CN108410863B - 一种番石榴叶片基因组dna的高效提取方法 - Google Patents
一种番石榴叶片基因组dna的高效提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，主要包括以下步骤：(1)向番石榴叶片中加入液氮，磨成粉末，再加入洗液，超声处理后在冰中静置，离心得到上清液a与底渣a；(2)向底渣a中加入酶，在冰中静置后，离心得到上清液b与底渣b；(3)向底渣b中加入CTAB抽提缓冲液，离心得到上清液c与底渣c；(4)向上清液c中加入Tris饱和酚、氯仿与异戊醇，离心得到上清液d与底渣d；(5)向上清液d中加入异丙醇，离心得到上清液e与底渣e；(6)将步骤(4)中得到的底渣e用乙醇洗涤，离心收集底渣即得到番石榴叶片基因组DNA。本发明DNA纯度高、提取率高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种番石榴基因组DNA的高效提取方法。
背景技术
番石榴属桃金娘科番石榴属植物。番石榴果形状有球形、椭圆、卵圆形及洋梨形，果皮普通为绿色、红色、黄色，果肉有白色、红色、黄色等，其肉质非常柔软，肉汁丰富，味道甜美，可溶性固形物含量为8％-11％，富含大量的钾、铁、胡萝卜素等物质，营养极其丰富，是养颜美容、减肥的最佳水果。其果实不但可以鲜食，还可以加工为果汁、果酱、果脯，同时还可制作成盆景，具有广阔的市场前景，是目前港澳台和东南亚地区最畅销的水果之一。另外，番石榴叶片和幼果切片晒干泡茶喝，可辅助治疗糖尿病。
基因组DNA的提取是分子生物学实验很重要的一个环节。基因组DNA的质量和产量，直接影响分子生物实验中与DNA有关的后续实验的进行。传统的DNA提取方法不易提到高质量的基因组DNA，而且耗时较长，操作步骤也较繁琐。番石榴叶片内次生代谢产物的种类极其复杂，且不同物种间至同一物种间不同季节，不同叶龄的叶片间次生代谢产物的异质性程度都较高；因此一种植物叶的基因组DNA提取方法往往不能很好地应用于另一种植物叶基因组DNA的提取，探索快速、安全、经济有效的番石榴叶基因组DNA提取方法尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种提取率高的番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，包括以下步骤：
(1)向剪碎(3mm左右)的番石榴叶片中加入液氮，用高频振动式超微粉机将番石榴叶片磨成粉末，再向粉末中加入洗液，混匀后在冰中静置，离心得到上清液a与底渣a；液氮变为气体时要吸收大量的热，可使番石榴叶片瞬间冷冻，研磨起来更彻底，也不会破坏番石榴叶片细胞内所含物质的形态；冰中静置时低温可以促进细胞沉淀；研磨时番石榴叶片中的多糖、多酚等在DNA提取过程中易与DNA共分离或抑制DNA的提取等，在用CTAB抽提缓冲液裂解细胞前，先用洗液预处理液氮研磨的番石榴叶片组织样，可提前除去干扰DNA分离的次生代谢产物；
(2)向底渣a中加入纤维素酶和果胶酶，在冰中静置后，离心得到上清液b与底渣b；
(3)向底渣b中加入CTAB抽提缓冲液，混匀后水浴加热，再冷却至室温，离心得到上清液c与底渣c；
(4)向上清液c中加入Tris饱和酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，混匀后于低温离心得到上清液d与底渣d；实验研究表明低温(如4℃)利于DNA的沉淀；混合溶液的作用在于沉淀去除蛋白质等物质，以得到纯净的DNA；
(5)向上清液d中加入已提前预冷的异丙醇，混匀后再次于低温下离心得到上清液e与底渣e；步骤(1)中番石榴叶片是用液氮低温处理的，再加上低温处理利于沉淀，所以采用已提前预冷(如4℃)的异丙醇沉淀DNA，另外，异丙醇对油性物质的溶解能力强；
(6)将步骤(5)中得到的底渣e用乙醇洗涤，离心收集底渣即得到番石榴叶片基因组DNA。
上述番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法中，优选的，进行步骤(5)之前用上清液d代替上清液c再重复步骤(4)的操作至少一次。重复步骤(4)至少一次可以提高多糖、蛋白质等的去除率，以后续得到更加纯净的DNA。
上述番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法中，优选的，所述洗液的成分包括：50mMTris-HCl，5mM EDTA，350mM山梨醇，体积分数为2％PVP，体积分数为0.5％β-巯基乙醇，并控制所述洗液的pH值为8.0。
