JPH07250681A - Ｄｎａ抽出精製方法及び装置 - Google Patents
Ｄｎａ抽出精製方法及び装置Info
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- JPH07250681A JPH07250681A JP6996194A JP6996194A JPH07250681A JP H07250681 A JPH07250681 A JP H07250681A JP 6996194 A JP6996194 A JP 6996194A JP 6996194 A JP6996194 A JP 6996194A JP H07250681 A JPH07250681 A JP H07250681A
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- Japan
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- dna
- cartridge
- extracting
- purification
- extraction
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 形質転換体で複製増幅された核外遺伝子ＤＮ
Ａ（プラスミドＤＮＡ）を、終夜培養液から安価に抽出
精製することのできるＤＮＡ抽出精製方法及び装置を提
供する。 【構成】 (1) 形質転換体培養液を第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジに集菌する工程、(2) 溶菌及び不要Ｒ
ＮＡの分解工程、(3) 第１のＤＮＡ抽出精製用カートリ
ッジによる不純物濾過工程、(4) 第２のＤＮＡ抽出精製
用カートリッジでＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工程を
含むプラスミドＤＮＡの抽出精製方法，及び少なくとも
トラップフィルター及びメンブランフィルターを含む第
１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジと、少なくともガラ
ス繊維フィルターとガラスパウダー層とメンブランフィ
ルターとを含む第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジと
を含むＤＮＡ抽出精製装置。
Ａ（プラスミドＤＮＡ）を、終夜培養液から安価に抽出
精製することのできるＤＮＡ抽出精製方法及び装置を提
供する。 【構成】 (1) 形質転換体培養液を第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジに集菌する工程、(2) 溶菌及び不要Ｒ
ＮＡの分解工程、(3) 第１のＤＮＡ抽出精製用カートリ
ッジによる不純物濾過工程、(4) 第２のＤＮＡ抽出精製
用カートリッジでＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工程を
含むプラスミドＤＮＡの抽出精製方法，及び少なくとも
トラップフィルター及びメンブランフィルターを含む第
１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジと、少なくともガラ
ス繊維フィルターとガラスパウダー層とメンブランフィ
ルターとを含む第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジと
を含むＤＮＡ抽出精製装置。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、多検体試料からＤＮＡ
を短時間に抽出精製するＤＮＡ抽出精製方法及び装置に
関する。
を短時間に抽出精製するＤＮＡ抽出精製方法及び装置に
関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、大腸菌等を形質転換した形質転換
体からプラスミドＤＮＡ（核外遺伝子）を抽出精製する
方法として、煮沸法［BOILING METHOD ( Holmes, D. S.
及びM.Quigley, 1981, Anal. Biochem. 114:193) ］や
アルカリ溶菌法［ALKALINE LYSIS METHOD ( Birnboim,
H. C. 及びJ. Doly, 1979, Nucleic Acids Res. 7:151
3) ］等が行われている。しかし、これらの方法は、フ
ェノール，クロロホルム等の危険試薬を使用し、手間の
かかる方法であった。さらに、高純度の精製試料を得る
方法として、塩化セシウム密度勾配遠心分離法によるプ
ラスミドＤＮＡの抽出精製方法がある。この方法は、高
純度精製の代表的なものであるが、実施に長時間を要
し、試料処理本数は、一度に１０本程度である。また、
従来の方法を自動化した機器も開発されているが、この
ような機器も一般的に高価であったり、処理サンプル数
が少ない等の欠点を有しており、実用的には問題があっ
た。
体からプラスミドＤＮＡ（核外遺伝子）を抽出精製する
方法として、煮沸法［BOILING METHOD ( Holmes, D. S.
及びM.Quigley, 1981, Anal. Biochem. 114:193) ］や
アルカリ溶菌法［ALKALINE LYSIS METHOD ( Birnboim,
H. C. 及びJ. Doly, 1979, Nucleic Acids Res. 7:151
3) ］等が行われている。しかし、これらの方法は、フ
ェノール，クロロホルム等の危険試薬を使用し、手間の
かかる方法であった。さらに、高純度の精製試料を得る
方法として、塩化セシウム密度勾配遠心分離法によるプ
ラスミドＤＮＡの抽出精製方法がある。この方法は、高
純度精製の代表的なものであるが、実施に長時間を要
し、試料処理本数は、一度に１０本程度である。また、
従来の方法を自動化した機器も開発されているが、この
ような機器も一般的に高価であったり、処理サンプル数
が少ない等の欠点を有しており、実用的には問題があっ
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】形質転換法は、遺伝子
操作の基本技術であり、ライフサイエンスあるいはバイ
オテクノロジーの研究開発にとって不可欠である。した
がって、この方法によって得られた形質転換体（特に、
大腸菌等を形質転換したもの）から核外遺伝子ＤＮＡ
を、高い安全性のもとに、短時間かつ高純度で抽出精製
することが望まれていた。
操作の基本技術であり、ライフサイエンスあるいはバイ
オテクノロジーの研究開発にとって不可欠である。した
がって、この方法によって得られた形質転換体（特に、
