미생물을 분해하는 디바이스의 재구성에 따른 모든 단계들은 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템에 유리하게 사용될 수 있다.

더 나아가 본 발명은 세포 조직의 샘플의 세포를 분해하기 위해 본 발명에 따른 미생물을 분해하는 디바이스의 사용에 관한 것이다.

더 나아가 본 발명은 분석을 위하여 세포 조직의 샘플의 세포를 분해하고 상기 세포의 핵산을 정화하기 위해 본 발명에 따른 미생물을 분해하고 미생물의 핵산을 정화하는 시스템의 사용에 관한 것이다.

미생물은, 박테리아, 바이러스, 효모, 곰팡이 및 기생충을 포함하는 군으로부터 취해진다.

미생물이 분리되는 샘플은 환경에서 기원된다. 따라서, 이는 공기 또는 물과 같은 액체의 샘플이거나 또는 표면 샘플일 수 있다. 이 샘플은 또한 임상적 기원, 즉 미생물, 선택적으로 병원성 미생물을 검출하고 식별하는 분석 대상일 수 있는 사람 또는 사람 기원의 임의의 샘플일 수 있다.

표적 핵산의 존재는 교배 반응의 시각화에 의해 실증될 수 있다. 교배 반응이란 포획된 핵산과, NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification) 타입 또는 PCR (Polymerase Chain Reaction)의 전사, 역전사 또는 증폭 단계에 의해 분리되거나 생성된 표적 핵산 사이의 임의의 반응을 의미한다.

핵산(nucleic acid)이란 올리고뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오산 및 리보뉴클레오산 및 그 유도체를 의미한다. 올리고뉴클레오티드라는 용어는 적어도 부분적으로 상보적일 수 있는 올리고뉴클레오티드에 적절한 교배 조건에서 교배할 수 있는, 자연 또는 변성된 적어도 2개의 뉴클레오티드(디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 둘 다)의 시퀀스(sequence)를 나타낸다. 변성된 뉴클레오티드란 예를 들어 변성된 베이스를 가지고 및/또는 뉴클레오티드간 결합에 및/또는 백본에 변형을 가지고 있는 뉴클레오티드를 의미한다. 변성된 베이스의 일례로는, 이노신, 메틸-5-디옥시사이티딘, 디메틸아미노-5-디옥시우리딘, 디아미노-2,6-푸린 및 브로모-5-디옥시우리딘을 들 수 있다.

변성된 뉴클레오티드간 결합을 예시하기 위하여, 포스포로티오에이트, N-알킬포스포아미데이트, 알킬포스포네이트 및 알킬포스포디에스테르 결합을 들 수 있다.

FR-A-2 607 507호에 기술된 바와 같은 알파-올리고뉴클레오티드, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 8, Issue 16, 18 August 1998, pages 2219-2222에 기술된 포스포로티오에이트-LNA와 2'-티오-LNA와 같은 LNA, 및 M. Egholm 등, J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897의 논문에 논의된 PNA는 변성된 백본과 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드의 예들이다.

교배 반응은 직접 또는 간섭 수단과 같은 임의의 검출 수단에 의하여 시각화될 수 있다.

라벨링을 사용하지 않는 직접 검출의 경우에, 교배 반응은 전도성 중합체를 지지하는 전극 위에 플라스몬 공진(plasmon resonance) 또는 사이클릭 볼타메트리(cyclic voltammetry)에 의해 관찰된다.

라벨링에 의하여 간접 검출의 경우, 라벨링은 표적 핵산 바로 위에 또는 미리 라벨링된 핵산의 특정 결합 파트너를 통해 수행될 수 있다.

표적 핵산의 특정 결합 파트너란 표적 핵산에 결합할 수 있는 임의의 파트너를 의미하고, 예로는 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 효소 기판을 들 수 있다.

"라벨링(labeling)"이란 검출가능한 신호를 직접 또는 간접 생성할 수 있는 표시자(marker)를 의미한다. 이들 표시자의 비한정적인 리스트는, 예를 들어 전기화학, 색채계, 형광, 발광에 의하여 검출될 수 있는 신호를 생성하는 효소; 호스래디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase)(HRP), 알칼리 포스파타제(ALP), α-갈락토시다제, 글루코제-6-포스페이트 디하이드로제나제와 같은 효소; 효소 억제제; 효소 공동인자(cofactor); 금 입자, 자성 라텍스, 리포솜(liposome)과 같은 입자; 발광 화합물, 염료와 같은 발색단(chromophore); ³²P, ³⁵S 또는 ¹²⁵I와 같은 방사성 분자; 플루오레세인, 로다민, Alexa(등록상표), 움벨리페론, 루미놀 또는 피코시아닌과 같은 형광 분자를 포함한다. 형광의 경우에, 이는 효소 기판 반응, 플루오로포어-소광제(fluorophore-quencher)의 조합, 형광 소거(extinction) 또는 형광 특성에 기초한 임의의 다른 시스템의 형광 제품일 수 있다.

간접 시스템은 또한 예를 들어 다른 리간드/안티리간드 쌍을 통해 사용될 수 있다. 리간드/안티리간드 쌍은 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 다음 쌍들, 즉 바이오틴/스트렙타비딘, 슈거/렉틴, 폴리뉴클레오티드/상보적인 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 이 경우에, 결합제를 운반하는 것은 리간드이다. 안티리간드는 앞 문단에서 기술된 표시자에 의해 간접적으로 검출될 수 있거나 또는 리간드/안티리간드에 의해 그 자체가 검출될 수 있다.

이들 간접 검출 시스템은 특정 조건에서 신호를 증폭할 수 있다. 이 신호 증폭 기술은 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게는 잘 알려져 있으며, 참고를 위해 출원인의 이전 특허 출원 FR-A-2 781 802호 또는 WO-A-95/08000호 또는 논문 J. Histochem. Cytochem. 45: 481-491, 1997를 들 수 있다.

표적 핵산은 분자 "내(within)" 병합에 의해 또는 종단에서 폴리머라제에 의해, 키나제에 의해 랜덤하거나 특정하게 표시자의 직접 또는 간접 병합에 의해 미리 라벨링될 수 있다.

표적 분해의 특정 결합 파트너의 라벨링은 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의해 널리 알려져 있으며, 예를 들어 Greg T. Hermanson에 의해 Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press Inc, 525B street, San Diego, CA92101 USA에 기술되어 있다.

예를 들어 효소를 사용하여 사용되는 공액(conjugate)의 라벨링의 유형에 따라, 이 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자라면 이 라벨링의 시각화를 가능하게 하는 작용제를 추가할 수 있을 것이다. 이 단계는 검출에 해당한다. 이는 배경 잡음을 제한하기 위하여 약하게 또는 비 특정하게 결합되거나 반응에 수반되지 않은 요소 또는 분해의 부분을 제거하기 위해 세척 완충액의 사용보다 앞선다.

본 발명에 따른 디바이스의 목적과 잇점은 도면을 참조하여 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아닌 아래에 제공된 예로부터 더 잘 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 미생물을 수집하고 분해하는데 사용되는 카트리지의 길이방향 단면도.
도 2는 특정 실시예에 따라 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스의 길이방향 단면도.
도 3은 도 1에 도시된 미생물 수집 디바이스의 길이방향 단면의 부분 확대도.
도 4는 미생물 수집 디바이스의 상부 부분의 내부를 도시하는 사시도.
도 5는 도 3에 도시된 미생물 수집 디바이스의 상부 부분의 내부를 도시하는 부분 사시도.
도 6은 미생물을 분해하는 디바이스의 길이방향 단면을 도시하는 도면.
도 7은 미생물을 분해하는 디바이스와 다방향 밸브로 구성된 조립체의 길이방향 단면을 도시하는 도면.
도 8a는 다방향 밸브의 제 1 구성으로 다방향 밸브의 레벨에서 미생물을 분해하는 시스템의 길이방향 단면을 도시하는 부분 사시도.
도 8b는 다방향 밸브의 제 2 구성으로 다방향 밸브의 레벨에서 미생물을 분해하는 시스템의 길이방향 단면을 도시하는 부분 사시도.

