CN114292840A - 一种番石榴果实rna的高效提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物基因工程技术领域，公开了一种番石榴果实RNA的高效提取方法，包括：配制bufferA；配制总RNA提取液；组织裂解；蛋白沉淀；RNA沉淀；RNA纯化。本发明可根据实验室离心机的型号、果实的大小来选择不同的体系来完成，效果稳定；本发明能无视果实中富含的多糖、多酚以及色素，提取高质量的总RNA。本发明提取样品量可根据实验材料，变化提取体系，样品量范围广泛，特别适合大体积果实，选择大样品量提取，代表性好，后续实验重复性好。本发明提取果实总RNA的浓度可达5000ng/ul，后续反转录加入模板体系可控，不影响反转录效果；本发明提取果实总RNA量较大，适合大量做荧光定量筛选候选基因。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种番石榴果实RNA的高效提取方法。
背景技术
目前，针对番石榴果实RNA的提取方法中，普通方法难以提取的富含多糖、多酚的果实的总RNA；普通方法提取样品量基本都在0.1g内，不适合大体积果实，0.1g样品代表性差，实验重复性差；普通方法提取果实总RNA的浓度较低，提取的RNA浓度一般低于100ng/ul，后续反转录加入模板体系较大，影响反转录效果；普通方法提取果实总RNA的量较少(≤5ug)，不适合大量做荧光定量筛选候选基因，得多次提取，成本高，重复性差。因此，亟需一种新的番石榴果实RNA的高效提取方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)普通方法难以提取的富含多糖、多酚的果实的总RNA，提取样品量基本都在0.1g内，不适合大体积果实，0.1g样品代表性差，实验重复性。
(2)普通方法提取果实总RNA的浓度较低，提取的RNA浓度一般低于100ng/ul，后续反转录加入模板体系较大，影响反转录效果。
(3)普通方法提取果实总RNA的量较少(可≤5ug)，不适合大量做荧光定量筛选候选基因，得多次提取，成本高，重复性差。
解决以上问题及缺陷的难度为：较难，试剂盒一般使用过柱法，吸附RNA的量有限，另外提取体系较小；多糖多酚对一般提取液影响较大，RNA得率受影响较大。就算通过多管提取重复过柱洗脱RNA，提取量提高不明显且成本增高。
解决以上问题及缺陷的意义为：解决样品代表性差，做后续定量重复性差等问题，获得大量高质量的RNA。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种番石榴果实RNA的高效提取方法。
本发明是这样实现的，一种番石榴果实RNA的高效提取方法，所述番石榴果实RNA的高效提取方法包括以下步骤：
步骤一，配制buffer A：将药品逐一加入溶解，定容，高温高压灭菌；能一定程度抑制RNase酶的活性。
步骤二，配制总RNA提取液：使用buffer A配制；去除多糖多酚对提取RNA的影响。
步骤三，组织裂解：于液氮中，将果实组织研磨成粉末状后转入无菌高速圆底离心管，加入RNA提取液，另加蛋白酶K，剧烈混匀后轻微振荡提取；
缓慢提取，能有效的降解蛋白，降低提取体系的粘稠度，更好的释放RNA。
步骤四，蛋白沉淀：加入2M KCl溶液，冰浴1h，中间混匀几次，高速离心；RNA在水相，能与蛋白分离。
步骤五，RNA沉淀：上清液转移到新的尖底离心管，加入1/3体积的8M LiCl，在4℃下过夜沉淀RNA；离心后去除上清液，用2M LiCl溶液洗涤沉淀2次，直至沉淀为无色；LiCl能最大化的沉淀RNA，不能沉淀蛋白和DNA，同时有效去除游离核苷酸。
步骤六，RNA纯化：加入10mM Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，并加入2M KOAc混合后在冰浴中保持30min，去除RNA中的多聚糖和残留蛋白质；第一次离心，将上清液转移至干净离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，放置，第二次离心，沉淀RNA；弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，离心并去除上层乙醇，真空干燥，用灭菌超纯水溶解RNA，在-80℃冰箱中保存备用。获得浓度高，量大，高质量RNA。
进一步，步骤一中，所述bufferA置于4℃条件下可保存半年。可大量配制，多次使用。
