CN104212795A - 一种鱼类脑组织总rna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鱼类脑组织总RNA的提取方法，具体为：将鱼类脑组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，加入异丙醇-醋酸钠混合，混合液经RNA纯化吸附柱吸附纯化后，进行DNA酶处理，经洗涤而获得鱼类脑组织总RNA。本发明所述提取方法，可避免鱼脑组织中的脂类(磷脂、糖脂和胆固醇)和蛋白质等对RNA提取的影响，获得纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的RNA分离纯化方法。

Description

一种鱼类脑组织总RNA的提取方法

技术领域

本发明涉及鱼类总RNA的提取，具体地说，涉及一种鱼类脑组织总RNA的提取方法。

背景技术

总RNA分离纯化技术是分子生物学研究技术的基础，从组织中提取纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的总RNA的分离纯化方法，是决定后续实验结果质量的关键，一些特定的部位使用通用的RNA分离纯化方法，往往不能满足要求，需要相应的处理与提取制备方法。

鱼类脑组织结构类型基本相同，不同种类成分含量上略有差异，但大体上相近，主要成分是脂类(磷脂、糖脂、胆固醇)和蛋白质，采用常规RNA分离纯化方法，在抽提的过程中脂类不易去除，且易形成蛋白污染，鱼脑组织单位细胞RNA含量相对较少，采样和操作过程中极易造成RNA降解而使提取失败。诸多问题，使鱼类脑组织总RNA难以稳定的分离和纯化。

目前，有针对性的分离纯化鱼脑组织总RNA的方法较少，用传统方法提取的鱼脑组织总RNA含量少、稳定性差、容易污染，无法满足后续实验的要求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适用于鱼类脑组织总RNA的提取方法。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种鱼类脑组织总RNA的提取方法，具体为：将鱼类脑组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，加入异丙醇-醋酸钠混合，混合液经RNA纯化吸附柱吸附纯化后，进行DNA酶处理，经洗涤而获得鱼类脑组织总RNA。

进一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β-巯基乙醇和/或8-羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1.0-2.5％和0.10-0.15％。由于Trizol裂解液本身含有0.10％的8-羟基喹啉，因此也可不再加入8-羟基喹啉。但为了更好的抑制内源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等物质的干扰，在Trizol裂解液使用前加入0.05％8-羟基喹啉，使其在Trizol裂解液中的体积浓度达到0.15％。

进一步地，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为1/4 Trizol体积。

进一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1。

作为优选，所述硫酸铵的使用浓度为4mol/L。，

进一步地，经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1。

进一步地，所述吸附纯化具体为：将混合有异丙醇-醋酸钠的混合液加入RNA纯化吸附柱，离心后经乙醇离心洗脱除杂，再经RNase-free水离心洗脱得到纯化后的RNA溶液。

进一步地，DNA酶处理后，对DNA酶进行灭活。

进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：

1)取鱼脑组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存；

2)将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，匀浆后置于冰中，超声破碎，离心，取上清；

3)加入硫酸铵溶液，振荡摇匀，离心，取上清；

4)加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置，离心，取上清；

5)加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀；

6)吸取步骤5)得到的混合液至RNA纯化吸附柱中吸附，离心，弃废液；

7)向纯化吸附柱中加入预冷的乙醇，离心，弃废液；重复一次；

8)再次离心除杂弃废物后，将吸附柱晾干；

9)向吸附柱中加入RNase-free水，离心，弃吸附柱；

10)加入RNase-free DNase缓冲液、RNase-free DNA酶、RNA酶抑制剂和RNase-free水，处理40-50min，得到DNA酶处理液；

11)加入乙二胺四乙酸加热处理，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的无水乙醇，混匀后放置15-25min，离心，弃上清；

12)用预冷的乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液充分溶解，-80℃保存。

更进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：

1)用手术工具取60-80mg鱼脑组织，无菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速冻，-80℃超低温冻存；

2)将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8-10s，间隔15-20s，超声破碎8-10s，17000-19000g 4℃离心10min，取上清；

3)加入500μl 4mol/L硫酸铵溶液，振荡摇匀，5000-7000g 4℃离心3-5min，吸上清液至离心管B中；所述硫酸铵溶液的pH＝5.5；

4)加入氯仿和正丁醇混合液350-400μl，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1；

5)加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀-20℃放置60min；所述异丙醇-醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L，所述醋酸钠溶液的pH＝5.2；