도 1에서 길이방향 단면도로 도시된 카트리지(10)는 대략 원형 단면의 원통(cylinder)의 일반 형태를 가지고 있다. 이 원통의 상부 단부는 자유로운 반면, 하부 단부는 벽으로 구성되고, 그 중심에는 홀(hole)이 있고 이 홀에서 연장하여 카트리지(10) 안으로 연장하는 덕트(12)가 있다. 이 덕트의 내부 단면은 그 상부 단부로 갈수록 감소하는 것을 볼 수 있다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 카트리지(10)의 하부 벽(14)의 내부면은 경사져 있고 이 경사면의 최저 점은 덕트(12)와 접촉한 곳에 위치하고 최고 점은 카트리지(10)의 수직 벽(16)과 접촉해 있다. 이 벽(14)은 분해 수단(lysis means)(18)을 지지하는 역할을 하고 미생물 보유 영역(microorganism retention zone)을 구성한다. 이 분해 수단은 이 경우에 동일한 사이즈의 비드(bead)로 구성된다. 바람직한 실시예에 따라, 이들 비드는 유리로 되어 있다. 그러나, 이들은 철(iron)과 같은 임의의 다른 균등 물질로 구성될 수 있다. 이들 비드는 유리하게는 200 내지 800마이크로미터(㎛)의 직경을 가진다.

유리한 실시예에 따라, 이 비드는 상이한 사이즈로 이루어질 수 있다. 따라서, 400 내지 600㎛의 직경을 갖는 비드와 200 내지 300㎛의 직경을 갖는 비드의 혼합물을 사용하는 것이 특히 적절할 수 있다. 이 비드는 예를 들어 425-600㎛의 산으로 세척된 유리 비드(Acid-washed glass beads), Ref: G8772 라는 명칭으로 SIGMA사에서 시판하는 것일 수 있다.

이 비드는 바람직하게는 이 비드 위에 배치된 젤리 타입의 물질 층(19)에 의하여 하나 이상의 상부 배치된 층 형태로 제 위치에 배치된다. 젤리 타입의 물질은 여러 요구조건을 충족하여야 한다. 첫째는 카트리지 내에 사용되는 절차에 영향을 미치지 않기 위해 불활성이어야 한다는 것이다. 둘째는 미생물을 분해하는데 적용하기 위해 액체로 용해될 수 있는 능력이 있어야 한다는 것이다. 상기 물질은 예를 들어 아가로스 겔(agarose gell)(Sigma Aldich, Agarose - Type I-B Low EEO, Ref.: A0576-25G)일 수 있다. 이 젤리 타입의 물질은 또한 글리세롤을 포함할 수 있다.

대안적으로, 젤리 타입의 물질은 유리하게는 미생물을 배양하기 위한 매질(culture medium)일 수 있다. 사실, 배지 배양 매질(agar culture media)은 종래 시험관 진단 분야에서 오랫 동안 사용된 것이다. 상기 배양 매질의 사용은 여러 잇점을 제공한다. 주된 잇점은 분해를 수행하기 전에 미생물의 성장 단계를 가능하게 하는 것이다. 본 발명에 따른 디바이스가 병원성 미생물의 신속한 검출과 연관된 요구를 충족하는 것을 목적으로 하고 있음에도 불구하고 수 분 내지 수 시간의 성장 단계는 대량의 핵산이 처분되는 직접적인 결과를 가지고 있는 미생물의 증식을 가능하게 할 수 있다(이것은 분석 시작이 적절할 때까지 제어를 요하는 룸에서 수집된 공기 샘플을 회수하고 이송하는데 내재된 지연을 이용하는 것을 가능하게 한다). 배양 매질을 사용하는 두 번째 잇점은 배양 매질이 하나 이상의 주어진 종에 대해 선택될 수 있다는 것이다. 그 결과, 이들 매질의 사용은 분석에 방해가 될 수 있는 관심 없는 다른 미생물을 희생시키고 특정 병원성 미생물을 선택적으로 성장시켜 검출하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 미생물의 특정 종을 검출하는데 각각 적응된 여러 상이한 카트리지의 제공이 고려될 수 있다.

카트리지(10)의 크기는 예를 들어, 내부 직경이 8 내지 16mm일 수 있고, 바람직하게는 12mm일 수 있다. 비드 층의 총 두께는 일반적으로 1 내지 2mm 이고, 이는 0.1 내지 1g, 바람직하게는 0.3g의 유리 비드의 양에 대응한다.

카트리지(10)는 유리하게는 사출 성형 기술에 의하여 만들어진다. 사용되는 물질은 예를 들어, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 고리형 사이클로-올레핀(CCO) 또는 PMMA이며; 폴리카보네이트가 바람직하다.

미생물 수집 디바이스(20)가 도 2에 도시되어 있다. 이 디바이스는 카트리지(10)가 그 안에 놓이는 공기 수집 모듈로 구성된다. 이 공기 수집 모듈은 상부 부재(22)와 하부 부재(24)로 구성된다.

상부 부재(22)는 일반적으로 원통형 형상이다. 이 상부 부재의 사시도가 또한 도 4 및 도 5에 도시되어 있다. 이 원통의 하부 단부는 자유로운 반면, 상부 단부는 수평 벽(26)에 의해 부분적으로 밀봉된다. 이 벽(26)은 그 중심에 덕트(28)에 의해 상부 부재(22) 안으로 연장하는 홀을 구비한다. 이 부분은 사실 공기 수집 모듈(20) 안으로 공기를 진입시키는 덕트를 구성한다. 특정 실시예에 따라, 이 공기 진입 덕트는 임의의 적절한 수단에 의하여 공기 재순환 회로 채널에 연결될 수 있다. 첨두 아치 형상의 콘(ogive-shaped cone)(30)이 이 덕트의 베이스의 중심에 위치된다. 이 콘(30)은 블레이드(32)에 의하여 덕트(28)의 벽에 연결된다. 이 블레이드(32)는 도 4 및 도 5에서 명확히 볼 수 있다. 이들 다이아그램에서 제시된 실시예에서, 이들 블레이드는 3개이다. 그러나, 이 개수는 변할 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 콘(30)-블레이드(32)의 조립체의 역할은 덕트(28)의 베이스에서 미생물 수집 디바이스에 들어가는 공기 스트림을 교란시키는 것이며 이에 따라 이 교란된 스트림이 미생물 보유 영역의 젤리 타입의 물질과 접촉하게 되고 이어 미생물 보유 영역의 젤리 타입의 물질을 움푹 들어가게 하는 중공 현상을 유도한다(hollowing). 이 중공 상태는 공중에 떠도는 미생물의 포획을 상당히 개선시킨다.

도 2 및 도 4에 도시된 바와 같이, 상부 부재(22)는 3개의 센터링 핀(34)과 3개의 록킹 핀(38)을 더 구비한다. 센터링 핀(34)은 상부 부재(22)에 대해 카트리지(10)의 적절한 센터링을 보장하기 위한 것이다. 록킹 핀(38)은 상부 부재(22) 상의 센터링된 위치에 카트리지를 고정하는 것을 제공한다. 이것은 도 2에 명확히 도시되어 있다.

상부 부재(22)는 그 하부 부분에 쇼울더와 그루브를 구비하며 이 쇼울더와 그루브는 수직벽의 전체 외주면 상에 만들어지고 상부 부재(22)와 하부 부재(24)의 상호 연결을 용이하게 하기 위해 의도된 것이다.

또한 하부 부재(24)는 일반적인 원통형 형상으로 되어 있다. 이 원통의 상부 단부는 자유로운 반면, 하부 단부는 공기를 배출하기 위해 대략 원통형 개구(42)를 그 중심 부분에 가지는 수평 벽(40)에 의해 부분적으로 밀봉된다. 하부 부재(24)는 카트리지(10)를 지지하고 위치지정하는 핀(44)을 더 포함한다. 하부 부재(24)는 상부 부재(22) 상에 위치지정될 수 있다. 카트리지(10)는 핀(44)에 의하여 하부 부재(24) 상에 놓이게 다시 위치지정된다. 사실, 카트리지(10)가 하부 부재(24)에 놓일 때, 부재(44)는 카트리지의 덕트(12) 안으로 들어가, 올바른 위치에 카트리지를 놓고 고정시키게 한다.