大腸菌等を形質転換したもの）から核外遺伝子ＤＮＡ
を、高い安全性のもとに、短時間かつ高純度で抽出精製
することが望まれていた。
【０００４】そこで、本発明の目的は、形質転換体で複
製増幅された核外遺伝子ＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）
を、終夜培養液から安価に抽出精製することのできるＤ
ＮＡ抽出精製方法及び装置を提供することにある。
製増幅された核外遺伝子ＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）
を、終夜培養液から安価に抽出精製することのできるＤ
ＮＡ抽出精製方法及び装置を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、請求項１の発明の要旨は、(1) 形質転換体培養液を
第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに集菌する工程、
(2) 溶菌及び不要ＲＮＡの分解工程、(3) 第１のＤＮＡ
抽出精製用カートリッジによる不純物濾過工程、(4) 第
２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジでＤＮＡを吸着、洗
浄、溶出する工程を含むプラスミドＤＮＡの抽出精製方
法にある。
め、請求項１の発明の要旨は、(1) 形質転換体培養液を
第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに集菌する工程、
(2) 溶菌及び不要ＲＮＡの分解工程、(3) 第１のＤＮＡ
抽出精製用カートリッジによる不純物濾過工程、(4) 第
２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジでＤＮＡを吸着、洗
浄、溶出する工程を含むプラスミドＤＮＡの抽出精製方
法にある。
【０００６】上記目的を達成するため、請求項２の発明
の要旨は、少なくとも形質転換体捕集兼溶菌用フィルタ
ー（本明細書中では、トラップフィルターという）及び
メンブランフィルターを含む第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジと、少なくともガラス繊維フィルターとガラ
スパウダー層とメンブランフィルターとを含む第２のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジとを含むＤＮＡ抽出精製装
置にある。
の要旨は、少なくとも形質転換体捕集兼溶菌用フィルタ
ー（本明細書中では、トラップフィルターという）及び
メンブランフィルターを含む第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジと、少なくともガラス繊維フィルターとガラ
スパウダー層とメンブランフィルターとを含む第２のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジとを含むＤＮＡ抽出精製装
置にある。
【０００７】本発明にかかるＤＮＡの抽出精製方法は、
より詳しくは、以下の工程を含むことが好ましい。
より詳しくは、以下の工程を含むことが好ましい。
【０００８】(1) 形質転換体培養液を第１のカートリッ
ジに集菌する工程 この工程に先だって、形質転換体の終夜培養液を調製す
る。ここで、本発明の適用の対象となる形質転換体とし
ては、大腸菌［例えば、大腸菌ＪＭ１０１(ATCC 3387
6)，大腸菌ＨＢ１０１(ATCC 33694)，大腸菌ＪＭ１０９
(ATCC 53323)等］を宿主微生物として、これを形質転換
した形質転換体が代表的なものであるがこの他にアルカ
リ溶菌が可能な微生物を宿主とした形質転換体からの核
外遺伝子ＤＮＡの抽出精製にも用いることができる。こ
の形質転換は、当業者にとって公知の常法（例えば、Ha
nahan,D., 1983, J.Mol.Biol.,166 ,577）に従って行う
ことができる。上記終夜培養液は、通常適当な選択培地
に数時間終夜培養される。選択培地としては、大腸菌の
形質転換体の場合、プラスミド内の薬剤耐性遺伝子のた
め、アンピシリン(ampisilin) を代表とする抗生物質を
含むＬＢ(Luria Bertani) 培地が好ましいが、この他に
も、ＮＺＣＹＭ培地，ＳＯＣ培地等を用いることがで
き、本発明の目的の達成を阻害しない限り、これらに限
定されるものではなく、当業者にとって公知の他の培地
を用いることができる。すなわち、窒素源、炭素源、リ
ン酸塩、マグネシウム塩、微量成分等を含む天然もしく
は人工培地を使用することができる。
ジに集菌する工程 この工程に先だって、形質転換体の終夜培養液を調製す
る。ここで、本発明の適用の対象となる形質転換体とし
ては、大腸菌［例えば、大腸菌ＪＭ１０１(ATCC 3387
6)，大腸菌ＨＢ１０１(ATCC 33694)，大腸菌ＪＭ１０９
(ATCC 53323)等］を宿主微生物として、これを形質転換
した形質転換体が代表的なものであるがこの他にアルカ
リ溶菌が可能な微生物を宿主とした形質転換体からの核
外遺伝子ＤＮＡの抽出精製にも用いることができる。こ
の形質転換は、当業者にとって公知の常法（例えば、Ha
nahan,D., 1983, J.Mol.Biol.,166 ,577）に従って行う
ことができる。上記終夜培養液は、通常適当な選択培地
に数時間終夜培養される。選択培地としては、大腸菌の
形質転換体の場合、プラスミド内の薬剤耐性遺伝子のた
め、アンピシリン(ampisilin) を代表とする抗生物質を
含むＬＢ(Luria Bertani) 培地が好ましいが、この他に
も、ＮＺＣＹＭ培地，ＳＯＣ培地等を用いることがで
き、本発明の目的の達成を阻害しない限り、これらに限
定されるものではなく、当業者にとって公知の他の培地
を用いることができる。すなわち、窒素源、炭素源、リ
ン酸塩、マグネシウム塩、微量成分等を含む天然もしく
は人工培地を使用することができる。
【０００９】本工程では、調製された終夜培養液を、第
１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに分注する。
１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに分注する。
【００１０】このように、終夜培養液を分注した第１の
ＤＮＡ抽出精製用カートリッジに真空ポンプによる減圧
操作あるいは遠心分離操作を施し、形質転換体を第１の
ＤＮＡ抽出精製用カートリッジ上に集菌する。すなわ
ち、第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジのトラップフ
ィルターの立体網目構造に捕集され、形質転換体が集菌