进一步，步骤二中，所述总RNA提取液现配现用，无需灭菌处理。现配现用，按需配制，能保证提取效果。
进一步，步骤三中，依据实验室离心机及实验材料，选择三个重量档次的样品：0.1g至0.5g、0.5g至2.0g、2.0g至10.0g。实验室平台不一样，可按需选择。
进一步，步骤三中，所述无菌高速圆底离心管的容积分别为2mL、10mL、50mL；所述RNA提取液为80℃预热的RNA提取液，分别为1.5mL、5mL、20mL；所述蛋白酶K分别为0.2mg、0.6mg、2.2mg。热提取液加到冷冻的粉状样品，更好的破坏组织细胞结构
进一步，步骤三中，所述轻微振荡提取的方法为：于42℃条件下保温并轻微振荡提取2h。缓慢提取，能有效的降解蛋白，降低提取体系的粘稠度，更好的释放RNA。
进一步，步骤四中，所述KCl溶液分别为0.18mL、0.6mL、2.4mL；于4℃下放置1h，每20min上下颠倒混匀一次，充分沉淀蛋白，以20000g的转速离心30min；其中，所述转速可降低至12000g。RNA在水相，能与蛋白分离。
进一步，步骤五中，所述上清液分别为1.5mL、6mL、21mL，所述尖底离心管的容积分别为2mL、10mL、50mL，所述LiCl溶液分别为1mL、2mL、4mL；所述RNA沉淀时间为12～15h；10000g离心30min后去除上清液，沉淀即为RNA的粗提物。LiCl能最大化的沉淀RNA，不能沉淀蛋白和DNA，同时有效去除游离核苷酸。
进一步，步骤六中，所述Tris-HCl分别为0.2mL、0.5mL、2mL，pH 7.5；所述KOAc分别为20uL、50uL、200uL，所述离心管的容积分别为1.5mL、2mL、10mL，所述70％乙醇分别为1.0mL、1.0mL、4.0mL，所述灭菌超纯水分别为50uL、100uL、200uL。有效去除RNA样品中的多糖，进一步纯化RNA
进一步，步骤六中，所述第一次离心条件为：10000g离心15min；在-80℃的条件下放置0.5h后进行第二次离心，所述第二次离心条件为：10000g离心30min。低温有利于RNA沉淀。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的番石榴果实RNA的高效提取方法，可以根据实验室离心机的型号、果实的大小(样品量)来选择不同的体系来完成，效果稳定。
本发明能无视果实中富含的多糖、多酚以及色素，提取高质量的总RNA。
本发明提取样品量可根据实验材料，变化提取体系，样品量范围广泛(0.1～10g)，特别适合大体积果实，选择大样品量(10g)提取，代表性好，后续实验重复性好。
本发明的方法提取果实总RNA的浓度可达5000ng/ul，后续反转录加入模板体系可控，不影响反转录效果；本发明提取果实总RNA的量较大(可≥500ug)，适合大量做荧光定量筛选候选基因，无需多次提取，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的番石榴果实RNA的高效提取方法流程图。
图2是本发明实施例提供的测量RNA浓度和电泳检测提取情况示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种番石榴果实RNA的高效提取方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的番石榴果实RNA的高效提取方法包括以下步骤：
S101，配制buffer A：将药品逐一加入溶解，定容，高温高压灭菌；
S102，配制总RNA提取液：使用bufferA配制；
S103，组织裂解：于液氮中，将果实组织研磨成粉末状后转入无菌高速圆底离心管，加入RNA提取液，另加蛋白酶K，剧烈混匀后轻微振荡提取；
S104，蛋白沉淀：加入2M KCl溶液，冰浴1h，中间混匀几次，高速离心；
S105，RNA沉淀：上清液转移到新的尖底离心管，加入LiCl，过夜沉淀RNA；离心后去除上清液，用LiCl溶液洗涤沉淀，直至沉淀为无色；
S106，RNA纯化：加入Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，并加入KOAc混合后在冰浴中保持30min；第一次离心，将上清液转移至干净离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，第二次离心，沉淀RNA；弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，离心并去除上层乙醇，真空干燥，用灭菌超纯水溶解RNA，保存备用。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
