CN111440788A - 一种铁皮石斛基因组dna的高效提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法。该方法优化了经典CTAB法中抽提缓冲液的配方、增加了一步果胶酶裂解并优化了提取工艺。对比于经典的CTAB法，本发明DNA提取方法中的抽提缓冲液处理过程可以较好地抑制酚的自发氧化并防止多酚氧化物引起的DNA褐变反应，促进多糖在高盐条件下与高浓度的CTAB结合从而利于抽提去除；果胶酶处理过程进一步溶解铁皮石斛中的难溶物质使得提取的DNA不再粘稠，也显著简化了后续DNA样本建库、测序的流程。本发明的提取方法显著提高了DNA提取效率和DNA纯度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法。
背景技术
铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)为兰科石斛属多年草本附生植物，是名贵中药西枫斗的原植物，具有养阴生津，温胃明目，润喉护嗓，补肾益力的功效，是养阴要药，唐代医学经典《道藏》中，其被誉为“中华九大仙草之首”，1987年被列入国家重点保护的濒危珍稀植物名录。铁皮石斛富含多糖等有效成分，现代医学研究表明其对咽喉疾病、心脑血管疾病、糖尿病、白内障等具有不错的疗效，还具有抗肿瘤，抗衰老，增强人体免疫力及抗炎等作用。
基因组DNA的提取是分子生物学实验很重要的一个环节。基因组DNA的质量和产量，直接影响分子生物实验中与DNA有关的后续实验的进行。由于不同植物体内次生代谢物及比例不同，它们可以与DNA结合形成复合物，因此，应根据所研究植物的不同情况需要进行实验，以获得高质量的DNA样品。经典的植物基因组的提取方法主要为CTAB法，而类似于石斛属这种含有多糖多酚等次生代谢产物的中草药植物，在对其DNA提取过程中，多酚类物质极易氧化，氧化后的产物与DNA分子发生不可逆结合，同时多糖又与DNA形成粘稠的胶状复合物，使提取的DNA样品不仅呈棕褐色难于溶解，而且也不易被限制性内切酶和TaqDNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的失败，以致使铁皮石斛的分子生物学研究进展缓慢。目前，在石斛的DNA提取方面很多人进行了研究，但大多是针对小量的提取，并且多糖去除也不够彻底。因此，如何寻求一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，该方法成本低、易操作、并最终获得高质量的基因组，方便后续的建库、上机以及PCR反应。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，包括：
(1)液氮研磨铁皮石斛叶片至粉末；
(2)向粉末中加入抽提缓冲液，混匀后60-70℃加热20-30min获得混合液a；所述抽提缓冲液配方为：100mMTris-HCl(pH8.0)、20mMEDTA、1.4M NaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇；
(3)向混合液a中加入果胶酶，30-40℃恒温孵育10-20min获得混合液b；
(4)向混合液b中加入酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液a；
(5)向上清液a加入氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液b；
(6)向上清液b中加入异丙醇，充分混匀后静置、离心获得沉淀a；
(7)乙醇清洗沉淀a获得铁皮石斛基因组DNA。
进一步地，控制每克铁皮石斛粉末加入6-10mL所述的抽提缓冲液。
进一步地，混合液a中加入果胶酶后，所述果胶酶的终浓度为30-50U/mg。
进一步地，所述步骤(4)加入的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液与混合液b等体积，所述酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
进一步地，所述步骤(4)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
进一步地，所述步骤(5)加入的氯仿和异戊醇的混合溶液与上清液a等体积，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
进一步地，所述步骤(5)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
进一步地，所述步骤(6)加入的异丙醇的体积为上清液b的0.6-1.0倍。
进一步地，所述步骤(6)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
进一步地，所述步骤(7)乙醇的体积浓度为75％。
常规的CTAB法进行铁皮石斛基因组DNA提取，因为原始样本中的杂质过多，导致提取的DNA粘稠，呈果胶状，电泳条带显示拖带。因此，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法对比于经典的CTAB法，其中的抽提缓冲液处理过程可以较好地抑制酚的自发氧化并防止多酚氧化物引起的DNA褐变反应，促进多糖在高盐条件下与高浓度的CTAB结合从而利于抽提去除；果胶酶处理过程进一步溶解铁皮石斛中的难溶物质使得提取的DNA不再粘稠，也显著简化了后续DNA样本建库、测序的流程。
大量实验表明，利用本发明的方法在裂解液中加入果胶酶处理后，提取的DNA不再粘稠，样本正常，提取过程也相对容易、高效，同时利于后续的建库上机等相关操作。