上述番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法中，优选的，控制每克番石榴叶片中加入1.8-2.4mL的所述洗液。实验研究表明，洗液加入时控制其加入量与番石榴叶片的质量控制为上述范围可以更加有利于得到更加纯净的DNA。
上述番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法中，优选的，控制每克番石榴叶片中加入80-120μL的所述纤维素酶和果胶酶。实验研究表明，在加入CTAB抽提缓冲液进行破壁前，加入酶进行预处理可以提高最终DNA的收率。
上述番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法中，优选的，所述CTAB抽提缓冲液的成分包括：体积分数为1％CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/L EDTA，体积分数为1％β-巯基乙醇，体积分数为2％PVP，并控制所述CTAB抽提缓冲液的pH值为8.0。
上述番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法中，优选的，控制每毫克底渣b中加入8-10mL的所述CTAB抽提缓冲液。考虑到番石榴叶片的特性，本发明中，CTAB抽提缓冲液中CTAB的浓度较低，通过调整其用量，可以更加有利于裂解不同叶龄的番石榴叶片细胞，最终对提升DNA提取率有很大的帮助，且适用的范围更广。
上述番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法中，优选的，所述混合溶液中Tris饱和酚、氯仿与异戊醇的体积比为25∶24∶1，所述混合溶液的加入量为上液清c的体积相同。Tris饱和酚、氯仿与异戊醇三者共同作用，效果更佳，更加有利于提升最终DNA的纯度。
上述番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法中，优选的，所述异丙醇的加入量为所述上清液c的体积2/3。
本发明的番石榴叶基因组DNA样品，可经0.8％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和质量。
多酚、多糖、蛋白质等物质的含量是DNA提取好坏的关键影响因素，这些物质在样品中的含量多少直接影响到了DNA提取的质量。番石榴是一种多年生的热带果树，其叶片中的多酚、多糖、蛋白质等物质的含量较高，采用一般的CTAB方法和SDS的方法很难分离出较好的DNA。另外，对番石榴叶细胞破壁的程度决定了最终DNA的提取率。本发明的原理如下：1)剪碎至3mm左右的番石榴叶片在高频振动式超微粉机碎磨成粉末，再通过超声、酶处理，可以更好的起到预破壁的效果。首先通过微粉碎技术，利用机械或流体力学途径将直径为3mm番石榴叶片粉碎至10-15μm(一般此时细胞破壁率大于95％)，再加入洗液混匀后超声，会使粉碎的番石榴叶片进一步破裂，也不会破坏番石榴叶片细胞内所含物质的形态，最后加入纤维素酶和果胶酶充分破壁，微粉碎技术-超声-酶处理三者结合，最终预破壁效果更好。2)本发明中洗液与CTAB抽提缓冲液含有EDTA、β-巯基乙醇与PVP，EDTA与巯基乙醇可以较好地抑制酚的自发氧化和褐变，PVP能络合多种酚类物质，防止多酚氧化物引起的DNA褐变反应；β-巯基乙醇可降解蛋白质、并抑制多种酶的氧化活性。3)本发明的洗液中还含有NaCl，多糖在NaCl的高盐条件下可与高浓度的CTAB结合，可采用氯仿抽提除去。4)Tris饱和酚、氯仿与异戊醇的混合溶液多次抽提后可有效去除蛋白质等物质。本发明中通过预破壁、CTAB抽提缓冲液与后续的Tris饱和酚、氯仿与异戊醇的混合溶液多次离心、沉淀后可以较好地从番石榴叶片中提取得到高质量、高纯度的DNA。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明在加入CTAB抽提缓冲液之前利用微粉碎技术-超声-酶处理三者联合进行预破壁处理，可以大大提升最终番石榴的DNA的提取率及纯度。
2、本发明中通过优化洗脱液的用量、CTAB抽提缓冲液的用量及配比及各类试剂的成分及配比，可大提升最终提取得到的番石榴DNA的纯度。
