CN111205179B - 一种从三角褐指藻中综合提取epa和岩藻黄素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，涉及生物活性成分提取技术领域。其提取方法为：首先将三角褐指藻发酵液进行离心，收集藻泥，向藻泥中加入缓冲溶液和复合酶，反应获得酶解液；然后将酶解液进行离心、破乳处理；将所得毛油进行超临界CO2纯化法获得EPA和废油；向废油中加入有机溶剂混合后，接着加入抗氧化剂，再向其中加入碎片藻泥，进行超声萃取，之后离心得岩藻黄素萃取液；利用凝胶色谱去除岩藻黄素萃取液中的组分，得岩藻黄素粗液；将岩藻黄素粗液经旋转蒸发得岩藻黄素粗粉，然后通过超临界CO2纯化法获得岩藻黄素。本发明极大的提高了微藻原料的利用率，同时具有方法简便、收率高等特点。

Description

一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法
技术领域
本发明涉及生物活性成分提取技术领域，具体涉及一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法。
背景技术
EPA即二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid)，具有促进细胞代谢，降低胆固醇、缓解关节炎及预防和治疗心脑血管疾病等多种生理功能。天然EPA的来源主要是鱼油和微藻，其中微藻因其含油量高，生长周期短、繁殖快，光能利用率高的特点，日益成为EPA的主要来源。微藻中EPA的提取大致分为细胞破坏、总酯提取和进一步纯化三个阶段，目前通常采用机械法、化学法和水酶法进行细胞破坏。其中水酶法具有设备简单，操作简便安全，效率高的特点。岩藻黄素(Fucoxanthin)也被称为褐藻黄素、岩藻黄素，是类胡萝卜素中叶黄素类的一种天然脂溶性色素，颜色呈淡黄至褐色，是褐藻、硅藻、金藻及黄绿藻所含有的色素。多项研究表明，岩藻黄素具有抗肿瘤、抗氧化、神经细胞保护及减肥等作用。岩藻黄质的提取多采用有机溶剂萃取，超临界CO2萃取、超声波辅助提取及酶提法等方法。
三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一种属硅藻门单细胞海洋微藻，具有卵形，梭形，和三出放射形三种不同的形态，这三种形态在不同的环境条件下可以转变。如在正常的液体培养的条件下，多是三出放射形细胞和少量的梭形细胞，这两种形态都没有硅质的细胞壁。三角褐指藻性状稳定，繁殖速度快，适合大规模培养，细胞内具有多种生物活性成分，包括多不饱和脂肪酸(PUFA)、岩藻黄质和多糖等，其中多不饱和脂肪酸中的EPA占总脂肪酸含量的30％以上，具有很高的经济利用价值。目前对于微藻生物活性成分的提取利用，多采用提取单独活性物质的方法，提取效率和微藻原料的利用率都有待进一步提高，从而造成成产成本普遍偏高，难以实现微藻经济价值的最大化，从一定程度上制约了微藻规模化产业的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，该方法通过复合酶解、超临界CO2萃取获得高纯度EPA；通过有机溶剂将废藻油及碎片藻泥中岩藻黄素萃取出来，进而利用凝胶色谱、超临界CO2萃取分离纯化岩藻黄素。
一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，依次包括以下步骤：
a、将三角褐指藻发酵液进行离心，收集藻泥，向所述藻泥中加入缓冲溶液和复合酶，反应获得酶解液；
b、将所述的酶解液进行离心、破乳处理，分别得到毛油、水相和碎片藻泥；
c、将所述的毛油进行超临界CO2纯化法获得EPA和废油；
d、向所述的废油中加入有机溶剂混合后，接着加入抗氧化剂，再向其中加入步骤b所述的碎片藻泥，进行超声萃取，之后离心得岩藻黄素萃取液；
e、利用凝胶色谱去除所述岩藻黄素萃取液中的油脂、有机磷、重金属后，得岩藻黄素粗液；
f、将所述的岩藻黄素粗液经旋转蒸发得岩藻黄素粗粉，然后通过超临界CO2纯化法获得岩藻黄素。
作为本发明的一个优选方案，步骤a中，所述的复合酶为壳聚糖酶、溶菌酶、果糖酶、纤维素酶、碱性蛋白酶或胰蛋白酶中的一种或多种，每种酶的添加量为所述藻泥重量的0.5～2.0％；控制酶解温度为20～35℃，酶解0.5～1.2h；加入缓冲液的pH为6.0～7.5。
作为本发明的另一个优选方案，步骤b中，离心处理的转速控制为4500～5000rpm，离心时间为10～20min；破乳处理中破乳剂选择吐温80、十二烷基磺酸钠或异丙醇的一种或多种。
进一步的，步骤c中，超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油质量的5～8％，提取温度35～40℃，压力15～30MPa，提取时间30～45min。
进一步优选，步骤d中，所述有机溶剂为乙酸乙酯-环己烷或正己烷，乙酸乙酯与环己烷或正己烷的体积配比为1:1～1.5，废油与有机溶剂的体积比为1:3～5。
进一步优选，步骤d中，所述的抗氧化剂为维生素C或茶多酚的一种或两种。
进一步的，步骤e中，利用凝胶色谱所采用的洗脱液为乙酸乙酯-环己烷或正己烷，其中，乙酸乙酯与环己烷或正己烷的体积配比为1:1～1.5，采用减压方式控制流速8～12mL/min。