附图说明
图1为实施例1提取的铁皮石斛DNA琼脂糖电泳检测图。
图2为对比例提取的铁皮石斛DNA琼脂糖电泳检测图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，该方法包括如下步骤：
(1)取适量铁皮石斛叶片放入研钵中，利用液氮研磨成粉状，研磨结束后取1.0g粉末放入离心管中。
(2)向粉末中加入8mL抽提缓冲液，65℃水浴25min获得混合液a；其中抽提缓冲液配方为：100mMTris-HCl(pH8.0)、20mMEDTA、1.4MNaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇。
(3)向混合液a中加入果胶酶使其在混合液a中的终浓度为40U/mg，37℃恒温孵育10-20min获得混合液b。
(4)向混合液b中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后4℃、6000rpm离心10min获得上清液a；酚、氯仿和异戊醇体积比为25:24:1。
(5)向上清液a中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后4℃、6000rpm离心10min获得上清液b；氯仿和异戊醇体积比为24:1。
(6)向上清液b中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀后静置30min后，4℃、6000rpm离心10min获得沉淀a；
(7)用75％乙醇清洗沉淀a2次获得铁皮石斛基因组DNA。
制备的铁皮石斛基因组DNA无粘稠现象。取少量沉淀加入适量的10mM Tris-HCl(含RNaseA)溶解，取溶液进行琼脂糖凝胶色谱分析如图1所示。条带1为本实施例1提取的DNA对应的条带，带型清晰锐利，无明显拖尾，可见较好的去除了蛋白、多酚、多糖等杂质。
实施例2：
一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，该方法包括如下步骤：
(1)取适量石斛叶片放入研钵中，利用液氮研磨成粉状，研磨结束后取1.0g粉末放入离心管中。
(2)向粉末中加入6mL抽提缓冲液，70℃水浴20min获得混合液a；其中抽提缓冲液配方为：100mMTris-HCl(pH8.0)、20mMEDTA、1.4MNaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇。
(3)向混合液a中加入果胶酶(果胶酶在混合液a中的终浓度为30U/mg)，35℃恒温孵育10-20min获得混合液b。
(4)向混合液b中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后25℃、9000rpm离心8min获得上清液a；酚、氯仿和异戊醇体积比为25:24:1。
(5)向上清液a中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后25℃、9000rpm离心8min获得上清液b；氯仿和异戊醇体积比为24:1。
(6)向上清液b中加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀后静置30min后，25℃、9000rpm离心8min获得沉淀a；
(7)用75％乙醇清洗沉淀a2次获得铁皮石斛基因组DNA。
制备的铁皮石斛基因组DNA无粘稠现象。取少量沉淀加入适量的10mM Tris-HCl(含RNaseA)溶解，取溶液进行琼脂糖电泳检测。结果显示本实施例提取的DNA对应的条带，带型清晰锐利，无明显拖尾，可见较好的去除了蛋白、多酚、多糖等杂质。
实施例3：
一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，该方法包括如下步骤：
(1)取适量石斛叶片放入研钵中，利用液氮研磨成粉状，研磨结束后取1.0g粉末放入离心管中。
(2)向粉末中加入10mL抽提缓冲液，60℃水浴30min获得混合液a；其中抽提缓冲液配方为：100mMTris-HCl(pH8.0)、20mMEDTA、1.4MNaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇。
(3)向混合液a中加入果胶酶(果胶酶终在混合液a中的终浓度为50U/mg)，40℃恒温孵育10-20min获得混合液b。
(4)向混合液b中加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后37℃、12000rpm离心5min获得上清液a；酚、氯仿和异戊醇体积比为25:24:1。
(5)向上清液a中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后37℃、12000rpm离心5min获得上清液b；氯仿和异戊醇体积比为24:1。
(6)向上清液b中加入0.9倍体积的异丙醇，充分混匀后静置30min后，37℃、12000rpm离心5min获得沉淀a；
(7)用75％乙醇清洗沉淀a2次获得铁皮石斛基因组DNA。
制备的铁皮石斛基因组DNA无粘稠现象。取少量沉淀加入适量的10mM Tris-HCl(含RNaseA)溶解，取溶液进行琼脂糖电泳检测。结果显示本实施例提取的DNA对应的条带，带型清晰锐利，无明显拖尾，可见较好的去除了蛋白、多酚、多糖等杂质。
对比例：CTAB法提取铁皮石斛DNA
(1)2％CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。其中2％CTAB抽提缓冲溶液：CTAB4g、NaCl16.364g、1MTris-HCl20ml(PH8.0)、0.5MEDTA8ml，先用70mlddH2O溶解，再定容至200ml灭菌，冷却后加入0.2-1％β-巯基乙醇(400μL)摇匀即可。