3、本发明方法适用适用范围广，操作简单，更加有利于番石榴的推广利用。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，包括以下步骤：
(1)将剪碎番石榴叶片0.5g放入无菌研钵中，添加液氮，利用高频振动式超微粉机将番石榴叶片碎磨成粉末，再将粉末转入离心管中，加入1.2mL洗液，混匀后超声处理，在冰中静置15min，10000rpm离心10min得到上清液a与底渣a，其中，洗液的成分包括：50mMTris-HCl，5mM EDTA，350mM山梨醇，体积分数为2％PVP，体积分数为0.5％β-巯基乙醇，并控制洗液的pH值为8.0；
(2)向底渣a中加入纤维素酶和果胶酶50μL，在冰中静置10min后，10000rmp/min离心10min离心得到上清液b与底渣b；
(3)在步骤(2)得到的底渣b中加入CTAB抽提缓冲液，混匀后于60℃水浴加热45min，再冷却至室温，其中，控制每毫克底渣b中加入9mL的CTAB抽提缓冲液，CTAB抽提缓冲液的成分包括：体积分数为1％CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，体积分数为1％β-巯基乙醇，体积分数为2％PVP，并控制CTAB抽提缓冲液的pH值为8.0，离心得到上清液c与底渣c；
(4)向上清液c中加入与上清液c等体积的饱和酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，且混合溶液中饱和酚、氯仿与异戊醇的体积比为25∶24∶1，混匀后于4℃，12000rpm下离心10min得到上清液d与底渣d，再将上清液d移至无菌离心管中；
(5)用上清液d代替上清液c再重复步骤(4)的操作三次；
(6)向上清液d中加入上清液d体积2/3的、已提前预冷至4℃的异丙醇，混匀后再次于4℃，12000rpm下离心5min得到上清液e与底渣e；
(7)将步骤(6)中得到的底渣e用70％的乙醇洗涤，离心收集底渣即得到番石榴叶片基因组DNA；
(8)将底渣干燥，-20℃保存备用。
实施例2：
一种番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，包括以下步骤：
(1)将剪碎番石榴叶片0.5g放入无菌研钵中，添加液氮，利用高频振动式超微粉机将番石榴叶片碎磨成粉末，再将粉末转入离心管中，加入1.0mL洗液，混匀后超声处理，在冰中静置15min，10000rpm离心10min得到上清液a与底渣a，其中，洗液的成分包括：50mMTris-HCl，5mM EDTA，350mM山梨醇，体积分数为2％PVP，体积分数为0.5％β-巯基乙醇，并控制洗液的pH值为8.0；
(2)向底渣a中加入纤维素酶和果胶酶55μL，在冰中静置10min后，10000rmp/min离心10min离心得到上清液b与底渣b；
(3)在步骤(2)得到的底渣b中加入CTAB抽提缓冲液，混匀后于60℃水浴加热45min，再冷却至室温，其中，控制每毫克底渣b中加入10mL的CTAB抽提缓冲液，CTAB抽提缓冲液的成分包括：体积分数为1％CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/L EDTA，体积分数为1％β-巯基乙醇，体积分数为2％PVP，并控制CTAB抽提缓冲液的pH值为8.0，离心得到上清液c与底渣c；
(4)向上清液c中加入与上清液c等体积的饱和酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，且混合溶液中饱和酚、氯仿与异戊醇的体积比为25∶24∶1，混匀后于4℃，12000rpm下离心10min得到上清液d与底渣d，再将上清液d移至无菌离心管中；
(5)用上清液d代替上清液c再重复步骤(4)的操作两次；
(6)向上清液d中加入上清液d体积2/3的、已提前预冷至4℃的异丙醇，混匀后再次于4℃，12000rpm下离心5min得到上清液e与底渣e；
(7)将步骤(6)中得到的底渣e用70％的乙醇洗涤，离心收集底渣即得到番石榴叶片基因组DNA；
(8)将底渣干燥，-20℃保存备用。
对比例1：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于步骤(1)中采用常规研磨、不经过超声处理，且不进行步骤(2)的操作。