6)吸取步骤5)得到的混合液700μl至RNA纯化吸附柱中，12000g4℃离心1min，倒掉收集管中废液；

7)向纯化吸附柱中加入500μl RNase-free 75％的已预冷乙醇，静置1min，12000g 4℃离心1min，倒掉收集管中废液；重复一次；

8)12000g 4℃离心2min，将吸附柱置于洁净RNase-free离心管中，室温封闭静置5-10min，晾干；

9)向吸附柱中加入20-22μL RNase-free水，室温封闭静置2min，12000g 4℃离心1min，弃吸附柱；

10)加入5μl的RNase-free DNase缓冲液、2μl的RNase-free DNA酶、1μl的RNA酶抑制剂和22μl RNase-free水，37℃处理40-50min，得到DNA酶处理液；

11)加入2.5μl浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78-82℃加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后-80℃放置15-25min，12000g 4℃离心10min，弃上清；

12)用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心5min，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液20-30μl充分溶解，-80℃保存。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种鱼类脑组织总RNA的提取方法，可避免鱼脑组织中的脂类(磷脂、糖脂和胆固醇)和蛋白质等对RNA提取的影响，获得纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的RNA分离纯化方法。

本发明通过在Trizol中加入2.5％的β-巯基乙醇和0.05％的8-羟基喹啉，可在裂解过程中有效抑制内源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等物质的干扰。Trizol中加入β-巯基乙醇和8-羟基喹啉，用来抑制RNA酶活性，本申请根据实验发现，在处理富含RNA酶的组织时，Trizol加入2.5％的β-巯基乙醇和0.05％的8-羟基喹啉协同作用效果最好，可有效的抑制内源性RNA酶，并有效排除核蛋白和色素等的干扰。

本发明将冷冻样本在Trizol中匀浆后，使用超声破碎进行处理，能够更好的裂解细胞，使RNA充分游离到液相中。液氮研磨法破碎样本，由于液氮极易挥发，研磨过程中要不断的向研钵中加入液氮，耗费时间长，操作不方便，有安全隐患，而对冻存样本进行电动匀浆，匀浆后再使用超声破碎，细胞破碎速度快，匀浆彻底，操作简单安全，缩短了处理时间，有效减少RNA的降解。

本发明在Trizol裂解液处理后，将离心力增加至17000-19000g，可有效沉降破碎细胞壁、杂质等。

本发明在Trizol处理液中加入4mol/L硫酸铵，可使蛋白脱水沉淀，有效去除提取过程中的蛋白污染。针对组织中蛋白含量较高，加入硫酸铵沉淀蛋白一次，硫酸铵沉淀蛋白的效率一般大于85％，降低蛋白对后续实验的影响，再进行氯仿正丁醇抽提，可以充分去除蛋白。

本发明使用氯仿与正丁醇混合液(24:1)，可提高蛋白、DNA和RNA的分离效果，保证RNA的纯度和完整性。常规提取过程中，抽提时使用氯仿或氯仿异戊醇混合物，使用量约为1/5 Trizol体积，改用氯仿与正丁醇混合物，比例为24:1，使用量增加至1/4体积可以有效提高处理效率，利于水相、蛋白相和有机相的分离，且异戊醇的毒性较大，改用正丁醇可降低毒性，保护操作人员。

本发明将常规方法中的异丙醇沉淀步骤改为使用异丙醇-醋酸钠混合液(异丙醇：醋酸钠＝4:1)沉淀，处理条件为-20℃放置60min，，沉淀RNA。在加入异丙醇同时加入醋酸钠，沉淀RNA的同时溶解多糖类物质，使它们有效分离。醋酸钠等高盐溶液可在提取过程中加入，用于去除多糖和析出RNA，一般加入的体积为10％，浓度一般为3mol/L(终浓度0.3mol/L)，处理条件一般为-20℃放置3小时，本申请根据实验发现在加入异丙醇阶段，醋酸钠加入量增加至20％且浓度降低至2mol/L(终浓度0.4mol/L)，处理条件为-20℃放置60min，可提高沉淀并溶解多糖类物质的效率，而DNA酶处理阶段醋酸钠浓度也增加至3.5mol/L，可有效析出RNA。

本发明使用RNA纯化吸附柱进行吸附和洗脱，可有效缩短提取时间，有效减少RNA的降解。

本发明利用纯化吸附柱处理混合液，RNA容易富集于吸附膜上，可有效的提高总RNA产量。传统方法中，异丙醇处理，离心后的沉淀为总RNA，本发明将异丙醇-醋酸钠处理液加入纯化吸附柱，离心后，RNA富集于吸附膜上，而残留的蛋白和脂肪等被有效的分离，从而达到纯化RNA的目的，同时提高了产量，且使用吸附柱时间短，可减少RNA的降解。

本发明采用75％乙醇清洗吸附膜，并在洗脱过程中将离心力增加至12000g，可提高清洗效果，有效去除残留的蛋白和脂肪。

本发明引入DNA酶处理步骤，在DNA处理前，已经通过氯仿正丁醇分离，可去掉部分DNA片段，但并不彻底，加入DNA酶处理步骤，将消化时间延长至40-50min，可提高DNA酶处理效率，更彻底的去除基因组DNA污染。DNA酶的失活使用78-82℃热处理3min，使DNA酶失活更加彻底，利于后续的分离与纯化，相对于氯仿抽提法，缩短了处理时间，有效减少RNA在纯化中的降解。

附图说明

图1为本发明所述方法提取的鱼类脑组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明所述方法提取的鱼类脑组织总RNA经反转录后，对β-actin基因进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1.用手术工具取60mg鱼脑组织，无菌RNase-free(无RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速冻，超低温(-80℃)冻存。

2.将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8s，间隔15s，超声破碎8s，17000g 4℃离心10min，吸上清至离心管A中。

注：Trizol裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司)，Trizol裂解液使用前加入25μlβ-巯基乙醇和0.5μl的8-羟基喹啉。

3.向离心管A中加入500μl 4mol/L硫酸铵(PH5.5)，振荡摇匀，5000g 4℃离心3min，吸上清液至离心管B中。

4.向离心管B中加入氯仿和正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝24:1)350μl(混合液体积的1/4)，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，吸取上清液至离心管C中。

5.向离心管C中加入上清等体积的异丙醇醋酸钠混合液(异丙醇：醋酸钠＝4:1，醋酸钠浓度2mol/L)，振荡摇匀-20℃放置60min。

6.吸取混合液700μl至RNA纯化吸附柱中(EZ-10 Spin Column总RNA纯化吸附柱，吸附柱置于废液收集管中，B.B.I公司)，12000g4℃离心1min，倒掉收集管中废液。

7.向纯化吸附柱中加入500μl RNase-free 75％的已预冷乙醇，静置1min，12000g 4℃离心1min，倒掉收集管中废液。

8.重复上述步骤，向纯化吸附柱中加入500μl RNase-free 75％的已预冷乙醇，静置1min，12000g 4℃离心1min，倒掉收集管中废液。

9.12000g 4℃离心2min，将吸附柱置于RNase-free离心管D中，室温封闭静置5-10min，晾干。

10.向吸附柱中加入20μL RNase-free水，室温封闭静置2min，12000g 4℃离心1min，弃吸附柱。

11.向离心管D中加入5μl的RNase-free DNase缓冲液(10×DNaseI Buffer，宝生物公司)、2μl的RNase-free DNA酶(5U/μl RNase-freeRecombinant DNase I，宝生物公司)、1μl的RNA酶抑制剂(40U/μlRecombinant RNase Inhibitor，宝生物公司)和22μl RNase-free水，37℃处理40-50min，得到DNA酶处理液。

12.向DNA酶处理液中加入2.5μl浓度为0.5 mol/L EDTA，混匀78℃加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L RNase-free醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后-80℃放置15-25min，12000g 4℃离心10min，弃上清。

13.用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心10min，弃上清，室温封闭静置5min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液20μl充分溶解，-80℃保存。

实施例2

1.用手术工具取80mg鱼脑组织，无菌RNase-free(无RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速冻，超低温(-80℃)冻存。

2.将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎10s，间隔20s，超声破碎10s，19000g 4℃离心10min，吸上清至离心管A中。

注：Trizol裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司)，Trizol裂解液使用前加入25μlβ-巯基乙醇和0.5μl的8-羟基喹啉。

3.向离心管A中加入500μl 4mol/L硫酸铵(PH5.5)，振荡摇匀，7000g 4℃离心5min，吸上清液至离心管B中。

4.向离心管B中加入氯仿和正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝24:1)400μl(混合液体积的1/4)，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，吸取上清液至离心管C中。

5.向离心管C中加入上清等体积的异丙醇醋酸钠混合液(异丙醇：醋酸钠＝4:1，醋酸钠浓度2mol/L)，振荡摇匀-20℃放置60min。

6.吸取混合液700μl至RNA纯化吸附柱中(EZ-10 Spin Column总RNA纯化吸附柱，吸附柱置于废液收集管中，B.B.I公司)，12000g4℃离心1min，倒掉收集管中废液。

7.向纯化吸附柱中加入500μl RNase-free 75％的已预冷乙醇，静置1min，12000g 4℃离心1min，倒掉收集管中废液。

8.重复上述步骤，向纯化吸附柱中加入500μl RNase-free 75％的已预冷乙醇，静置1min，12000g 4℃离心1min，倒掉收集管中废液。

9.12000g 4℃离心2min，将吸附柱置于RNase-free离心管D中，室温封闭静置10min，晾干。

10.向吸附柱中加入22μL RNase-free水，室温封闭静置2min，12000g 4℃离心1min，弃吸附柱。

11.向离心管D中加入5μl的RNase-free DNase缓冲液(10×DNaseI Buffer，宝生物公司)、2μl的RNase-free DNA酶(5U/μl RNase-freeRecombinant DNase I，宝生物公司)、1μl的RNA酶抑制剂(40U/μlRecombinant RNase Inhibitor，宝生物公司)和22μl RNase-free水，37℃处理40-50min，得到DNA酶处理液。

12.向DNA酶处理液中加入2.5μl浓度为0.5 mol/L EDTA，混匀82℃加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L RNase-free醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后-80℃放置15-25min，12000g 4℃离心10min，弃上清。

13.用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心10min，弃上清，室温封闭静置10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液30μl充分溶解，-80℃保存。

本发明提取并纯化获得的鱼脑组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，28s条带亮度是18s亮度的二倍，同时测得的鱼脑总RNA浓度为200-300ng/μl，同时吸光度OD260/OD280的比值稳定在1.8-2.0之间，说明获得的总RNA纯度高、完整性佳、无DNA和蛋白污染。

本发明提取后的鱼脑组织总RNA经反转录后，对β-actin基因进行了PCR扩增，琼脂糖电泳凝胶检测结果如图2：电泳条带完整、清晰、特异性好，说明此总RNA能满足后续的RT-PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、体外翻译和分子克隆等多种下游实验。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种鱼类脑组织总RNA的提取方法，其特征在于，将鱼类脑组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，加入异丙醇-醋酸钠混合，混合液经RNA纯化吸附柱吸附纯化后，进行DNA酶处理，经洗涤而获得鱼类脑组织总RNA。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Trizol裂解液使用前加入β-巯基乙醇和8-羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1.0-2.5％和0.10-0.15％。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为1/4 Trizol体积。

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1。

5.根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述硫酸铵的使用浓度为4mol/L。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1。

7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述吸附纯化为：将混合有异丙醇-醋酸钠的混合液加入RNA纯化吸附柱，离心后经乙醇离心洗脱除杂，再经RNase-free水离心洗脱得到纯化后的RNA溶液。

8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，DNA酶处理后，对DNA酶进行灭活。

9.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取鱼脑组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存；

2)将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，匀浆后置于冰中，超声破碎，离心，取上清；

3)加入硫酸铵溶液，振荡摇匀，离心，取上清；

4)加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置，离心，取上清；

5)加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀；

6)吸取步骤5)得到的混合液至RNA纯化吸附柱中吸附，离心，弃废液；

7)向纯化吸附柱中加入预冷的乙醇，离心，弃废液；重复一次；

8)再次离心除杂弃废物后，将吸附柱晾干；

9)向吸附柱中加入RNase-free水，离心，弃吸附柱；

10)加入RNase-free DNase缓冲液、RNase-free DNA酶、RNA酶抑制剂和RNase-free水，处理40-50min，得到DNA酶处理液；

11)加入乙二胺四乙酸加热处理，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的无水乙醇，混匀后放置15-25min，离心，弃上清；

12)用预冷的乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液充分溶解，-80℃保存。

10.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用手术工具取60-80mg鱼脑组织，无菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速冻，-80℃超低温冻存；

2)将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8-10s，间隔15-20s，超声破碎8-10s，17000-19000g 4℃离心10min，取上清；

3)加入500μl 4mol/L硫酸铵溶液，振荡摇匀，5000-7000g 4℃离心3-5min，吸上清液至离心管B中；所述硫酸铵溶液的pH＝5.5；

4)加入氯仿和正丁醇混合液350-400μl，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1；

5)加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀-20℃放置60min；所述异丙醇-醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L，所述醋酸钠溶液的pH＝5.2；

6)吸取步骤5)得到的混合液700μl至RNA纯化吸附柱中，12000g4℃离心1min，倒掉收集管中废液；

7)向纯化吸附柱中加入500μl RNase-free 75％的已预冷乙醇，静置1min，12000g 4℃离心1min，倒掉收集管中废液；重复一次；

8)12000g 4℃离心2min，将吸附柱置于洁净RNase-free离心管中，室温封闭静置5-10min，晾干；

9)向吸附柱中加入20-22μL RNase-free水，室温封闭静置2min，12000g 4℃离心1min，弃吸附柱；

10)加入5μl的RNase-free DNase缓冲液、2μl的RNase-free DNA酶、1μl的RNA酶抑制剂和22μl RNase-free水，37℃处理40-50min，得到DNA酶处理液；

11)加入2.5μl浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78-82℃加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后-80℃放置15-25min，12000g 4℃离心10min，弃上清；

12)用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心5min，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液20-30μl充分溶解，-80℃保存。