される。
ＤＮＡ抽出精製用カートリッジに真空ポンプによる減圧
操作あるいは遠心分離操作を施し、形質転換体を第１の
ＤＮＡ抽出精製用カートリッジ上に集菌する。すなわ
ち、第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジのトラップフ
ィルターの立体網目構造に捕集され、形質転換体が集菌
される。
【００１１】(2) 溶菌及び不要ＲＮＡの分解工程 この工程では、溶菌用試薬を第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジのトラップフィルター上に添加し、形質転換
体を溶菌させ、核外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）を細胞
外に溶出させる。また、この工程では、同時に溶菌用試
薬によって不要なＲＮＡを消化する。したがって、上記
溶菌用試薬は、溶菌を行うための溶菌酵素とＲＮＡを消
化するためのＲＮＡ分解酵素（リボヌクレアーゼ）を含
むことが好ましい。溶菌酵素としては、例えば、細菌細
胞壁加水分解酵素であるリゾチーム(lysozyme)を用いる
ことができ、ＲＮＡ分解酵素としては、例えば、リボヌ
クレアーゼＡ（RNaseA）を使用することができる。これ
らは、一種のみを単独で用いても良く、また二種以上の
ものを組み合わせて用いることもできる。溶出させる核
外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）は、周知のとおりベクタ
ーとして利用されるものであり、ここでいうプラスミド
ＤＮＡには、コスミドＤＮＡも当然含まれる。この工程
は、溶菌用試薬を第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
のトラップフィルターに添加した後、室温にて５―１０
分間放置して行われる。
ートリッジのトラップフィルター上に添加し、形質転換
体を溶菌させ、核外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）を細胞
外に溶出させる。また、この工程では、同時に溶菌用試
薬によって不要なＲＮＡを消化する。したがって、上記
溶菌用試薬は、溶菌を行うための溶菌酵素とＲＮＡを消
化するためのＲＮＡ分解酵素（リボヌクレアーゼ）を含
むことが好ましい。溶菌酵素としては、例えば、細菌細
胞壁加水分解酵素であるリゾチーム(lysozyme)を用いる
ことができ、ＲＮＡ分解酵素としては、例えば、リボヌ
クレアーゼＡ（RNaseA）を使用することができる。これ
らは、一種のみを単独で用いても良く、また二種以上の
ものを組み合わせて用いることもできる。溶出させる核
外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）は、周知のとおりベクタ
ーとして利用されるものであり、ここでいうプラスミド
ＤＮＡには、コスミドＤＮＡも当然含まれる。この工程
は、溶菌用試薬を第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
のトラップフィルターに添加した後、室温にて５―１０
分間放置して行われる。
【００１２】(3) 第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
による不純物濾過工程 上記(2) の工程を終えた後、第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジのトラップフィルター上に、試料の完全可溶
化処理のための試薬、例えば、０．２Ｎ水酸化ナトリウ
ム・１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を適量添加し、室
温にて２〜５分間放置することにより、試料の完全可溶
化処理を行う。次いで、例えば、３Ｍ酢酸カリウム（ｐ
Ｈ４．８）を適量添加して、室温にて３〜５分間放置
し、塩基性溶液を中和するとともに、細胞構成タンパク
質及び染色体ＤＮＡを凝固処理する。そして、第１のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジ（当初集菌したもの）に真
空ポンプによる減圧を用いた濾過操作あるいは遠心分離
による濾過操作を施し、プラスミドＤＮＡを含む抽出液
を分離する（第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの下
部より抽出される）。
による不純物濾過工程 上記(2) の工程を終えた後、第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジのトラップフィルター上に、試料の完全可溶
化処理のための試薬、例えば、０．２Ｎ水酸化ナトリウ
ム・１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を適量添加し、室
温にて２〜５分間放置することにより、試料の完全可溶
化処理を行う。次いで、例えば、３Ｍ酢酸カリウム（ｐ
Ｈ４．８）を適量添加して、室温にて３〜５分間放置
し、塩基性溶液を中和するとともに、細胞構成タンパク
質及び染色体ＤＮＡを凝固処理する。そして、第１のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジ（当初集菌したもの）に真
空ポンプによる減圧を用いた濾過操作あるいは遠心分離
による濾過操作を施し、プラスミドＤＮＡを含む抽出液
を分離する（第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの下
部より抽出される）。
【００１３】(4) 第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
でＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工程 この工程では、まず、上記(3)の工程で得られた抽出液
及び等量のＤＮＡ吸着のための試薬、例えば、８Ｍヨウ
化ナトリウムＮａＩを第２のＤＮＡ抽出精製用カートリ
ッジに添加する。これは、ガラスパウダーへのＤＮＡ吸
着はカオトロピックイオン（chaotropic ion）存在下で
促進されることに基づいている。さらにアガロースゲル
電気泳動で分離したＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽
出精製する方法にもガラスパウダーへのＤＮＡ吸着法が
応用されている（Vogelstein, B.及び D. Gillespie, 1
979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615)。カオトロ