进一步的，步骤f中，旋转蒸发温度为30℃，抽真空；超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油质量的5～10％，提取温度30～45℃，压力40～45MPa，提取时间2～3h。
进一步的，步骤a反应获得酶解液后继续超声提取，超声提取频率为40KHz，提取时间为0.5～1.0h。
与现有技术相比，本发明带来了以下有益技术效果：
(1)本发明利用凝胶色谱将脂溶性色素(岩藻黄素)从油脂中分离开来，并有效的去除油脂中的多种杂质，具有分离方法简单、分离效率高的特点。
(2)本发明通过复合酶法、超临界CO2萃取方法，添加抗氧化剂、低温处理等手段，有效的避免了EPA、岩藻黄素在分离纯化过程中变质，保证其良好的生物活性及后续使用的有效性。
(3)本发明通过对废藻油的再利用、采用有限有机溶剂且可通过旋转蒸发的方式进行回收再利用，有效的避免了微藻生物活性物质提取过程中的环境污染，是有效的绿色生产方案。
(4)本发明提供了一种简单有效的从微藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，有效的提高了微藻原料的利用率，降低了生产成本，潜在的推动微藻规模化产业的发展。
本发明方法极大的提高了微藻原料的利用率，同时具有方法简便、收率高、可有效保持EPA、岩藻黄素生物活性等特点。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步说明：
图1为本发明提取工艺流程图。
具体实施方式
本发明提出了一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
本发明中述及的三角褐指藻具有卵形，梭形，和三出放射形三种不同的形态。
本发明中所需原料均可通过商业渠道购买获得。
实施例1：
从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，包括以下步骤：
第一步，将三角褐指藻发酵液进行离心收集藻泥，蒸馏水清洗后离心，加入pH7.5磷酸盐缓冲溶液及壳聚糖酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，壳聚糖酶的添加量为藻泥重量的1.8％，碱性蛋白酶为0.7％，胰蛋白酶为1.0％；酶解温度为35℃，酶解1.0h得酶解液，后继续超声0.5h提取；
第二步，将酶解液在4500rpm离心10min得到游离油和乳浊液，破乳二次离心，破乳剂选择为吐温-80，合并油相得毛油；收集碎片藻泥；
第三步，将毛油通过超临界CO2纯化法获得EPA，超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油量8％，提取温度40℃，压力30MPa,提取时间45min；
第四步，将第三步剩余废油与已冰浴的有机溶剂乙酸乙酯-环己烷(1:1，v/v)混合，废油与有机溶剂的体积比为1:3，v/v，并加入抗氧化剂维生素C，加入第二步中的碎片藻泥中超声萃取，后离心得岩藻黄素萃取液；
第五步，利用凝胶色谱，去除第四步中萃取液中的油脂、有机磷、重金属等，获得色素粗液，凝胶采用SX-3,200～400mesh；洗脱液为已冰浴的乙酸乙酯-环己烷或正己烷(1:1，v/v)；采用减压方式控制流速8mL/min。；
第六步，将色素粗液30℃旋转蒸发得岩藻黄素粗粉，继续通过超临界CO2纯化法获得纯化岩藻黄素，超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油量10％，提取温度45℃，压力45MPa,提取时间3h。
实施例2：
从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，包括以下步骤：
第一步，将三角褐指藻发酵液进行离心收集藻泥，蒸馏水清洗后离心，加入pH7.5磷酸盐缓冲溶液及壳聚糖酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，壳聚糖酶的添加量为藻泥重量的1.8％，碱性蛋白酶为0.7％，胰蛋白酶为1.0％；酶解温度为20℃，酶解1.2h得酶解液，后继续超声0.5h提取；
第二步，将酶解液在4500rpm离心10min得到游离油和乳浊液，破乳二次离心，破乳剂选择为十二烷基磺酸钠，合并油相得毛油；收集碎片藻泥；
第三步，将毛油通过超临界CO2纯化法获得EPA，超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油量5％，提取温度35℃，压力30MPa,提取时间45min；
第四步，将第三步剩余废油与已冰浴的有机溶剂乙酸乙酯-环己烷(1:1，v/v)混合，废油与有机溶剂的体积比为1:3，v/v，并加入抗氧化剂维生素C，加入第二步中的碎片藻泥中超声萃取，后离心得岩藻黄素萃取液；
第五步，利用凝胶色谱，去除第四步中萃取液中的油脂、有机磷、重金属等，获得色素粗液，凝胶采用SX-3,200～400mesh；洗脱液为已冰浴的乙酸乙酯-环己烷或正己烷(1:1，v/v)；采用减压方式控制流速8mL/min。；
第六步，将色素粗液30℃旋转蒸发得岩藻黄素粗粉，继续通过超临界CO2纯化法获得纯化岩藻黄素，超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油量5％，提取温度30℃，压力45MPa，提取时间2h。
实施例3：
从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，包括以下步骤：
第一步，将三角褐指藻发酵液进行离心收集藻泥，蒸馏水清洗后离心，加入pH7.5磷酸盐缓冲溶液及壳聚糖酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，壳聚糖酶的添加量为藻泥重量的2％，碱性蛋白酶为0.7％，胰蛋白酶为1.0％；酶解温度为35℃，酶解1.0h得酶解液，后继续超声0.5h提取；
第二步，将酶解液在4500rpm离心10min得到游离油和乳浊液，破乳二次离心，破乳剂选择为异丙醇，合并油相得毛油；收集碎片藻泥；
第三步，将毛油通过超临界CO2纯化法获得EPA，超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油量8％，提取温度40℃，压力30MPa,提取时间45min；
第四步，将第三步剩余废油与已冰浴的有机溶剂乙酸乙酯-环己烷(1:1，v/v)混合，废油与有机溶剂的体积比为1:3，v/v，并加入抗氧化剂维生素C，加入第二步中的碎片藻泥中超声萃取，后离心得岩藻黄素萃取液；
第五步，利用凝胶色谱，去除第四步中萃取液中的油脂、有机磷、重金属等，获得色素粗液，凝胶采用SX-3,200～400mesh；洗脱液为已冰浴的乙酸乙酯-环己烷或正己烷(1:1，v/v)；采用减压方式控制流速8mL/min。；
第六步，将色素粗液30℃旋转蒸发得岩藻黄素粗粉，继续通过超临界CO2纯化法获得纯化岩藻黄素，超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油量10％，提取温度45℃，压力45MPa,提取时间3h。
本发明未述及的部分借鉴现有技术即可实现。
需要说明的是：在本说明的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式，或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
a、将三角褐指藻发酵液进行离心，收集藻泥，向所述藻泥中加入缓冲溶液和复合酶，反应获得酶解液；
b、将所述的酶解液进行离心、破乳处理，分别得到毛油、水相和碎片藻泥；
c、将所述的毛油进行超临界CO2纯化法获得EPA和废油；
d、向所述的废油中加入有机溶剂混合后，接着加入抗氧化剂，再向其中加入步骤b所述的碎片藻泥，进行超声萃取，之后离心得岩藻黄素萃取液；
e、利用凝胶色谱去除所述岩藻黄素萃取液中的油脂、有机磷、重金属后，得岩藻黄素粗液；
f、将所述的岩藻黄素粗液经旋转蒸发得岩藻黄素粗粉，然后通过超临界CO2纯化法获得岩藻黄素；
步骤a中，所述的复合酶由壳聚糖酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶三种酶组成。
2.根据权利要求1所述的一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于：步骤a中，所述的复合酶中每种酶的添加量为藻泥重量的0.5～2.0％；控制酶解温度为20～35℃，酶解0.5～1.2h；加入缓冲液的pH为6.0～7.5。
3.根据权利要求1所述的一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于：步骤b中，离心处理的转速控制为4500～5000rpm，离心时间为10～20min；破乳处理中破乳剂选择吐温80、十二烷基磺酸钠或异丙醇的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于：步骤c中，超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油质量的5～8％，提取温度35～40℃，压力15～30MPa，提取时间30～45min。
5.根据权利要求1所述的一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于：步骤d中，所述有机溶剂为乙酸乙酯-环己烷或正己烷，乙酸乙酯与环己烷或正己烷的体积配比为1:1～1.5，废油与有机溶剂的体积比为1:3～5。
6.根据权利要求1所述的一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于：步骤d中，所述的抗氧化剂为维生素C或茶多酚的一种或两种。
7.根据权利要求1所述的一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于：步骤e中，利用凝胶色谱所采用的洗脱液为乙酸乙酯-环己烷或正己烷，其中，乙酸乙酯与环己烷或正己烷的体积配比为1:1～1.5，采用减压方式控制流速8～12mL/min。
8.根据权利要求1所述的一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于：步骤f中，旋转蒸发温度为30℃，抽真空；超临界CO2纯化条件为：改性剂为乙醇，加入量为毛油质量的5～10％，提取温度30～45℃，压力40～45MPa，提取时间2～3h。
9.根据权利要求1所述的一种从三角褐指藻中综合提取EPA和岩藻黄素的方法，其特征在于：步骤a反应获得酶解液后继续超声提取，超声提取频率为40KHz，提取时间为0.5～1.0h。
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