하부 부재(24)의 수직 원형 벽의 상부 단부는 그 내부면에 이 벽의 전체 외주면에 만들어진 립(lip)을 구비할 수 있다. 이 립은 상부 부재(22)와 하부 부재(24) 사이를 고정하기 위하여 상부 부재(22)에 제공된 쇼울더와 그루브와 상호작용하도록 의도된 것이다. 상부 부재(22)와 하부 부재(24)를 서로 끼워 맞추는 것은 하부 단부와 상부 단부의 상보적인 형상에 의해 가능하다. 이러한 연결은 서로 역으로 끼워 맞추는 것이 필요할 수도 있다.

상부 및 하부 부재(22,24)를 서로 연결하는 대안적인 수단은 하나의 부재 위에 다른 하나의 부재를 나사 결합시켜 서로 연결하는 것일 수 있다. 이를 위하여, 부재 중 하나(22 또는 22)의 벽의 단부가 외부 나사산을 가지고 있고 다른 부재의 벽의 단부가 이에 대응하는 내부 나사산을 가지게 할 수 있다.

중요한 것은 수집 수단이 공기의 진입을 완전히 막기 위해 밀폐가능하게 밀봉되는 것이다.

공기 수집 수단을 사용하는 특정 방법에 따라, 공기 배출 덕트(22)의 하부 단부는 공기 흡입 펌프(미도시) 또는 임의의 이와 균등한 펌핑 수단에 연결될 수 있다. 이 펌프는, 예를 들어 병실 또는 약품 조제실이나 식품 제조실과 같은 특정 환경에서 주변 공기의 분석을 수행하기를 원할 때, 공기 수집 수단으로 주변 공기를 흡입하는데 사용된다. 이를 위해, 펌핑 수단이 자율적으로 그리고 연속적으로 동작하는 것이 바람직할 수 있다.

공기 수집 모듈(22,24)은 예를 들어 10 내지 40mm의 외부 직경, 바람직하게는 20mm의 외부 직경을 가질 수 있다. 공기 진입 덕트의 내부 직경은 예를 들어, 6mm이다.

이 공기 수집 모듈(10)은 유리하게는 특히 오토클레이브(autoclaving)에 의해 살균될 수 있는 물질로 만들어질 수 있다. 따라서, 이는 알루미늄이나 강철과 같은 금속으로 만들어질 수 있다. 또 이것은 폴리카보네이트, 고리형 사이클로-올레핀(CCO) 또는 PMMA와 같은 중합체일 수 있다.

미생물 수집 디바이스에서 공기 순환이 스위치온되는 경우, 공기에 의해 따라가는 경로는 도 2에서 화살표에 의해 도시된다. 따라서, 공기 진입 덕트(28)에 의해 미생물 수집 디바이스에 공기가 들어가는 것을 볼 수 있다. 카트리지(10)의 덕트(12)는 부분적으로 공기 진입 덕트(28) 안으로 삽입되는데, 보다 구체적으로 콘(30) 안으로 삽입된다. 덕트(28)의 베이스에서 공기 스트림은 콘(30)의 정점(vertex)에서 주변 흐름으로 변환된다. 나아가, 콘(30)의 존재는 또한 공기가 덕트(12)에 진입하는 것을 막는다. 전술된 바와 같이, 교란된 공기 스트림은 젤리 타입의 물질(19){미도시된 비드(18)} 상에 도달하고, 이 지점에서 공기 스트림으로 전달된 미생물과의 충돌(impact)에 의해 보유하게 된다. 이 공정은 그리하여 미생물학적 공기 샘플러에서 발생하는 것과 비교적 유사하다.

공기에 대하여 이 공기는 펌핑 수단에 의해 흡입되어 경로 상에서 계속 진행한다. 이 공기는 카트리지(10)의 수직 벽(16)의 내부면을 따라 상승한다. 이 공기는 이 동일한 벽의 외부면을 따라 다시 아래로 가고 배출 개구(42)에 의하여 공기 수집 모듈(20)을 떠난다.

공기 수집 모듈(10)에서 수집된 공기 흐름은 예를 들어 20 내지 100리터/분(ℓ/min)일 수 있다. 유리하게는 이는 50ℓ/min이다.

카트리지 내 미생물의 보유/농축 단계가 완료되면, 카트리지는 상기 수단으로부터 상부 부재(22)와 하부 부재(24)를 분해하거나 또는 나사를 풀어서 분리하여 공기 수집 모듈로부터 제거된다.

이 단계에서, 상기 카트리지에 농축된 미생물을 배양하기를 원하는 경우에는 스토브에서 37℃로 카트리지를 배양할 수 있다. 이미 전술된 바와 같이, 상기 배양은 분석 시간을 과도하게 연장하지 않도록 일반적으로 수 십분 내지 수 시간 동안 지속된다. 그러나, 분석 결과를 얻는 것이 시급하지 않다면, 박테리아를 성장시키는 요구조건에 맞춰 더 긴 시간, 즉 약 24시간 동안 카트리지를 배양하는 것이 고려될 수 있다.

이와 유사하게, 분석을 지연시키기를 원하는 경우에는 암실과 같이 저장하기에 적합한 환경에 카트리지를 저장하는 것을 또한 고려할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 카트리지(10)는 공기 수집 모듈에 직접 배치되게 제공될 수 있다. 이런 형태의 제공은 유저가 공기 수집 모듈에 카트리지를 둘 필요가 없어 이 단계 동안 오염의 위험을 줄여주는 잇점을 가지게 된다. 이 경우에 공기 수집 모듈이 카트리지와 동일한 물질, 즉 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 또는 PMMA로 만들어지는 경우에는 특히 유리하다. 이때에는 사출 성형에 의한 제조가 특히 적절하다.

미생물의 수집과 가능하게는 배양이 완료되면, 카트리지(10)는 도 6에 도시된 바와 같이 미생물을 분해하는 디바이스를 구성하기 위하여 회전자(50)에 연결된다. 이를 위해, 회전자(50)는 수직 병진 이동으로 카트리지의 자유 단부에 의해 카트리지(10) 안으로 삽입된다.

도 6에 있는 길이방향 단면도로 도시된 회전자(50)는 원형 단면을 가지는 일반적인 원통 형상의 바디(body)를 가지고 있다. 이 바디는 외부 벽의 상부 부분에 플랜지(52)를 가지며, 이 플랜지(52)는 회전자(50)가 카트리지(10) 안으로 완전히 삽입되어 카트리지(10)의 수직 벽의 상부 단부에 놓일 때 카트리지(10)-회전자(50)의 조립체가 액체가 새지 않게 밀봉되는 것을 보장하는 기능을 가지고 있다.

밀봉을 강화하기 위해, 캡(54)이 카트리지와 일체형으로 회전자(50)를 유지하기 위하여 임의의 적절한 수단에 의해 카트리지(10)에 고정될 수 있다. 예를 들어, 캡(54)은 서로 끼워 맞추거나 또는 나사 결합에 의해 고정될 수 있다. 이 캡은 대략 원형 형상이고 회전자에 제공되는 블라인드 덕트(56)를 구성하는 회전자의 상부에 나사 결합될 수 있다. 이 블라인드 덕트의 상부 단부에, 2개의 대각선으로 맞은편에 있는 그루브(57)들이 벽에 만들어진다. 이들 그루브는 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이 상기 회전자를 회전시키는 수단(92)의 트랜스미션 샤프트(90)의 단부를 수용하는 기능을 가지고 있다. 이 샤프트의 단부는 이에 따라 이들 그루브에 상보적인 형상을 가지고 있고 리브 형태로 이들 그루브에 삽입될 수 있다. 구동 샤프트는 전기 모터의 것일 수 있다. 대안적으로, 이는 수동으로 회전시키기 위한 디바이스의 일부분일 수 있다.