对比例2：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于步骤(1)中不经过超声处理，且不进行步骤(2)的操作。
对比例3：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于不进行步骤(2)的操作。
对比例4：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于步骤(1)中不经过超声处理。
对比例5：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于步骤(1)中采用常规研磨。
对比例6：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于步骤(3)中控制每毫克底渣a中加入5mL的CTAB抽提缓冲液。
实施例1-2与对比例1-6得到的番石榴叶基因组DNA经紫外分光光度计检测，分别测定其纯度和质量，结果如下表1所示。
表1：实施例1-2与对比例1-6得到的番石榴叶基因组DNA的纯度和质量
| 纯度(％) | 质量(μg) | |
| 实施例1 | 96.9 | 0.70 |
| 实施例2 | 96.1 | 0.66 |
| 对比例1 | 95.5 | 0.51 |
| 对比例2 | 95.0 | 0.53 |
| 对比例3 | 95.2 | 0.57 |
| 对比例4 | 95.6 | 0.60 |
| 对比例5 | 95.6 | 0.60 |
| 对比例6 | 94.2 | 0.48 |
Claims (6)
1.一种番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向剪碎的番石榴叶片中加入液氮，用高频振动式超微粉机将番石榴叶片磨成粉末，所述粉末的大小为10-15μm，再向粉末中加入洗液，超声处理后在冰中静置，离心得到上清液a与底渣a；
（2）向底渣a中加入纤维素酶和果胶酶，在冰中静置后，离心得到上清液b与底渣b；控制每克番石榴叶片中加入80-120μL的所述纤维素酶和果胶酶；
（3）向底渣b中加入CTAB 抽提缓冲液，混匀后水浴加热，再冷却至室温，离心得到上清液c与底渣c；所述CTAB抽提缓冲液的成分包括：体积分数为1%CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，体积分数为1%β-巯基乙醇，体积分数为2%PVP，并控制所述CTAB抽提缓冲液的pH值为8.0；控制每毫克底渣b中加入8-10mL的所述CTAB抽提缓冲液；
（4）向上清液c中加入Tris饱和酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，混匀后于低温离心得到上清液d与底渣d；
（5）向上清液d中加入已提前预冷的异丙醇，混匀后再次于低温下离心得到上清液e与底渣e；
（6）将步骤（5）中得到的底渣e用乙醇洗涤，离心收集底渣即得到番石榴叶片基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，进行步骤（5）之前用上清液d代替上清液c再重复步骤（4）的操作至少一次。
3.根据权利要求1或2所述的番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述洗液的成分包括：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，350mM山梨醇，体积分数为2％PVP，体积分数为0.5％β-巯基乙醇，并控制所述洗液的pH值为8.0。
4.根据权利要求3所述的番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，控制每克番石榴叶片中加入1.8-2.4mL的所述洗液。
5.根据权利要求1或2所述的番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述混合溶液中Tris饱和酚、氯仿与异戊醇的体积比为25∶24∶1，所述混合溶液的加入量为上液清c的体积相同。
6.根据权利要求1或2所述的番石榴叶片基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述异丙醇的加入量为所述上清液d的体积2/3。
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