(1)配制buffer A，见表1，药品逐一加入溶解，最后定容，之后高温高压灭菌，4℃可保存半年。
表1
(2)接着配制总RNA提取液(使用buffer A配制)：见表2，现配现用，不用灭菌处理；
表2
(3)组织裂解：于液氮中，将xg(依据实验室离心机及实验材料，可选择三个重量档次的样品：0.1g至0.5g、0.5g至2.0g、2.0g至10.0g)果实组织研磨成粉末状后转入无菌高速圆底离心管(2ml、10ml、50ml)中，加入(1.5ml、5ml、20ml)经80℃预热的RNA提取液，并加入(0.2mg、0.6mg、2.2mg)的蛋白酶K，于42℃下保温并轻微振荡提取2h。
(4)蛋白沉淀：加入(0.18ml、0.6ml、2.4mL)KCl溶液(2M)于4℃下放置1h，每20min上下颠倒混匀一次，充分沉淀蛋白，以20000g(可降低至12000g)的转速离心30min。
(5)RNA沉淀：(1.5ml、6ml、21ml)上清液转移到新的尖底离心管(2ml、10ml、50mL)，加入1/3体积的8M LiCl，在4℃下过夜(12～15h)沉淀RNA。10000g离心30min后去除上清液(沉淀即为RNA的粗提液)，用2M LiCl溶液(1ml、2ml、4ml)洗涤沉淀2次，直至沉淀为无色。
(6)RNA纯化：加入(0.2ml、0.5ml、2mL)Tris-HCl(10mM，pH 7.5)缓冲液溶解沉淀，并加入(20ul、50ul、200ul)KOAc(2M)混合后在冰浴中保持30min，以去除RNA中的多聚糖和残留蛋白质。10000g离心15min，将上清液转移至干净(1.5ml、2ml、10mL)离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-80℃下放置0.5h后，10000g离心30min，沉淀RNA。弃上清液，用(1.0ml、1.0ml、4.0mL)70％乙醇洗涤沉淀，离心并尽量去除上层乙醇，真空干燥，用(50ul、100ul、200ul)灭菌超纯水溶解RNA，在-80℃冰箱中保存备用。
该方法可以根据实验室离心机的型号、果实的大小(样品量)来选择不同的体系来完成，效果稳定。
本发明能无视果实中富含的多糖、多酚以及色素，提取高质量的总RNA。
本发明提取样品量可根据实验材料，变化提取体系，样品量范围广泛(0.1～10g)，特别适合大体积果实，选择大样品量(10g)提取，代表性好，后续实验重复性好。
本发明提取果实总RNA的浓度可达5000ng/ul，后续反转录加入模板体系可控，不影响反转录效果。
本发明提取果实总RNA的量较大(可≥500ug)，适合大量做荧光定量筛选候选基因，无需多次提取，成本低。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
本实验同时提取4个样品番石榴果实总RNA
1.配制200ml buffer A：将药品逐一加入溶解，定容，高温高压灭菌后放4度冰箱保存；
2.配制总RNA提取液：每个样品需5ml，共配制30ml，使用buffer A配制；
3.组织裂解：于液氮中，使用研钵或研磨机将果实组织研磨成粉末状后转入10ml无菌高速圆底离心管，加入预热5ml RNA提取液和0.55mg蛋白酶K，剧烈混匀后，42℃，150rpm振荡提取2h；
4.蛋白沉淀：加入480ul 2MKCl溶液，冰浴放置1h，每20min混匀一次，4℃，12000g至20000g离心30min；
5.RNA沉淀：上清液转移到新的10ml圆底离心管，加入1/3体积8MLiCl，过夜沉淀RNA(约14h)；4℃，10000g离心30min后去除上清液，用2ml 2M LiCl溶液洗涤沉淀，直至沉淀为无色；
6.RNA纯化：加入0.4ml 10mMTris-HCl缓冲液溶解沉淀，并加入10ul 2M KOAc混合后在冰浴中保持30min；第一次离心，将上清液转移至干净离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，第二次离心，沉淀RNA；弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，离心并去除上层乙醇，真空干燥，用150ul灭菌超纯水溶解RNA，测量RNA浓度和电泳检测提取情况，如图2所示，-80℃冰箱保存备用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，所述番石榴果实RNA的高效提取方法包括以下步骤：