도 6에 도시된 바와 같이, 회전자(50)는 하부 부분에 카트리지(10)의 내부 형상과 완전히 상보적인 외부 형상을 가지고 있다. 그 결과, 회전자(50)는 가이드의 역할을 수행하는 덕트(12)가 이 회전자(50)의 베이스에 제공된 공동(58)에 삽입되는 것에 의해 카트리지(10) 내부에 완전히 위치될 수 있다. 이 공동(58)은 원형 단면을 가지는 대략 원통형 형상이고 그 상부 단부는 대략 원추형 형상이다. 회전자(50)는 그 하부 벽(59)이 비드(18)와 젤리 타입의 물질(19)로 구성된 조합체 상에 놓일 때까지 위치된다.

회전자(50)와 캡(54)은 유리하게는 카트리지와 동일한 중합체 물질, 즉 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 또는 PMMA로 만들어진다. 바람직하게는, 이들 부분은 투명한 폴리카보네이트{Makrolon(등록상표) 2858, Bayer}를 사출 성형하여 만들어진다.

카트리지(10)-회전자(50)-캡(54)의 조립체는 그리하여 본 발명에 따른 미생물을 분해하는 디바이스(60)를 구성하며, 이후에는 "분해 디바이스"라고 불리운다.

분해 디바이스(lysis device)가 구성되면, 이는 도 7에 도시된 바와 같이 4-방향 밸브(4-way valve) 위에 놓인다. 이 밸브(70)는 분해 디바이스(60)를 수용하도록 의도된 제 1 통로(701)를 구비한다. 상기 디바이스는 카트리지(10)의 덕트(12)의 베이스에 의해 밸브 상에 연결된다. 제 2 통로는 본 발명에 따라 미생물을 분해하고 핵산을 정화(purification)하는 시스템의 일부분인 제 1 흡입-배출 수단에 연결되도록 의도된 연결 홀(702)을 구비한다. 유리하게, 이 흡입-배출 수단은 용리 완충 용액(solution of elution buffer)을 포함하는 용기에 또한 연결된 펌프이다. 상기 펌프는 도 8a 및 도 8b에 개략적으로 도시되어 있다. 그 동작은 아래에 설명된다. 제 3 통로는 일회용 콘(72)이 고정된 연결 홀(703)을 구비한다. 마지막으로, 제 4 통로는 제 2 흡입-배출 수단(704)으로 구성된다. 이 제 2 수단은 밸브와 일체형으로 형성된 주사기(syringe)이다. 이 주사기(704)는 본 발명에 따라 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템의 일부를 형성하며 상기 주사기의 피스톤을 이동시키도록 의도된 병진 작동 수단과 상호작용하기 위한 것이다. 마지막으로, 밸브(70)는 2개의 유체 채널을 가지는 중심 샤프트(74)를 가진다. 도 7에 도시된 바와 같이, 이들 2개의 채널은 한편으로 분해 디바이스(60)와 연결 홀(702) 사이에 그리고 다른 한편으로는 주사기(704)와 일회용 콘(72)이 고정되는 연결 홀(703) 사이에 연결을 각각 제공한다. 샤프트(74)는 유체의 연결이 변경되도록 1/4만큼 회전될 수 있다. 연결 홀(702)은 이후 연결 홀(703)에 연결되고, 분해 디바이스(60)는 주사기(704)에 연결된다.

분해 디바이스(60)와 밸브(70)로 구성된 조립체는 소비하는 부분을 구성한다. 이는 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템 위에 놓인다. 이는 3개의 별도의 주요 기능, 즉 분해 기능, 액체 전달 기능 및 정화 기능을 가지는 자동화 시스템이다. 이들 기능은 아래에 설명된다.

분해 디바이스(60)-밸브(70)의 조립체는 이하 방법으로 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템에 놓인다. 먼저, 이 조립체를 끼워 맞추는 전용 위치가 있다. 이 위치는 이것이 밸브(70)를 고정시키는 수단을 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 이들 수단은 예를 들어, 밸브가 그 사이에 억지로 삽입되어 있는 아암(arm) 또는 죠우(jaw)들로 구성될 수 있다.

분해 디바이스(60)-밸브(70)의 조립체가 위치되면, 여러 연결이 밸브에서 만들어진다. 이것은 도 8a 및 도 8b에 개략적으로 도시되어 있다. 따라서, 제 1 연결은 밸브(70)의 연결 홀(702)에 의해서 이루어진다. 자동화 시스템 상에 있는 흡입-배출 수단(80)이 연결 홀(702)에 영구적으로 연결되는 것이 마지막 연결이다. 전술된 바와 같이, 흡입-배출 수단(80)은 바람직하게는 도 8a 및 도 8b에 충분히 도시되지 않은 자동화 시스템의 일체형 부분인 고정된 펌프의 형태이다. 보다 정확하게는, 펌프(80)는 사실 또한 자동화 시스템 상에 영구적으로 배치된 밸브(82)에 연결된다. 이 고정된 밸브(82)는 한편으로는 연결 홀(702)을 통해 밸브(70)와 그리고 다른 한편으로는 소위 용리 완충액(elution buffer)을 포함하는 저장소(84)와 유체 이동 가능하게 연결된다. 고정된 밸브(82)는 그 위치에 따라 밸브(70) 또는 저장소(84) 중 어느 하나에 고정된 펌프(80)를 연결하는 것을 가능하게 한다.

분해 디바이스-밸브의 조립체는 또한 분해 디바이스의 회전자를 회전시키는 수단(92)의 트랜스미션 샤프트(90)에 연결된다. 이 연결이 이루어지면, 트랜스미션 샤프트(90)는 도 8a에서 화살표(A)에 따라 수직 성분을 따르는 압력을 회전자에 가지며, 이에 따라 회전자로부터의 이 압력이 비드(18)와 젤리 타입의 물질(19)로 구성된 조립체로 전달된다는 것을 주목하여야 한다.

분해 디바이스-밸브의 조립체와 자동화 시스템 사이의 제 3 연결은 밸브(70)의 주사기(704)와 상기 주사기의 작동 수단(94) 사이의 연결을 구성한다. 이 작동 수단은 스텝 모터와 엔드리스 나사로 구성된 조립체와 같은 병진 동작 수단이며 이는 주사기(704)의 피스톤을 당기거나 미는 것을 가능하게 하여 주사기 안으로 액체를 주입하거나 주사기 안에 포함된 액체를 배출시키는 것을 가능하게 한다.

마지막으로, 분해 디바이스-밸브의 조립체와 자동화 시스템 사이의 제 4 연결은 밸브(70)의 샤프트(74)의 회전 작동 수단에 관한 것이다. 이 수단은 도 8a 및 도 8b에는 도시되어 있지 않다. 밸브(70)의 샤프트(74)에 연결된 트랜스미션 샤프트를 회전하게 할 수 있는 것은 모터이다.

카트리지(10)에 수집된 미생물을 분해하는 프로토콜을 적용하는 동안, 밸브(70)는 분해 디바이스(60)가 펌프(80)와 고정된 밸브(82)로 구성된 조립체와 유체 이동 가능하게 연결되도록 구성된다. 주사기(704)는 일회용 콘이 고정된 연결 홀(703)과 유체 이동 가능하게 연결된다. 고정된 밸브(82)는 펌프(80)가 용리 완충액 저장소(84)와 유체 이동 가능하게 연결되도록 초기에 구성된다. 펌프(80)는 용리 완충액의 미리 결정된 양을 흡입한다. 고정된 밸브(82)의 구성은 펌프(80)가 밸브(70)를 통해 분해 디바이스(60)에 유체 이동 가능하게 연결되도록 변경된다. 펌프(80)는 분해 디바이스(60) 안으로 이동하고 보다 구체적으로 카트리지(10)의 내부벽과 회전자(50)(cf. 도 6)의 외부 벽 사이의 틈새 공간 안으로 이동하게 흡입된 용리 완충액의 볼륨을 배출한다. 용리 완충액은 젤리 타입의 물질(19)과 비드(18)를 적신다. 젤리 타입의 물질(19)은 회전자(50)의 느린 회전과 용리 완충액의 동작의 결합에 의해 용해(dissolved)된다. 비드는 회전자에서 현탁액(suspension) 내에 있다. 회전자의 회전과 회전자에 의해 가해지는 압력의 작용이 결합하여 현탁액의 동작은 카트리지(10)의 내부 수직벽과 회전자(50)의 외부 수직벽 사이에 틈새 공간 안으로 비드(18)의 일부(fraction)를 변위하게 한다. 이 틈새 공간은 바람직하게는 600 내지 800㎛의 폭을 가지고 있다는 것을 주목하여야 한다. 이 폭은 사용되는 비드(18)의 직경과 직접 관련이 된다. 사실, 비드는 이 공간에서 용이하게 순환할 수 있고 동시에 회전자(50)를 회전시켜서 회전될 수 있어야 한다. 이를 위해, 회전자의 수직 외부벽은 비드의 회전을 용이하게 하는 거친 면(rough surface)을 가질 수 있다.

비드가 카트리지의 보유 영역 내에 회전자의 수직 벽을 따라 분배되면, 회전자는 카트리지 안에 완전히 삽입될 수 있다.

물론, 젤리 타입의 물질 상에 그리고 비드 상에 유지되는 미생물은 용리 완충액의 스트림에 의해 비드(18)와 동일한 방식으로 틈새 공간 안으로 전달된다.

비드(18)가 회전자(50)의 수직 외부 벽을 따라 분배되면, 적절한 분해 단계가 개시된다. 회전자(50)는 회전 수단/모터(92)에 의하여 그리고 트랜스미션 샤프트(90)에 의하여 회전하게 된다. 그럼에도 불구하고, 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템을 사용하지 않고 간략화된 프로토콜로 회전자를 수동으로 회전시키는 것도 고려해 볼 수 있다.

일례로서, 회전 속도를 위한 밸브는 200 내지 3000rev/min일 수 있다. 바람직하게는, 회전자는 틈새 공간에서 용리 완충액과 비드의 분배와 균일화를 위해 초기에는 200rev/min의 느린 속도로 회전된다. 이 느린 회전은 약 15초 지속된다.

이후 회전 속도는 증가하여 1 내지 5분의 시간 동안 1000 내지 3000rev/min의 값에 도달한다. 공기로부터 수집된 임의의 미생물의 분해가 수행되는 것은 이 시기 동안이다.

회전자의 회전 속도와 회전 시간의 선택은 분해되어야 하는 미생물의 종류에 따라 결정된다는 것은 매우 분명하다.

이 단계 동안, 비드(18)는 카트리지의 수직 내부면과 회전자의 수직 외부면과의 마찰에 의해 대칭축에 대해 회전된다. 이 이중 회전은 카트리지 또는 회전자의 각 면과 비드(18) 사이에 포획되는 미생물의 기계적 분해를 유도한다. 이 결과 용리 완충액 안으로 핵산의 방출이 가능하게 된다.

분해 단계가 완료되고 핵산이 방출되면, 핵산을 포함하는 용리 완충액이 흡입되어야 한다. 밸브(70)는 그 샤프트(74)를 회전시켜서 그 구성을 변경시켜 분해 디바이스(60)와 주사기(704)가 다시 도 8b에 도시된 바와 같이 유체 이동 가능하게 연결되게 한다. 주사기(704)의 피스톤은 핵산을 포함하는 용리 완충액을 상기 주사기(704) 안으로 흡입하기 위하여 작동 수단(94)에 의해 병진 이동된다. 이 흡입 단계는 회전자(50)가 느린 속도(약 200rev/min)지만 여전히 회전하고 있는 동안 일어난다.

밸브(70)는 도 8a에 도시된 바와 같이 초기 구성으로 다시 되돌아가서, 주사기(704)는 연결 홀(703)과 유체 연통가능하게 된다. 이후 핵산을 포함하는 용리 완충액은 상기 핵산을 정화하기 위하여 콘(72)을 통해 튜브에 분배될 준비가 된다. 사실, 용리 완충액에 포함된 용해물(lysate)은 핵산을 효과적으로 포함하지만 또한 모든 세포 파편들도 포함한다.

이를 위해, 분석 튜브(96)가 콘(72)에 가까이 간다. 유리하게는 자동화 시스템은 상기 튜브를 수용하는 홀더를 구비한다. 이 경우에, 상기 홀더는, 튜브가 홀더 안으로 삽입될 수 있는 바닥 위치 또는 나머지 위치와, 튜브가 콘(72)(도 8a 및 도 8b에 도시) 가까이 있는 상부 위치 또는 작업 위치 사이에서 이동될 수 있는 아암에 연결될 수 있다. 물론, 콘(72)이 튜브(96) 안으로 가는 것이 바람직하다. 튜브(96)는 핵산의 정화에 필요한, 소위 분해 완충액과 자성 실리카 입자를 가지고 있다. 이들 입자는 1 내지 3㎛의 직경을 가지고 있다. 나아가, 미리 관통된 격막(미도시)이 튜브의 오염을 막기 위해 튜브(96)의 오리피스에 배치된다. 튜브(96)가 상승할 때 콘(72)이 미리 관통된 홀에 의해 격막을 통과한다. 용해물을 갖는 용리 완충액은 이후 분석 튜브에 분배된다. 이 단계에서, 주사기(704)를 사용하여 여러 흡입/배출을 수행하여 자성 입자와 분해 완충액으로 용해물을 균일화하는 것이 바람직하다. 분해 완충액의 기능은 핵산을 안정화(뉴클레아제에 대해 보호)하고 pH를 포획 단계에 최적인 값으로 조절하는 것이다.

혼합물이 올바르게 균일화되면, 튜브는 자성 입자에 의해 핵산의 수동 포획을 가능하게 하기 위해 정지하여 유지될 수 있다. 정지 시간은 예를 들어 2분일 수 있다. 이 경우에 균일화가 올바르지 않거나 균일화가 되어 있지 않으면, 핵산의 포획은 능동적으로 수행될 수 있다. 사실, 튜브와 이 튜브가 포함하는 자성 입자는 상이한 배향의 자기장을 따를 수 있다. 이를 위해, 튜브는 바닥 위치에 놓이고 이후 자석을 운반하는 아암을 통해 자석과 접촉하게 된다. 이들 자석은 튜브를 운반하는 아암과 일체로 된 2개의 평행한 판에 위치될 수 있다. 이들 2개의 판은 특별한 변위 수단에 의하여 수평 병진 이동으로 이동될 수 있고 이에 따라 상기 판들 사이에 튜브가 있게 변위된다. 각 판 상에 있는 자석의 수는 가변적이다. 자석이 판 상에 상이한 높이로 있는 것이 유리하다. 나아가, 하나의 판 상에 있는 자석이 다른 판 상에 있는 자석의 맞은편에 놓이지는 않지만, 한정된 시퀀스(sequence)에 따라 튜브의 변위 방향에 대해 오프셋되어 있는 것이 중요하다. 따라서, 판들의 변위 동안, 튜브는 점진적으로 제 1 판 상에 있는 자석의 자기장 또는 제 2 판 상에 있는 자석의 자기장을 따른다. 이들 장은 판들의 궤적에 대해 상이한 높이에 위치될 수 있다. 그 결과, 이들 자석에 의해 당겨지는 자성 입자들이 클러스터를 형성하고, 이 클러스터는 자석이 가하는 인력과 특히 튜브에 대한 위치에 따라 튜브에서 이동하게 된다. 분석 튜브에 대한 자석의 상대적인 위치는 또한 수직 축을 따라 튜브를 변위시켜서 얻어질 수도 있다는 것을 주목하여야 하며; 이 경우에, 자석들은 한정된 시퀀스에 따라 그리고 동일한 높이에 모두 배치된다. 핵산을 능동 포획하는 경우, 이 포획에 드는 시간은 더 길어질 수 있다(4분 내지 6분).

핵산의 포획이 수행되면, 하나 이상의 연속적인 세척 단계가 적용된다. 이를 위해, 튜브는 수직 벽에 대해 튜브의 상부 부분에 핵산을 운반하는 자성 입자를 축적하기 위하여 높은 위치에 있는 자석 맞은편에 놓인다. 이 튜브는 이후 높은 위치로 이동되고 콘(72)이 튜브에 포함된 액체와 접촉하게 된다. 튜브에 포함된 액체는 피스톤을 작동시켜 주사기(704) 안으로 흡입된다. 주사기(704)는 튜브에 흡입된 액체 폐기물을 위한 저장 용기로 작용한다. 핵산의 세척을 시작하기 위하여, 밸브(74)는 연결 홀(702)과 펌프(80)가 연결 홀(703)과 유체 연통 가능하게 구성된다. 밸브(82)는 펌프(80)에 의한 용리 완충액의 흡입을 가능하게 하는 위치에 있다. 흡입되는 용리 완충액의 볼륨은 예를 들어, 300㎕이다. 밸브(82)의 위치는 펌프(80)가 튜브(96)에 용리 완충액을 분배하게 하도록 변경된다. 최적 세척을 보장하기 위해, 튜브는 낮은 위치로 복귀하고 자석을 운반하는 판들은 용리 완충액과 입자 사이에 교환을 최적화하기 위해 다시 이동된다. 판들은 요구조건에 따라 가변적인 속도로 여러 왕복 운동을 수행할 수 있다. 튜브에 포함된 용리 완충액은 전술된 바와 같이 주사기(704)에 의하여 흡입된다. 새로운 세척 단계는 동일한 방식으로 최적으로 수행될 수 있다. 주사기(704)의 피스톤은 이 단계에서 세척에 사용된 분해 완충액 또는 용리 완충액이 있는지에 상관없이 주사기(704)가 점차적으로 분석 튜브에 흡입된 액체로 채워지도록 작동된다는 것을 주목하여야 한다. 핵산이 분석 튜브로 전달되면, 주사기(704)는 상당한 잇점을 나타내는 액체 폐기물을 저장하는 역할로만 할당된다. 나아가, 펌프(80)만이 용리 완충액을 분배하는 역할을 하여 "오염된" 물질과는 결코 접촉하지 않는다는 것을 주목하여야 한다. 이 측면은 또한 특히 중요한 것인데, 이는 한번 사용하도록 의도된 밸브(74)의 일체형 부분인 주사기(704)와는 대조적으로, 펌프(80)와 밸브(82)는 자동화 시스템에 영구히 유지되기 때문이다.

핵산의 세척이 수행되면, 튜브(72)에 있는 용리 완충액의 마지막 흡입은 단지 부분적으로만 이루어진다. 사실, 용리 완충액의 한정된 볼륨이 튜브에 유지되어 핵산이 용리되는(eluted) 용리 볼륨을 구성하며, 즉 핵산이 자성 입자로부터 분리되는 용리 볼륨을 구성한다. 용리 볼륨은 5 내지 150㎕ 범위에서 변할 수 있으며, 바람직하게는 25 또는 40㎕이다. 이 마지막 흡입을 위하여, 자성 입자들의 클러스터는 낮은 위치에 있는 자석의 맞은편에 튜브를 둠으로써 튜브의 바닥에 형성된다. 이와 대조적으로, 입자들의 흡입을 피하기 위해 액체의 표면으로부터 흡입이 수행된다.

유지되는 볼륨에서, 핵산의 용리(elution)가 이루어진다. 이를 위해, 튜브는 약 5분 동안 액체 내에서 65℃의 온도에 이르기 까지 튜브 홀더와 일체형인 가열 모듈에 의해 75℃로 가열된다. 가열 단계와 동시에, 튜브는 용리를 촉진하기 위해 낮은 위치에 위치된 자석을 따른다.

핵산이 정화되고 용리 볼륨으로 용리되면(eluted), 핵산이 분석을 위해 증폭될 수 있다. 이를 위해, 용리 볼륨의 일부 또는 전부는 소위 증폭을 조절하는 완충액과 접촉하게 되어야 한다(40mM Tris HCL, pH 8.5, 12mM MgCl₂, 70mM KCl, 5mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 15% v/v DMSO, dNTP 1mM, 각 NTP 2mM, 프라이머 0.2μM, 0.1μM 분자 비컨). 이 접촉은 자동화 시스템에서 이용가능한 기능에 따라 2개의 상이한 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.

제 1 프로토콜에 따라, 용리와 증폭을 조절하는 것이 2개의 상이한 튜브에서 수행된다. 이 경우에, 분석 튜브로부터 정화된 핵산을 포함하는 용리 볼륨의 미리 결정된 부분을 취하는 것이 필요하다. 이 부분은 제 2 튜브에서 분배되며, 이 제 2 튜브에서 증폭을 조절하는 것이 수행되고 제 2 튜브는 이미 증폭을 조절하는데에 필요한 완충액의 양을 포함한다. 이 튜브는 핵산의 증폭이 일어날 수 있는 기구로 전달될 수 있다. 반응 볼륨의 부분은 고정된 펌프(80)에 의하여 이루어진다. 이 경우에, 밸브(70,82)는 펌프(80)와 연결 홀(703) 사이에 유체 연통을 가능하도록 구성될 수 있다. 분석 튜브는 콘이 용리 볼륨에 함침되게 높은 위치에 배치된다. 이 부분은 펌프(80)에 의해 흡입된다. 이 펌프(80), 그리고 보다 일반적으로 취해진 용리 볼륨의 부분에 의해 취해진 유체 회로는 용리 완충액과 분해 및 정화를 위한 프로토콜을 통해서만 단지 접촉하게 된다는 것을 상기할 수 있을 것이다. 그러므로, 핵산의 증폭에 사용될 수 있는 부분이 오염될 가능성이 없다. 이 부분이 취해지면, 분석 튜브는 증폭을 조절하는 튜브로 교체될 수 있다. 이를 위해 분석 튜브는 낮은 위치로 아래로 가져가 홀더로부터 빠져나와 증폭을 조절하는 튜브가 이 대신 배치될 수 있다. 이 튜브는 높은 위치로 상승되어 콘이 튜브 안으로 가고 용리 볼륨의 부분이 펌프(80)에 의해 분배된다.

대안적으로, 자동화 시스템이 증폭을 조절하는 튜브를 운반하고 관리하기 위한 특정 모듈을 구비할 수 있다.

이 제 1 프로토콜은 실리카 입자들과 증폭을 조절하는 완충액 사이의 접촉이 회피되는 잇점을 제공한다. 사실, 이 입자들은 핵산의 증폭 반응을 억제할 수 있다는 것이 알려져 있다.

제 2 프로토콜에 따라, 증폭을 조절하는 완충액과 용리 볼륨은 분석 튜브에 직접 접촉하게 되고 이 경우에 증폭을 조절하는 완충액이 분석 튜브에 추가된다. 상기 추가는 수동으로 또는 자동으로 수행될 수 있다. 이 경우에, 자동화 시스템은 제 2 분배 시스템, 즉 증폭을 조절하는 완충액, 상기 완충액을 흡입하고 배출하는 주사기, 밸브(82)와 균등한 밸브 및 분석 튜브에 장착된 격막을 통과할 수 있는 니들 또는 콘을 포함하는 용기를 영구히 구비하여야 한다.

사용되는 프로토콜에 상관없이, 마지막으로 증폭을 제공하는 부분을 취하기 전에, 용리 볼륨 단독 또는 용리 볼륨과 분석 튜브에 포함된 증폭을 조절하는 완충액의 혼합물의 실리카 입자들의 클러스터를 외부로 제거하는 것이 유리할 수 있다. 이것은 튜브를 높은 위치에 위치된 자석에 의해 자화하게 하는 것에 의해 이루어질 수 있다.

나아가, 전술된, 본 발명에 따른 시스템과 디바이스 전부는 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 프로토콜을 통해 완전한 추적가능성을 가능하게 하는데 적합하다. 사실, 먼저, 모든 소비재(카트리지, 회전자, 다방향 밸브, 튜브)들이 특별한 식별 수단(1D 또는 2D 바코드, RFID 태그 등)으로 식별된다. 나아가, 미생물이 공기 흡입 수단에 의해 수집되는 경우에, 공기 흡입 수단은 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템과 통신할 수 있게 하는 무선 통신 수단을 구비할 수 있어야 한다. 이 무선 통신 수단은 예를 들어, WiFi(표준 802.11b), 블루투스(표준 802.15) 또는 지그비(ZigBee)(표준 802.15.4) 시스템이다. 이들 무선 연결 시스템을 통해 전송될 수 있는 데이터는 예를 들어, 장소(수집 룸/지점), 샘플링 조건(시간, 흐름율, 습도, 온도, 대기압), 오퍼레이터의 식별 및 소비재를 식별하는 요소와 관련될 수 있다.