ピックイオンを生成する試薬として、ＬｉＣｌＯ4 ，Ｋ
Ｉ，ＮａＩ，ＬｉＣｌ，ＮａＣＨＯ2 等があるが、Ｎａ
Ｉ（ヨウ化ナトリウム）の入手が容易である。次いで、
この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、真空ポン
プによる減圧を用いた操作あるいは遠心分離による操作
を施し、プラスミドＤＮＡを、吸着させる。このカート
リッジは、後述するように、ガラス繊維フィルター（二
層）とガラスパウダー層とメンブランフィルターとから
成る少なくとも四重の構造である。プラスミドＤＮＡ
は、主として、ガラスパウダー層に吸着される。さら
に、この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに洗浄用
緩衝液、例えば、１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ８．０）
・１ｍＭ ＥＤＴＡ・０．２ＭＮａＣｌ・５０％エタノ
ールを添加し、真空ポンプによる減圧を用いた操作ある
いは遠心分離による操作を施し、洗浄を行う。最後に、
この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、溶出用緩
衝液例えば、滅菌蒸留水／１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ
８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡを５０―１００μｌ添加し
て、真空ポンプによる減圧を用いた操作あるいは遠心分
離による操作を施し、プラスミドＤＮＡのみを溶出精製
する。
でＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工程 この工程では、まず、上記(3)の工程で得られた抽出液
及び等量のＤＮＡ吸着のための試薬、例えば、８Ｍヨウ
化ナトリウムＮａＩを第２のＤＮＡ抽出精製用カートリ
ッジに添加する。これは、ガラスパウダーへのＤＮＡ吸
着はカオトロピックイオン（chaotropic ion）存在下で
促進されることに基づいている。さらにアガロースゲル
電気泳動で分離したＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽
出精製する方法にもガラスパウダーへのＤＮＡ吸着法が
応用されている（Vogelstein, B.及び D. Gillespie, 1
979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615)。カオトロ
ピックイオンを生成する試薬として、ＬｉＣｌＯ4 ，Ｋ
Ｉ，ＮａＩ，ＬｉＣｌ，ＮａＣＨＯ2 等があるが、Ｎａ
Ｉ（ヨウ化ナトリウム）の入手が容易である。次いで、
この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、真空ポン
プによる減圧を用いた操作あるいは遠心分離による操作
を施し、プラスミドＤＮＡを、吸着させる。このカート
リッジは、後述するように、ガラス繊維フィルター（二
層）とガラスパウダー層とメンブランフィルターとから
成る少なくとも四重の構造である。プラスミドＤＮＡ
は、主として、ガラスパウダー層に吸着される。さら
に、この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに洗浄用
緩衝液、例えば、１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ８．０）
・１ｍＭ ＥＤＴＡ・０．２ＭＮａＣｌ・５０％エタノ
ールを添加し、真空ポンプによる減圧を用いた操作ある
いは遠心分離による操作を施し、洗浄を行う。最後に、
この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、溶出用緩
衝液例えば、滅菌蒸留水／１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ
８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡを５０―１００μｌ添加し
て、真空ポンプによる減圧を用いた操作あるいは遠心分
離による操作を施し、プラスミドＤＮＡのみを溶出精製
する。
【００１４】
【実施例】以下に、本発明にかかるＤＮＡ抽出装置を添
付図面に示した実施例を参照しながら説明し、続いて、
このＤＮＡ抽出装置を用いて行った本発明にかかるＤＮ
Ａ抽出方法の試験例を説明する。しかし、これらの実施
例あるいは試験例は、本発明の技術的範囲を限定する意
図のものではなく、本発明の技術的思想の範囲内におけ
る、変更、付加、修飾は全て本発明の技術的範囲に含ま
れる。
付図面に示した実施例を参照しながら説明し、続いて、
このＤＮＡ抽出装置を用いて行った本発明にかかるＤＮ
Ａ抽出方法の試験例を説明する。しかし、これらの実施
例あるいは試験例は、本発明の技術的範囲を限定する意
図のものではなく、本発明の技術的思想の範囲内におけ
る、変更、付加、修飾は全て本発明の技術的範囲に含ま
れる。
【００１５】図１は、本発明にかかるＤＮＡ抽出装置の
うち、第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの実施例を
示し、図において、１はトラップフィルター、２はメン
ブランフィルター、３はカートリッジ容器である。
うち、第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの実施例を
示し、図において、１はトラップフィルター、２はメン
ブランフィルター、３はカートリッジ容器である。
【００１６】トラップフィルター１は、主として形質転
換体である大腸菌等の菌体を捕集し、溶菌するのための
層である。材質としては、ガラス繊維フィルターやポリ
エチレン樹脂フィルターや不織布フィルター等が好まし
く、大腸菌等の菌体を立体的に捕集する特性を備えてい
ることが好ましい。具体的には、東洋濾紙社製のガラス
繊維フィルター、スペイシーケミカル社製のポリエチレ
ン樹脂フィルター等を使用することができる。
換体である大腸菌等の菌体を捕集し、溶菌するのための
層である。材質としては、ガラス繊維フィルターやポリ
エチレン樹脂フィルターや不織布フィルター等が好まし
く、大腸菌等の菌体を立体的に捕集する特性を備えてい
ることが好ましい。具体的には、東洋濾紙社製のガラス
繊維フィルター、スペイシーケミカル社製のポリエチレ
ン樹脂フィルター等を使用することができる。
【００１７】メンブランフィルター２は、主として凝固
タンパク，染色体ＤＮＡ等の不要物の濾過・除去のため
の層である。材質としては、酢酸セルロース，ポリフッ
化ビニリデン等が好ましく、生物学的不活性，低タンパ
ク吸着性の特性を備えていることが好ましい。具体的に
は、東洋濾紙社製のセルロースアセテートタイプメンブ
ランフィルター、ミリポア社製のデュラポアメンブラン
等を使用することができる。
タンパク，染色体ＤＮＡ等の不要物の濾過・除去のため
の層である。材質としては、酢酸セルロース，ポリフッ
化ビニリデン等が好ましく、生物学的不活性，低タンパ
ク吸着性の特性を備えていることが好ましい。具体的に
は、東洋濾紙社製のセルロースアセテートタイプメンブ
ランフィルター、ミリポア社製のデュラポアメンブラン
等を使用することができる。
【００１８】カートリッジ容器３は、通常、外容器及び
フィルター固定用内筒で構成し、本体部分は、通常、円
柱状とし、大きさとしては、φ１０〜２０ｍｍ，長さ３
０〜５０ｍｍのものを使用することができる。
フィルター固定用内筒で構成し、本体部分は、通常、円
柱状とし、大きさとしては、φ１０〜２０ｍｍ，長さ３
０〜５０ｍｍのものを使用することができる。
【００１９】なお、図１の実施例では、トラップフィル
ター１、メンブランフィルター２、カートリッジ容器３
のみを模式的に表示しているが、必要に応じて他にマイ
クロチューブを設けることもできる。また、このような
カートリッジを使用する際に、必要な周辺機器、例え
ば、遠心機もしくは真空ポンプ及び吸引用カートリッジ
スタンドを、本発明の適用に伴って使用する。
ター１、メンブランフィルター２、カートリッジ容器３
のみを模式的に表示しているが、必要に応じて他にマイ
クロチューブを設けることもできる。また、このような
カートリッジを使用する際に、必要な周辺機器、例え
ば、遠心機もしくは真空ポンプ及び吸引用カートリッジ
スタンドを、本発明の適用に伴って使用する。
【００２０】図２は、本発明にかかるＤＮＡ抽出装置の
うち、第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの実施例を
示し、図において、２１はガラス繊維フィルター、２２
はガラスパウダー層、２３はガラス繊維フィルター、２
４はメンブランフィルター、２５はカートリッジ容器で
ある。
うち、第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの実施例を
示し、図において、２１はガラス繊維フィルター、２２
はガラスパウダー層、２３はガラス繊維フィルター、２
４はメンブランフィルター、２５はカートリッジ容器で
ある。
【００２１】ガラス繊維フィルター２１，２３は、主と
してプラスミド吸着補助のための層である。材質として
は、微細ホウケイ酸塩ガラス繊維等が好ましく、生化学
的液体に対して不活性の特性を備えていることが好まし
い。具体的には、東洋濾紙社製のＧＡ―１００，２０
０，ＧＣ―５０、ワットマン社製のＧＦシリーズ等を使
用することができる。
してプラスミド吸着補助のための層である。材質として
は、微細ホウケイ酸塩ガラス繊維等が好ましく、生化学
的液体に対して不活性の特性を備えていることが好まし
い。具体的には、東洋濾紙社製のＧＡ―１００，２０
０，ＧＣ―５０、ワットマン社製のＧＦシリーズ等を使
用することができる。
【００２２】ガラスパウダー層２２は、主としてＤＮＡ
吸着のための層である。材質としては、シリカマトリッ
クス等が好ましく、水中沈降速度０．２５ｃｍ／ｍｉｎ
以下の特性を備えていることが好ましい。具体的には、
旭硝子社製のガラスパウダー、ＢＩＯ１０１社製のＧＬ
ＡＳＳＭＩＬＫTM等を使用することができる。
吸着のための層である。材質としては、シリカマトリッ
クス等が好ましく、水中沈降速度０．２５ｃｍ／ｍｉｎ
以下の特性を備えていることが好ましい。具体的には、
旭硝子社製のガラスパウダー、ＢＩＯ１０１社製のＧＬ
ＡＳＳＭＩＬＫTM等を使用することができる。
【００２３】メンブランフィルター２４、カートリッジ
容器２５の機能及び材質等は、上記した図１のメンブラ
ンフィルター２、カートリッジ容器３と同様である。
容器２５の機能及び材質等は、上記した図１のメンブラ
ンフィルター２、カートリッジ容器３と同様である。
【００２４】第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ作製
はメンブランフィルター，ガラス繊維フィルターを順に
積層した後、ガラスパウダー懸濁液２０〜１００μｌを
添加する。このカートリッジを減圧吸引ないしはスイン
グロータで遠心してガラスパウダーをガラス繊維フィル
ター上に均一に密着させ、さらにガラス繊維フィルター
を積層して四重の層構造カートリッジを作製する。
はメンブランフィルター，ガラス繊維フィルターを順に
積層した後、ガラスパウダー懸濁液２０〜１００μｌを
添加する。このカートリッジを減圧吸引ないしはスイン
グロータで遠心してガラスパウダーをガラス繊維フィル
ター上に均一に密着させ、さらにガラス繊維フィルター
を積層して四重の層構造カートリッジを作製する。
【００２５】なお、図２の実施例では、ガラス繊維フィ
ルター２１、ガラスパウダー層２２、ガラス繊維フィル
ター２３、メンブランフィルター２４、カートリッジ容
器２５のみを模式的に表示しているが、必要に応じて他
にカートリッジフィルターの下に精製ＤＮＡ溶出液を受
けるマイクロチューブを設けることもできる。また、こ
のようなカートリッジを使用する際に、必要な周辺機
器、例えば、遠心機もしくは真空ポンプ及び吸引用カー
トリッジスタンドを、本発明の適用に伴って使用する。
ルター２１、ガラスパウダー層２２、ガラス繊維フィル
ター２３、メンブランフィルター２４、カートリッジ容
器２５のみを模式的に表示しているが、必要に応じて他
にカートリッジフィルターの下に精製ＤＮＡ溶出液を受
けるマイクロチューブを設けることもできる。また、こ
のようなカートリッジを使用する際に、必要な周辺機
器、例えば、遠心機もしくは真空ポンプ及び吸引用カー
トリッジスタンドを、本発明の適用に伴って使用する。
【００２６】上記第１，第２のＤＮＡ抽出精製用カート
リッジの各々の層を構成する素材は、それら自体市場に
おいて安価に入手できるものである。したがって、本発
明にかかる装置の提供にあたり製造上のコスト的負担は
小さい。
リッジの各々の層を構成する素材は、それら自体市場に
おいて安価に入手できるものである。したがって、本発
明にかかる装置の提供にあたり製造上のコスト的負担は
小さい。
【００２７】次に、上記図１，図２に示した第１，第２
のＤＮＡ抽出精製用カートリッジを用いて行った本発明
にかかるＤＮＡ抽出精製方法の試験例を示す。
のＤＮＡ抽出精製用カートリッジを用いて行った本発明
にかかるＤＮＡ抽出精製方法の試験例を示す。
【００２８】試験例(1) 形質転換体培養液を第１のカートリッジに集菌する
工程 この工程に先だって、形質転換体の終夜培養液を調製し
た。大腸菌［Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１(ATCC 33694)を
宿主微生物として、これをＨａｎａｈａｎの方法（Hana
han,D., 1983, J.Mol.Biol.,166 ,577）に従い形質転換
した形質転換体を使用した。選択培地としては、アンピ
シリン(ampisilin) を含むルリア・ベルタニ(LuriaBert
ani) 培地を使用した。この培地の組成は、以下のとお
りであった。 Bacto-tryptone ： １０ｇ／Ｌ Bacto-yeast extract ： ５ｇ／Ｌ NaCl ： １０ｇ／Ｌ Ampicilin ： ３５〜５０ｍｇ／Ｌ 水酸化ナトリウムによってｐＨを７．５に調整した。こ
の培地３ｍｌを使用して、終夜培養を行った。なお、培
地の容量は、図１，図２の第１，第２のＤＮＡ抽出精製
用カートリッジを用いる場合、１―３ｍｌとすることが
好適である。調製された終夜培養液を、第１のＤＮＡ抽
出精製用カートリッジに分注した。このように、終夜培
養液を分注した第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに
遠心分離操作を施し、形質転換体を第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジのトラップフィルターに補集した。
工程 この工程に先だって、形質転換体の終夜培養液を調製し
た。大腸菌［Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１(ATCC 33694)を
宿主微生物として、これをＨａｎａｈａｎの方法（Hana
han,D., 1983, J.Mol.Biol.,166 ,577）に従い形質転換
した形質転換体を使用した。選択培地としては、アンピ
シリン(ampisilin) を含むルリア・ベルタニ(LuriaBert
ani) 培地を使用した。この培地の組成は、以下のとお
りであった。 Bacto-tryptone ： １０ｇ／Ｌ Bacto-yeast extract ： ５ｇ／Ｌ NaCl ： １０ｇ／Ｌ Ampicilin ： ３５〜５０ｍｇ／Ｌ 水酸化ナトリウムによってｐＨを７．５に調整した。こ
の培地３ｍｌを使用して、終夜培養を行った。なお、培
地の容量は、図１，図２の第１，第２のＤＮＡ抽出精製
用カートリッジを用いる場合、１―３ｍｌとすることが
好適である。調製された終夜培養液を、第１のＤＮＡ抽
出精製用カートリッジに分注した。このように、終夜培
養液を分注した第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに
遠心分離操作を施し、形質転換体を第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジのトラップフィルターに補集した。
【００２９】(2) 溶菌及び不要ＲＮＡの分解工程 ２００μｌの溶菌用試薬を上記第１のＤＮＡ抽出精製用
カートリッジのトラップフィルターに添加し、形質転換
体を溶菌させ、核外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）を細胞
外に溶出させた。また、この工程で、同時に溶菌用試薬
によって不要なＲＮＡを消化した。上記溶菌用試薬は、
溶菌酵素としては、リゾチーム(lysozyme)を含み、ＲＮ
Ａ分解酵素として、リボヌクレアーゼＡを含むものをを
使用した。本工程は、溶菌用試薬を第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジのトラップフィルターに添加した後、
室温にて１０分間放置して行った。
カートリッジのトラップフィルターに添加し、形質転換
体を溶菌させ、核外遺伝子（プラスミドＤＮＡ）を細胞
外に溶出させた。また、この工程で、同時に溶菌用試薬
によって不要なＲＮＡを消化した。上記溶菌用試薬は、
溶菌酵素としては、リゾチーム(lysozyme)を含み、ＲＮ
Ａ分解酵素として、リボヌクレアーゼＡを含むものをを
使用した。本工程は、溶菌用試薬を第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジのトラップフィルターに添加した後、
室温にて１０分間放置して行った。
【００３０】(3) 第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
による不純物濾過工程 上記(2) の工程を終えた後、第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジのトラップフィルターに、試料の完全可溶化
処理のための試薬として０．２Ｎ水酸化ナトリウム・１
％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を４００μｌ添加し、室
温にて５分間放置することにより、試料の完全可溶化処
理を行った。次いで、３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．８）
を３００μｌ添加して、室温にて５分間放置し、塩基性
溶液を中和するとともに、細胞構成タンパク質及び染色
体ＤＮＡを凝固処理した。そして、第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジ（当初集菌したもの）に遠心分離によ
る濾過操作を施し、プラスミドＤＮＡを含む抽出液を分
離した（第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの下部よ
り抽出した）。
による不純物濾過工程 上記(2) の工程を終えた後、第１のＤＮＡ抽出精製用カ
ートリッジのトラップフィルターに、試料の完全可溶化
処理のための試薬として０．２Ｎ水酸化ナトリウム・１
％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を４００μｌ添加し、室
温にて５分間放置することにより、試料の完全可溶化処
理を行った。次いで、３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．８）
を３００μｌ添加して、室温にて５分間放置し、塩基性
溶液を中和するとともに、細胞構成タンパク質及び染色
体ＤＮＡを凝固処理した。そして、第１のＤＮＡ抽出精
製用カートリッジ（当初集菌したもの）に遠心分離によ
る濾過操作を施し、プラスミドＤＮＡを含む抽出液を分