(2)取少量叶片(约1g)置于研钵中，用液氮磨至粉状；
(3)加入700μL的2％CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
(4)将磨碎液倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二。
(5)置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出。
(6)冷却2min后，加入氯仿-异戊醇(24：1)至满管，剧烈振荡2～3min，使两者混合均匀。
(7)放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600μL的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
(8)10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
(9)10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
(10)60sec后，直立离心管，加入720μL的75％乙醇及80μLl5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
(11)放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；
(12)10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800μL75％的乙醇，将DNA再洗30min；
(13)10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或用风筒吹干)；
(14)加入50μL0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；
(15)置于-20℃保存、备用。
上述步骤(13)所获得的DNA粘稠，呈果胶状。取少量步骤(15)的DNA溶液进行琼脂糖电泳检测。结果(如图2所示)显示CTAB法提取的铁皮石斛DNA对应的条带有明显的拖带现象。
通过实施例与对比例的分析实验可知，针对铁皮石斛基因组DNA提取，本发明的方法相对于常规的CTAB法，提取的DNA不再粘稠，样本正常，提取过程也相对容易、高效，同时利于后续的建库上机等相关操作。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，包括：
(1)液氮研磨铁皮石斛叶片至粉末；
(2)向粉末中加入抽提缓冲液，混匀后60-70℃加热20-30min获得混合液a；所述抽提缓冲液配方为：100mMTris-HCl(pH8.0)、20mMEDTA、1.4MNaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇；
(3)向混合液a中加入果胶酶，30-40℃恒温孵育10-20min获得混合液b；
(4)向混合液b中加入酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液a；
(5)向上清液a加入氯仿和异戊醇的混合溶液，充分混匀后离心获得上清液b；
(6)向上清液b中加入异丙醇，充分混匀后静置、离心获得沉淀a；
(7)乙醇清洗沉淀a获得铁皮石斛基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，控制每克铁皮石斛粉末加入6-10mL所述的抽提缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，混合液a中加入果胶酶后，所述果胶酶的终浓度为30-50U/mg。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(4)加入的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液与混合液b等体积，所述酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(4)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(5)加入的氯仿和异戊醇的混合溶液与上清液a等体积，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
7.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(5)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
8.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(6)加入的异丙醇的体积为上清液b的0.6-1.0倍。
9.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(6)离心温度为4-37℃，6000-12000rpm离心5-10min。
10.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(7)乙醇的体积浓度为75％。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |