CN106636075B - 一种铁皮石斛基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种铁皮石斛基因组DNA的提取方法，该方法包括步骤：（1）粉碎铁皮石斛叶片；（2）制备铁皮石斛DNA提取试剂，所述提取试剂的配方为：100mM Tris‑Hcl、15mM EDTA、0.7M Nacl、3%(W/V)CATB、0.4%（W/V）抗坏血酸、0.1~0.3%（V/V）β‑巯基乙醇；上述组分的溶液为水；再加入氯仿和异戊醇混合溶液，其中氯仿与异戊醇的体积比为1:1；所述混合溶液的加入体积占提取试剂总体积的1/2；（3）将步骤（1）所得物加入步骤（2）所得提取试剂中，在0~4℃下静置20~40分钟，离心，然后用乙醇水溶液进行沉淀，即得DNA。本发明用时非常少，DNA纯度高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种铁皮石斛基因组DNA的提取方法。
背景技术
目前，对于植物DNA的提取，有很多方法，主要为CTAB和SDS法。然而，由于石斛类植物中有高含量的多糖和多酚和其它可用影响DNA提取分离的成分，使得一般的提取方法难以适应铁皮石斛DNA的提取难以获得很好的效果。
《石斛属植物基因组 DNA 提取方法的对比》对现有的CTAB和SDS进行了验证，上述方法均不能获得较好的DNA提取质量。该研究对CTAB和SDS法进行了改进，主要的改进点在于提高氯化钠和β-巯基乙醇的浓度，不过，其同样无法解决现有技术的一个难题：即提取过程需要水浴加热和后续纯化除杂问题。上述问题使得DNA的提取工作十分耗时。更为重要的是，纯化步骤若操作不当，更会容易影响DNA的提取质量。
因此，如何寻求一种无须加热同时能最大化节省纯化时间的铁皮石斛的DNA提取方法，是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的技术缺点，本发明的目的在于提供一种铁皮石斛基因组DNA的提取方法，该方法包括如下步骤：
（1）粉碎铁皮石斛叶片；
（2）制备铁皮石斛DNA提取试剂，所述提取试剂的配方为：
100mM Tris-Hcl、15mM EDTA、0.7M Nacl、3%(W/V) CATB、0.4%（W/V）抗坏血酸、0.1~0.3%（V/V）β-巯基乙醇；
上述组分的溶液为水；
再加入氯仿和异戊醇混合溶液，其中氯仿与异戊醇的体积比为1:1；所述混合溶液的加入体积占提取试剂总体积的1/2；
（3）将步骤（1）所得物加入步骤（2）所得提取试剂中，在0~4℃下静置20~40分钟，离心，然后用乙醇水溶液进行沉淀，即得DNA。
一般而言，利用CTAB的提取液进行提取后，需要进行纯化处理。本发明直接将氯仿和异戊醇与提取液混合，组成提取试剂，直接用于铁皮石斛的DNA提取；省去了常规方法的水浴加热步骤，直接在冰浴（0~4℃）下静置，便实现了DNA的高纯度提取。
可以理解的是，本发明至少比常规方法节约了1个小时以上的提取时间，而且步骤十分的简单。
优选的，β-巯基乙醇的浓度为0.2%（V/V）。
所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为70~95%。优选的，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为75%。
优选的，所述静置时间为30分钟。
本发明的优点：
1、相对于常规的方法，本发明的处理时间非常的短，整个过程不到一个小时，无需后续的除杂操作步骤，直接可以得到高纯度的DNA。
2、本发明无需加热过程，仅仅需要在0~4℃（普通冰箱冷藏室或冰上）下便可进行，十分的方便。
附图说明
图1为本发明实施例1-3的电泳结果图，其中，泳道1位实施例1所得DNA，泳道2位实施例2所得DNA，泳道3为实施例3所得DNA。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
（1）粉碎铁皮石斛叶片，然后磨成粉末；
（2）制备铁皮石斛DNA提取试剂，所述提取试剂的配方为：
100mM Tris-Hcl、15mM EDTA、0.7M Nacl、3%(W/V) CATB、0.4%（W/V）抗坏血酸、0.1%（V/V）β-巯基乙醇；
上述组分的溶液为水；
再加入氯仿和异戊醇混合溶液，其中氯仿与异戊醇的体积比为1:1；所述混合溶液的加入体积占提取试剂总体积的1/2；
（3）将步骤（1）所得物加入步骤（2）所得提取试剂中，在0~4℃下静置40分钟，离心，然后用乙醇水溶液进行沉淀，即得DNA。
实施例2
（1）粉碎铁皮石斛叶片，然后磨成粉末；
（2）制备铁皮石斛DNA提取试剂，所述提取试剂的配方为：
100mM Tris-Hcl、15mM EDTA、0.7M Nacl、3%(W/V) CATB、0.4%（W/V）抗坏血酸、02%（V/V）β-巯基乙醇；
上述组分的溶液为水；
再加入氯仿和异戊醇混合溶液，其中氯仿与异戊醇的体积比为1:1；所述混合溶液的加入体积占提取试剂总体积的1/2；
（3）将步骤（1）所得物加入步骤（2）所得提取试剂中，在0~4℃下静置30分钟，离心，然后用乙醇水溶液进行沉淀，即得DNA。
实施例3
（1）粉碎铁皮石斛叶片，然后磨成粉末；
（2）制备铁皮石斛DNA提取试剂，所述提取试剂的配方为：
100mM Tris-Hcl、15mM EDTA、0.7M Nacl、3%(W/V) CATB、0.4%（W/V）抗坏血酸、0.3%（V/V）β-巯基乙醇；
上述组分的溶液为水；
再加入氯仿和异戊醇混合溶液，其中氯仿与异戊醇的体积比为1:1；所述混合溶液的加入体积占提取试剂总体积的1/2；
（3）将步骤（1）所得物加入步骤（2）所得提取试剂中，在0~4℃下静置20分钟，离心，然后用乙醇水溶液进行沉淀，即得DNA。
实施例1-3的结果为：
实施例1-3所得DNA的A260/A280的比值分别为1.87、1.90和1.88，纯度都非常高。
实施例1-3的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，条带清晰明亮，未见拖尾。
Claims (4)
1.一种铁皮石斛基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述方法为以下步骤：
(1)粉碎铁皮石斛叶片；
(2)制备铁皮石斛DNA提取试剂，所述提取试剂的配方为：
100mM Tris-Hcl、15mM EDTA、0.7M Nacl、质量浓度为3％的CATB、质量浓度为0.4％的抗坏血酸、体积分数为0.1～0.3％的β-巯基乙醇；
上述组分的溶液为水；
再加入氯仿和异戊醇混合溶液，其中氯仿与异戊醇的体积比为1:1；所述混合溶液的加入体积占提取试剂总体积的1/2；
将步骤(1)所得物加入步骤(2)所得提取试剂中，在0～4℃下静置20～40分钟，离心，然后用乙醇水溶液进行沉淀，即得DNA；所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为70～95％。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，β-巯基乙醇的体积浓度为0.2％。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为75％。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述静置时间为30分钟。
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