離した（第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの下部よ
り抽出した）。
【００３１】(4) 第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
でＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工程 この工程では、まず、上記(3) の工程で得られた抽出液
及び等量のＤＮＡ吸着のための試薬として８Ｍヨウ化ナ
トリウムＮａＩを第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
に添加した。次いで、この第２のＤＮＡ抽出精製用カー
トリッジに、遠心分離による操作を施し、プラスミドＤ
ＮＡを、このカートリッジのガラス繊維フィルター及び
ガラスパウダーに吸着させた。。さらに、この第２のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジに洗浄用緩衝液として、１
０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡ
・０．２ＭＮａＣｌ・５０％エタノールを３５０μｌ添
加し、遠心分離による操作を施し、洗浄を行った。最後
に、この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、溶出
用緩衝液として、蒸留水／１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ
８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡを１００μｌ添加して、遠
心分離による操作を施し、プラスミドＤＮＡのみを溶出
精製した。
でＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工程 この工程では、まず、上記(3) の工程で得られた抽出液
及び等量のＤＮＡ吸着のための試薬として８Ｍヨウ化ナ
トリウムＮａＩを第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジ
に添加した。次いで、この第２のＤＮＡ抽出精製用カー
トリッジに、遠心分離による操作を施し、プラスミドＤ
ＮＡを、このカートリッジのガラス繊維フィルター及び
ガラスパウダーに吸着させた。。さらに、この第２のＤ
ＮＡ抽出精製用カートリッジに洗浄用緩衝液として、１
０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡ
・０．２ＭＮａＣｌ・５０％エタノールを３５０μｌ添
加し、遠心分離による操作を施し、洗浄を行った。最後
に、この第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに、溶出
用緩衝液として、蒸留水／１０ｍＭトリス―塩酸（ｐＨ
８．０）・１ｍＭ ＥＤＴＡを１００μｌ添加して、遠
心分離による操作を施し、プラスミドＤＮＡのみを溶出
精製した。
【００３２】図３に、上記試験例で精製されたプラスミ
ドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分離の結果を示す。
夾雑物であるＲＮＡ，染色体由来ＤＮＡ，タンパク質の
混入は全く見られず、塩化セシウム密度勾配超遠心分離
精製プラスミドＤＮＡと同等以上の純度が得られた。し
たがって、各種解析実験に支障なく使用可能であること
が確認された。
ドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分離の結果を示す。
夾雑物であるＲＮＡ，染色体由来ＤＮＡ，タンパク質の
混入は全く見られず、塩化セシウム密度勾配超遠心分離
精製プラスミドＤＮＡと同等以上の純度が得られた。し
たがって、各種解析実験に支障なく使用可能であること
が確認された。
【００３３】
【発明の効果】以上より明らかなように、本発明によれ
ば、形質転換体で複製増幅された核外遺伝子ＤＮＡ（プ
ラスミドＤＮＡ）を、終夜培養液から安価に抽出精製す
ることのできるＤＮＡ抽出精製方法及び装置が提供され
る。
ば、形質転換体で複製増幅された核外遺伝子ＤＮＡ（プ
ラスミドＤＮＡ）を、終夜培養液から安価に抽出精製す
ることのできるＤＮＡ抽出精製方法及び装置が提供され
る。
【図１】第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの構造を
示す模式図である。
示す模式図である。
【図２】第２のＤＮＡ抽出精製用カートリッジの構造を
示す模式図である。
示す模式図である。
【図３】試験例の電気泳動の結果を示すグラフである。
１ トラップフィルター ２ メンブランフィルター ３ カートリッジ容器 ２１ ガラス繊維フィルター ２２ ガラスパウダー層 ２３ ガラス繊維フィルター ２４ メンブランフィルター ２５ カートリッジ容器
Claims (4)
- 【請求項１】 (1) 形質転換体培養液を第１のＤＮＡ抽
出精製用カートリッジに集菌する工程、(2) 溶菌及び不
要ＲＮＡの分解工程、(3) 第１のＤＮＡ抽出精製用カー
トリッジによる不純物濾過工程、(4) 第２のＤＮＡ抽出
精製用カートリッジでＤＮＡを吸着、洗浄、溶出する工
程を含むプラスミドＤＮＡの抽出精製方法。 - 【請求項２】 少なくともトラップフィルター及びメン
ブランフィルターを含む第１のＤＮＡ抽出精製用カート
リッジと、少なくともガラス繊維フィルターとガラスパ
ウダー層とメンブランフィルターとを含む第２のＤＮＡ
抽出精製用カートリッジとを含むＤＮＡ抽出精製装置。 - 【請求項３】 請求項２のＤＮＡ抽出精製装置の実施に
直接使用する請求項２の第１のＤＮＡ抽出精製用カート
リッジ。 - 【請求項４】 請求項２のＤＮＡ抽出精製装置の実施に
直接使用する請求項２の第２のＤＮＡ抽出精製用カート
リッジ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6069961A JP3045922B2 (ja) | 1994-03-15 | 1994-03-15 | Ｄｎａ抽出精製方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6069961A JP3045922B2 (ja) | 1994-03-15 | 1994-03-15 | Ｄｎａ抽出精製方法及び装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07250681A true JPH07250681A (ja) | 1995-10-03 |
| JP3045922B2 JP3045922B2 (ja) | 2000-05-29 |