본 발명에 따른 디바이스 및 시스템은 또한 전체 혈액으로부터 또는 생체조직 검사(tissue biopsies)로부터 나온 샘플과 같은 임상 샘플(clinical samples)을 분석하는데 전적으로 적절하다. 이 경우에, 카트리지는 공기 수집 모듈 없이 사용된다. 전체 혈액과 같은 액체 샘플의 경우에, 혈액은 카트리지 내에 놓이고 카트리지는 미생물을 분해하는 디바이스를 구성하는 캡 내 회전자와 결합된다. 이 디바이스는 미생물을 분해하고 핵산을 회수하는 자동화 시스템 내에 배치된다. 생체 조직 검사의 경우에, 생체 조직 검사는 수 밀리미터의 슬라이스로 먼저 절단되고 이후 카트리지에 놓이며 이는 미생물을 분해하는 디바이스를 구성하는 캡 내 회전자와 결합된다. 이 디바이스는 세포를 분해하고 핵산을 회수하는 자동화 시스템에 배치된다.

실시예

실시예 1 : 기준 프로토콜:

- 소비재의 준비:

카트리지의 준비:

카트리지는 유리 비드와 아가로스 겔의 미리 결정된 양으로 충진된다:

- 유리 비드 0.3 내지 0.45g (직경 : 420 내지 600㎛)

- 겔의 조성: 1% 아가로스 - 1% 글리세롤

미생물의 분해를 수행하는데 사용되는 용리 완충액의 볼륨은 300㎕이다.

분석 튜브의 준비:

자동화 시스템에 놓이고 용해물을 회수하도록 의도된 분석 튜브는 자성 실리카 입자 30㎕와 분해 완충액(guanidinium thiocyanate) 200㎕로 충진된다.

- 분해 파라미터:

분해 시간 : 4분

회전자의 회전 속도 : 200rev/min (저속); 2000rev/min(고속)

- 분해 파라미터:

카트리지로부터 다방향 밸브의 주사기 안으로 용해물의 흡입:

주사기의 흡입 볼륨 = 1000㎕

주사기의 흡입 속도 = 70mm/s

흡입 동안 회전자의 회전 시간 = 9s

흡입 동안 회전자의 회전 속도 = 200rpm

다방향 밸브의 주사기로부터 분석 튜브로 용해물의 분배:

다방향 밸브의 주사기로부터 흡입 볼륨 = 1000㎕

주사기의 흡입 속도 = 70mm/s

- 핵산을 정화하는 파라미터:

정화는 3가지 단계를 포함한다:

- 핵산의 분리

- 용리 완충액으로 세척(3번)

- 용리 완충액에서 용리(pH 8.5)

용해물을 분석 튜브로 전달한 후(0.5㎖), 분석 튜브는 실리카 비드 30㎕, 분해 완충액 200㎕ 및 용해물 120 내지 150㎕을 포함한다.

실리카 입자들의 2가지 형태의 진동은 자석에 의하여 적용된다:

높은 위치에 있는 자석들 사이에 생성되는 높은 진동

낮은 위치에 있는 자석들 사이에 생성되는 낮은 진동

높은 진동은 자성 입자들에 의하여 핵산의 포획을 수행하는데 사용되지만 또한 세척 단계(표면에 뜨는 물질의 제거)를 위해 사용된다. 낮은 진동은 용리 단계에서 사용되며 튜브의 가열과 결합된다.

핵산의 포획 파라미터:

진동 속도 = 5mm/s

진동 수 = 112

진동 진폭 = 27mm/s

세척 파라미터:

진동 속도 = 5mm/s

진동 수 = 10

진동 진폭 = 27mm/s

표면에 뜨는 물질의 제거 파라미터:

다방향 밸브의 주사기에 의한 흡입 = 600㎕

펌프 속도 = 100mm/s

분석 튜브에 고정된 펌프에 의한 용리 완충액의 분배 파라미터:

분배 볼륨 = 400㎕

펌프 속도 = 100mm/s

용리 파라미터:

진동 속도 = 50mm/s

진동 진폭 = 9mm/s

목표 온도 = 75℃

가열 시간 = 300s

용리 완충액의 볼륨 = 45㎕

실시예 2 : 조직의 기계적 분해

tRNA를 방출하기 위해 미생물의 살아있는 세포의 벽을 파괴하기 위하여 본 발명에 따른 분해 디바이스에서 기계적 분해의 성능을 평가하기 위한 연구가 수행되었다. 이들 테스트는 고형 종양 샘플에 대해 수행되었다.

상술되고 테스트되는 프로토콜:

시약 및 장비:

- Qiagen사에서 시판하는 RNAlater(등록상표) 장비로 미리 탈 지방화되고 안정화된 유방암 종양(Breast cancer tumors),

- 페트리 접시(Petri dishes),

- 무균 2mL 튜브,

- 플라스틱 핀셋(tweezers) 및 일회용 외과 메스(scalpels),

- Actril로 오염 방지된 본 발명에 따른 분해 디바이스(카트리지와 회전자),

- 400 내지 600㎛의 유리 비드,

- Qiagen + Qiacube 자동화 추출 시스템에서 시판하는 RNeasy Plus kit.

준비:

- 추출을 시작하기 전에 RNAse Zap으로 벤치와 피펫을 세척한다,

- -80℃로 동결된 종양을 해동시킨다,

- RNAlater(등록상표)를 취하지 않고 페트리 접시에 종양을 놓는다,

- 잔류 RNAlater를 제거하기 위해 RLT 완충액(Qiagen) 300㎕로 2번 세척한다.

종양 분쇄:

- 외과 메스로 종양을 미세하게(약 4mm의 직경으로) 절단한다,

- 플라스틱 핀셋을 사용하여 종양 조각을 회수하고 RLT 300㎕(β- mercaptoethanol +3㎕)를 포함하는 2mL 튜브로 이송한다,

- 다음사항에 따라 종양 조각을 분쇄한다:

Qiagen Tissue Ruptor : 2분 동안 속도 2, 또는

본 발명에 따라 미생물을 분해하는 디바이스: 0.4-0.5g 유리 비드(400-600㎛), 2000rev/min, 2×20초.

- 정화 전에 300㎕의 볼륨을 가지기 위해 샘플을 회수하고 RLT 완충액으로 볼륨을 조절한다.

Mini kit에 더하여 Qiagen RNeasy을 가지고 tRNA를 정화하기:

1. 나머지 종양 파편 없이 분쇄한 후 회수된 RLT 완충액 300㎕를 2mL 튜브에 넣는다,

2. RNA를 정화하고 고정하기 위해 2 타입의 컬럼을 준비한다: 컬럼 gDNA 제거기(Eliminator) 및 RNS 스핀(spin),

3. 완충액, Qiagen 추출 셔틀 및 용리 튜브를 준비한다,

4. 로봇 기구를 따라 Qiacube 테스터를 준비하고 실행을 시작한다,

5. 용출물(eluate) 80㎕를 회수하고 -80℃에서 정화된 tRNA를 동결시킨다,

6. 1회 분량: 나노드랍(Nanodrop) 마다 희석되지 않은 용출물 1㎕,

7. 추출된 tRNA의 양 측정: 정량 분석은 Agilent bioanalyzer에서 프로토콜 RNA 6000 Nano에 따라 수행된다.

종래의 전기영동에서와 같이, 18s 및 28s rRNA에 대해 2개의 메인 피크를 갖는 전사 분배가 관찰된다.

결과:

2개의 생체 검사가 본 연구를 위해 사용되었으며, 모두 동일하게 준비되고 저장되었다. 이들 검사는 약 4mm의 직경과 1.5mm의 두께를 가지는 원형이다. 이들 덩어리는 약 10mg으로 측정되었다. 이들 검사는 2가지 타입의 기계적 분해를 평행하게 수행하기 위하여 대략 2개로 분리되었다(reference lysis Tissue Ruptor 및 PPM). 그러나, 사용되는 조직의 양은 테스트마다 동일한 것은 아니며 그 목적은 본 발명에 따른 프로토콜과 기준 기술 사이에 성능을 비교하는 것이 아니라 테스트의 적절한 실행을 보장하기 위한 것이라는 것을 주목하여야 할 것이다.

순도의 분석은 상이한 파장, 핵산에 대해 260nm, 염에 대해 230nm 그리고 단백질에 대해 280nm에서 흡수율 값들 사이의 비율에 기초한다. 2에 가까운 비율의 값은 핵산의 우수한 순도를 반영한다.

검사	추출 프로토콜		tRNA (ng/㎕)	순도
	분해	정화		260/280	260/230
1	Tissue Ruptor(Qiagen) 2분, 속도 2	키트: RNeasy 플러스 로봇 : Qiacube	3.4	0.86	0.19
1	본 발명에 따른 디바이스 2000 rev / min 에서 2×20s, 420-600㎛의 비드 0.4g	키트 : RNeasy 플러스 로봇 : Qiacube	2.2	0.42	0.11
2	Qiagen로부터 Tissue Ruptor 2분, 속도 2	키트: RNeasy 플러스 로봇: Qiacube	31.7	2.09	0.56
2	본 발명에 따른 디바이스 2000 rev / min 에서 2×20s 420-600㎛의 비드 0.4g	키트 : RNeasy 플러스 로봇: Qiacube	81.1	2.10	1.70

검사 1의 경우에, 추출된 tRNA의 양은 매우 작은 것을 볼 수 있다. 이것은 검사가 열화를 받아 물질의 손실을 초래했다는 사실에 의해 설명될 수 있다.

검사 2의 경우에, tRNA의 상당한 양이 두 기술에 의해 추출되었다는 것을 볼 수 있다. 나아가, 순도가 우수한 것을 볼 수 있다.

따라서, 이들 실시예로부터 본 발명에 따른 디바이스는 공기 샘플에 포함된 박테리아를 수집하고 이를 분해하고 분석을 위하여 이 박테리아로부터 핵산을 회수하는데 있어 우수한 성능을 제공한다는 것이 명백하다. 이를 위해, 사용되는 디바이스는 첫째 공기 수집 모듈에 삽입된 카트리지와, 둘째 핵산을 회수하는 수단과 결합된 수집된 박테리아를 포함하는 카트리지로 구성된다.

Claims (28)

1. 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스로서,
   - 공기 수집 모듈로서,
   ⅰ. 상기 모듈 안으로 공기 스트림의 진입을 허용하며 베이스에 공기 스트림을 교란시키는 수단을 구비하는 공기 진입 덕트를 가지는 상부 부재와,
   ⅱ. 생성된 공기 스트림을 빠져나가게 하는 공기 배출 수단을 구비하는 하부 부재를 포함하고,
   상기 상부 부재와 하부 부재는 공기 스트림이 상기 공기 수집 모듈 내에 생성될 수 있도록 서로 일체형으로 제조될 수 있는, 공기 수집 모듈;
   - 상기 공기 수집 모듈 내에 위치하며, 미생물을 분해하는 수단을 구비하는 미생물 보유 영역을 가지는 원통형 형상의 카트리지;를 포함하며,
   상기 공기 스트림을 교란시키는 수단은 공기 진입 덕트의 보어(bore)의 중심에 위치하는 첨두 아치 형상의 콘(30)과, 공기 진입 덕트의 내부면에 상기 첨두 아치 형상의 부분을 연결하는 적어도 하나의 블레이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 카트리지의 미생물 보유 영역은, 미생물을 보유할 수 있고 분해하는 수단을 구비하고 액체의 존재 하에 용해될 수 있는 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 공기 수집 모듈은 공기 재순환 회로 또는 공기 흡입 디바이스에 연결되는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 디바이스.
4. 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 방법으로서,
   a) 카트리지 내 보유 영역이 공기 수집 모듈의 공기 진입 덕트와 연통가능하게 상기 공기 수집 모듈 내에 카트리지를 배치하여, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 수집하는 디바이스를 형성하는 단계,
   b) 상기 공기 수집 모듈 안으로 공기를 주입하는 단계,
   c) 상기 카트리지의 보유 영역에 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 방법.
5. 공기 중에 떠도는 미생물을 분해하는 방법으로서,
   a) 카트리지 내의 보유 영역이 공기 수집 모듈의 공기 진입 덕트와 연통 가능하게 공기 수집 모듈 내에 카트리지를 배치하여, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 수집하는 디바이스를 형성하는 단계,
   b) 공기 수집 모듈 안으로 공기를 주입하는 단계,
   c) 상기 카트리지의 보유 영역에 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 단계,
   d) 공기 수집 모듈로부터 카트리지를 제거하는 단계,
   e) 카트리지 내에 회전자를 배치하여 미생물을 분해하는 디바이스를 형성하는 단계,
   f) 미생물을 분해하고 핵산을 정화하는 시스템에 미생물을 분해하는 디바이스를 위치시키는 단계,
   g) 카트리지의 미생물 보유 영역에 위치된 분해 수단을 매달기 위해 카트리지 내에 용리 액체를 주입하는 단계,
   h) 미생물을 분해하는 수단을 회전시키는 상기 회전자의 회전 수단에 의해 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 미생물을 기계적으로 분해하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 분해하는 방법.
6. 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법으로서,
   a) 카트리지 내의 보유 영역이 공기 수집 모듈의 공기 진입 덕트와 연통 가능하게 공기 수집 모듈 내에 카트리지를 배치하여, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 수집하는 디바이스를 형성하는 단계,
   b) 공기 수집 모듈 안으로 공기를 주입하는 단계,
   c) 카트리지의 보유 영역에 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 단계,
   d) 공기 수집 모듈로부터 카트리지를 제거하는 단계,
   e) 카트리지 내에 회전자를 배치하여 미생물을 분해하는 디바이스를 형성하는 단계,
   f) 카트리지에 포함된 분해 수단을 매달기 위해 흡입-배출 수단에 의해 카트리지에 용리 액체를 주입하는 단계,
   g) 분해 수단을 회전시키는 상기 회전자의 회전 수단에 의해 카트리지 내 회전자를 회전시키는 것에 의해 미생물을 기계적으로 분해하는 단계,
   h) 분해 동안 방출된 상기 미생물의 핵산을 포함하는 용리 액체를 흡입하는 단계,
   i) 핵산을 수용하고 정화하기 위해 용기에 용리 용액을 분배하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서,
   핵산을 세척하고 정화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
8. 제 4 항에 있어서,
   카트리지의 보유 영역에 농축된 미생물을 성장시키는 것으로 구성되는 추가적인 단계(d')를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 방법.
9. 제 5 항에 있어서,
   카트리지의 보유 영역에 농축된 미생물을 성장시키는 것으로 구성되는 추가적인 단계(d')를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 분해하는 방법.
10. 제 6 항에 있어서,
    카트리지의 보유 영역에 농축된 미생물을 성장시키는 것으로 구성되는 추가적인 단계(d')를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
11. 제 7 항에 있어서,
    카트리지의 보유 영역에 농축된 미생물을 성장시키는 것으로 구성되는 추가적인 단계(d')를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
12. 제 8 항에 있어서,
    상기 성장은 2 내지 24시간 범위의 시간 동안 스토브에서 카트리지를 배양하여 달성되는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 수집하는 방법.
13. 제 9 항에 있어서,
    상기 성장은 2 내지 24시간 범위의 시간 동안 스토브에서 카트리지를 배양하여 달성되는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물을 분해하는 방법.
14. 제 10 항에 있어서,
    상기 성장은 2 내지 24시간 범위의 시간 동안 스토브에서 카트리지를 배양하여 달성되는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
15. 제 11 항에 있어서,
    상기 성장은 2 내지 24시간 범위의 시간 동안 스토브에서 카트리지를 배양하여 달성되는 것을 특징으로 하는 공기 중에 떠도는 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제

Images