步骤一，配制bufferA：将药品逐一加入溶解，定容，高温高压灭菌；
步骤二，配制总RNA提取液：使用bufferA配制；
步骤三，组织裂解：于液氮中，将果实组织研磨成粉末状后转入无菌高速圆底离心管，加入RNA提取液，另加蛋白酶K，剧烈混匀后轻微振荡提取；
步骤四，蛋白沉淀：加入2M KCl溶液，冰浴1h，中间混匀几次，高速离心；
步骤五，RNA沉淀：上清液转移到新的尖底离心管，加入1/3体积的8M LiCl，在4℃下过夜沉淀RNA；离心后去除上清液，用2M LiCl溶液洗涤沉淀2次，直至沉淀为无色；
步骤六，RNA纯化：加入10mM Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，并加入2M KOAc混合后在冰浴中保持30min，去除RNA中的多聚糖和残留蛋白质；第一次离心，将上清液转移至干净离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，放置，第二次离心，沉淀RNA；弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，离心并去除上层乙醇，真空干燥，用灭菌超纯水溶解RNA，在-80℃冰箱中保存备用。
2.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤一中，所述bufferA置于4℃条件下可保存半年。
3.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤二中，所述总RNA提取液现配现用，无需灭菌处理。
4.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤三中，依据实验室离心机及实验材料，选择三个重量档次的样品：0.1g至0.5g、0.5g至2.0g、2.0g至10.0g。
5.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤三中，所述无菌高速圆底离心管的容积分别为2mL、10mL、50mL；所述RNA提取液为80℃预热的RNA提取液，分别为1.5mL、5mL、20mL；所述蛋白酶K分别为0.2mg、0.6mg、2.2mg。
6.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤三中，所述轻微振荡提取的方法为：于42℃条件下保温并轻微振荡提取2h。
7.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤四中，所述KCl溶液分别为0.18mL、0.6mL、2.4mL；于4℃下放置1h，每20min上下颠倒混匀一次，充分沉淀蛋白，以20000g的转速离心30min；其中，所述转速可降低至12000g。
8.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤五中，所述上清液分别为1.5mL、6mL、21mL，所述尖底离心管的容积分别为2mL、10mL、50mL，所述LiCl溶液分别为1mL、2mL、4mL；所述RNA沉淀时间为12～15h；10000g离心30min后去除上清液，沉淀即为RNA的粗提液。
9.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤六中，所述Tris-HCl分别为0.2mL、0.5mL、2mL，pH 7.5；所述KOAc分别为20uL、50uL、200uL，所述离心管的容积分别为1.5mL、2mL、10mL，所述70％乙醇分别为1.0mL、1.0mL、4.0mL，所述灭菌超纯水分别为50uL、100uL、200uL。
10.如权利要求1所述的番石榴果实RNA的高效提取方法，其特征在于，步骤六中，所述第一次离心条件为：10000g离心15min；在-80℃的条件下放置0.5h后进行第二次离心，所述第二次离心条件为：10000g离心30min。
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