Family
ID=13417768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6069961A Expired - Fee Related JP3045922B2 (ja) | 1994-03-15 | 1994-03-15 | Ｄｎａ抽出精製方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3045922B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0814156A2 (en) * | 1996-06-18 | 1997-12-29 | The Institute Of Physical & Chemical Research | Method for the purification of DNA |
| JP2001333763A (ja) * | 2000-05-30 | 2001-12-04 | Hitachi Koki Co Ltd | 自動分離抽出装置及びその抽出方法 |
| JP2002345465A (ja) * | 2001-05-24 | 2002-12-03 | Fuji Photo Film Co Ltd | 核酸精製ユニット及び核酸精製方法 |
| US6492162B1 (en) | 1998-10-27 | 2002-12-10 | Hitachi, Ltd. | Apparatus for the recovery of nucleic acids |
| US6969603B2 (en) | 1997-09-22 | 2005-11-29 | Riken | Method for isolating DNA |
| US7067287B1 (en) | 1997-10-28 | 2006-06-27 | Hitachi, Ltd. | Method for recovery of nucleic acids |
| JP2006521105A (ja) * | 2003-03-24 | 2006-09-21 | ベーリンガー インゲルハイム オーストリア ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 生物分子の生成方法及び装置 |
| US7119194B2 (en) | 1995-07-07 | 2006-10-10 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Nucleic acid-bondable magnetic carrier and method for isolating nucleic acid using the same |
| US7833705B2 (en) * | 1998-07-16 | 2010-11-16 | Whatman, Inc. | Archiving of vectors |
-
1994
- 1994-03-15 JP JP6069961A patent/JP3045922B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7119194B2 (en) | 1995-07-07 | 2006-10-10 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Nucleic acid-bondable magnetic carrier and method for isolating nucleic acid using the same |
| EP0814156A2 (en) * | 1996-06-18 | 1997-12-29 | The Institute Of Physical & Chemical Research | Method for the purification of DNA |
| EP0814156A3 (en) * | 1996-06-18 | 1998-04-22 | The Institute Of Physical & Chemical Research | Method for the purification of DNA |
| US5916775A (en) * | 1996-06-18 | 1999-06-29 | The Institute Of Physical And Chemical Research | Method for the purification of DNA |
| US6969603B2 (en) | 1997-09-22 | 2005-11-29 | Riken | Method for isolating DNA |
| US7067287B1 (en) | 1997-10-28 | 2006-06-27 | Hitachi, Ltd. | Method for recovery of nucleic acids |
| US7833705B2 (en) * | 1998-07-16 | 2010-11-16 | Whatman, Inc. | Archiving of vectors |
| US6492162B1 (en) | 1998-10-27 | 2002-12-10 | Hitachi, Ltd. | Apparatus for the recovery of nucleic acids |
| JP2001333763A (ja) * | 2000-05-30 | 2001-12-04 | Hitachi Koki Co Ltd | 自動分離抽出装置及びその抽出方法 |
| JP2002345465A (ja) * | 2001-05-24 | 2002-12-03 | Fuji Photo Film Co Ltd | 核酸精製ユニット及び核酸精製方法 |
| JP2006521105A (ja) * | 2003-03-24 | 2006-09-21 | ベーリンガー インゲルハイム オーストリア ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 生物分子の生成方法及び装置 |
| JP4699357B2 (ja) * | 2003-03-24 | 2011-06-08 | ベーリンガー インゲルハイム エルツェーファウ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト | 生物分子の生成方法及び装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3045922B2 (ja) | 2000-05-29 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |