CN108821965B - 一种复合酶法提取微拟球藻中epa的方法 - Google Patents

一种复合酶法提取微拟球藻中epa的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合酶法提取微拟球藻中EPA的方法，该方法包括：将微拟球藻发酵液进行离心，收集藻泥；向藻泥中加入一定量的缓冲溶液，接着加入复合酶，反应获得酶解液；将酶解液离心处理，得到第一游离油和乳状液，将乳状液进一步破乳离心得到第二游离油，将第一游离油和第二游离油合并得毛油；将所得毛油经过超临界C02纯化法进一步纯化获得EPA。本发明通过复合酶处理微拟球藻，在一定的反应条件下，酶解破坏微藻细胞结构，同时加强对脂多糖和脂蛋白等复合体的降解作用，增加油脂流动性，使油脂游离出来。本发明EPA的提取纯度在95％以上。

Description

一种复合酶法提取微拟球藻中EPA的方法
技术领域
本发明涉及生物提取技术领域，具体涉及一种复合酶法提取微拟球藻中EPA的方法。
背景技术
EPA即二十碳五烯酸(Eicosapntemacnioc Acid)，其具有促进细胞代谢，降低胆固醇、缓解关节炎及预防和治疗心脑血管疾病等多种生理功能，在人类保健和新兴制药行业广泛应用。天然的EPA以往主要在鱼油中获取，但鱼油成分较为复杂，从而很难提取到较高纯度的EPA，导致了难以发挥其功效；并且由于世界范围内的鱼类资源的减少，由鱼油中提取EPA已无法满足日益增加的市场需求。
微拟球藻(Nannochloropsis sp.)是一种海洋单细胞微藻，其藻细胞较小，直径为2～4μm。其细胞壁成分主要为壳聚糖、几丁质和果胶质，壁质坚韧。微拟球藻具有生长速度快，光合效率高、油脂含量高、EPA占比高等优点，总脂占干重68％以上，其中EPA占总脂肪酸含量的20～40％。微拟球藻在应对全球燃料能源危机及天然EPA生产中凸显价值，成为一种极具开发价值的优良藻种。
微拟球藻中油脂及EPA存在于微藻胞内，其提取方法大致分为为细胞破碎、总脂提取、-进一步纯化EPA三个阶段。采用机械法、化学法、水酶法等方法使细胞破碎可有效提高提取效率。机械法包括高压匀浆法、超声法、微波法等，这些方法耗能较高，且由于藻细胞较小，细胞壁结构复杂，破壁难度较大，对微藻油脂的提取效率偏低。超声法及微波法对于油脂成分的破坏还有待进一步考察。化学法主要采取无机酸处理法，如硫酸、盐酸等，存在无机酸用量大，难回收，对设备腐蚀等缺点，并且含酸废水排放还会污染环境。微藻油脂通常以脂多糖和脂蛋白等复合体的形式存在，水酶法采用对微藻细胞组织以及脂多糖、脂蛋白等复合体的具有降解作用的酶，例如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、溶菌酶、淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶等处理微藻，通过酶对细胞结构的进一步破坏，以及酶对脂蛋白、脂多糖的分解作用，增加微藻组织中油脂的流动性，从而使油脂游离出来。水酶法使用设备简单，操作简便安全、效率高，所得毛油质量高、易于进一步纯化处理，生产能耗相对较低，且污染小。因此，现有技术中有报道通过水酶法来提取，然而，其提取纯度却不理想，也就是说，现有技术中的工艺提取条件受限，工艺条件还有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合酶法提取微拟球藻中EPA的方法，其通过复合酶处理微拟球藻，在一定的反应条件下，酶解破坏微藻细胞结构，同时加强对脂多糖和脂蛋白等复合体的降解作用，增加油脂流动性，使油脂游离出来。通过离心处理获得毛油，毛油经过超临界CO2纯化法进一步纯化获得EPA。本发明EPA的提取纯度在95％以上。
其技术解决方案包括：
一种提取微拟球藻中EPA的方法，依次包括以下步骤：
a、将微拟球藻发酵液进行离心，得到上清液和藻泥，收集藻泥；
b、向步骤a所得藻泥中加入一定量的缓冲溶液，接着加入复合酶，在一定条件下反应获得酶解液；
c、将酶解液离心处理，得到第一游离油和乳状液，将所述乳状液进一步破乳离心得到第二游离油，将第一游离油和第二游离油合并得毛油；
d、将步骤c所得毛油经过超临界C02纯化法进一步纯化获得EPA；
步骤b中，所述的复合酶为壳聚糖酶、溶菌酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、碱性蛋白酶或胰蛋白酶中的几种，加入复合酶后，控制酶解温度35～50℃水解0.6～1.2h。
作为本发明的一个优选方案，所述的复合酶选自壳聚糖酶、果胶酶和碱性蛋白酶，所述壳聚糖酶的添加量为所述藻泥重量的0.7～0.9％，果糖酶的添加量为所述藻泥重量的0.4～0.6％，碱性蛋白酶的添加量为所述藻泥重量的1.7～1.9％。
作为本发明的另一个优选方案，所述的壳聚糖酶的添加量为所述藻泥重量的0.8％，果糖酶的添加量为所述藻泥重量的0.5％，碱性蛋白酶的添加量为所述藻泥重量的1.8％。
进一步的，步骤a中，所述的上清液经过吸附剂吸附处理后，用于配置新的培养基。
进一步的，步骤c中，离心处理时其转速控制为4500～5000rpm，离心时间15～25min；在破乳离心时破乳剂选择吐温-80、十二烷基磺酸钠的一种或两种。
进一步的，步骤d中，超临界C02纯化法中所选用的改性剂为乙醇或乙酸乙酯，所述改性剂的加入量为微拟球藻干重的5～8％，提取温度为35℃，提取时间为30min。
与现有技术相比，本发明采用复合酶法破壁，使用壳聚糖酶、溶菌酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶等多种酶，通过优化复合酶种类、比例及相关反应条件，可有效的破裂微拟球藻细胞组织，并增强对脂蛋白、脂多糖等复合体的降解，增加油脂流动性，加速油脂的分离提取。相较于机械法、化学法，具有设备简单，操作简便安全、效率高，耗能低，污染小等优点，适合微拟球藻生产EPA的工业化生产。
当复合酶壳为聚糖酶、果胶酶和碱性蛋白酶，壳聚糖酶的添加量为藻泥重量的0.8％，果糖酶的添加量为藻泥重量的0.5％，碱性蛋白酶的添加量为藻泥重量的1.8％时，EPA的提取纯度可达99％。
本发明具有设备投资少、操作简单安全、效率高、能耗低、绿色环保等优点。
具体实施方式
本发明提出了一种复合酶法提取微拟球藻中EPA的方法，为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
本发明所需原料均可通过商业渠道购买获得。
实施例1：
第一步、将微拟球藻发酵液进行离心，转速为3600rpm离心20min，得到上清液和藻泥，收集藻泥；在抽滤桶中选用活性炭：硅藻土＝1:1构筑滤饼，将上清液抽滤吸附处理后，用于配置新的培养基，循环利用实现清洁化生产，5.0千克的可处理200升上清液；
第二步、向藻泥中加入pH为7.5的磷酸缓冲液，料水比1:6(g/mL)，壳聚糖酶添加量为藻泥重量的0.8％、果糖酶添加量为藻泥重量的0.5％、碱性蛋白酶添加量为藻泥重量的1.8％，酶解温度40℃条件下水解0.8h得到酶解液；
第三步、将酶解液4500rpm离心15min处理，得到游离油和乳状液，乳状液进一步破乳离心得到游离油，破乳剂选择为吐温-80，游离油合并即为毛油；
第四步、毛油经过超临界C02纯化法进一步纯化获得EPA。提纯剂选择乙酸乙酯，加入量为毛油重量的6.5％，萃取温度为35℃，萃取时间为30min。
经生化检测，本实施例总脂的提取率可达干重的53％，其中EPA占总脂的35％，获得的EPA纯度为99％。
实施例2：
第一步、将微拟球藻发酵液进行离心，转速为3600rpm离心20min，得到上清液和藻泥，收集藻泥；在抽滤桶中选用活性炭：硅藻土＝1:1构筑滤饼，将上清液抽滤吸附处理后，用于配置新的培养基，循环利用实现清洁化生产，5.0千克的可处理200升上清液；
第二步、向藻泥中加入pH为7.5的磷酸缓冲液，料水比1:6(g/mL)，复合酶为壳聚糖酶、果糖酶和碱性蛋白酶，壳聚糖酶添加量为藻泥重量的0.7％、果糖酶添加量为藻泥重量的0.6％、碱性蛋白酶添加量为藻泥重量的1.9％，酶解温度40℃条件下水解0.8h得到酶解液；
第三步、将酶解液4500rpm离心15min处理，得到游离油和乳状液，乳状液进一步破乳离心得到游离油，破乳剂选择为吐温-80，游离油合并即为毛油；
第四步、毛油经过超临界C02纯化法进一步纯化获得EPA。提纯剂选择乙酸乙酯，加入量为毛油重量的6.5％，萃取温度为35℃，萃取时间为30min。
经生化检测，本实施例总脂的提取率可达干重的52％，其中EPA占总脂的35％，获得的EPA纯度为96％。
实施例3：
第一步、将微拟球藻发酵液进行离心，转速为3600rpm离心20min，得到上清液和藻泥，收集藻泥；在抽滤桶中适用活性炭：硅藻土＝1:1构筑滤饼，将上清液抽滤吸附处理后，用于配置新的培养基，循环利用实现清洁化生产，5.0千克的可处理200升上清液；
第二步、向藻泥中加入pH为7.5的磷酸缓冲液，料水比1:6(g/mL)，复合酶为半纤维素酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，半纤维素酶的添加量为藻泥重量的0.7％、碱性蛋白酶的添加量为藻泥重量的0.6％、胰蛋白酶的添加量为藻泥重量的1.9％，酶解温度50℃条件下水解0.6h得到酶解液；
第三步、将酶解液4500rpm离心15min处理，得到游离油和乳状液，乳状液进一步破乳离心得到游离油，破乳剂选择为吐温-80，游离油合并即为毛油；
第四步、毛油经过超临界C02纯化法进一步纯化获得EPA。提纯剂选择乙酸乙酯，加入量为毛油重量的6.5％，萃取温度为35℃，萃取时间为30min。
经生化检测，本实施例总脂的提取率可达干重的50％，其中EPA占总脂的35％，获得的EPA纯度为95％。
实施例4：
第一步、将微拟球藻发酵液进行离心，转速为3600rpm离心20min，得到上清液和藻泥，收集藻泥；在抽滤桶中适用活性炭：硅藻土＝1:1构筑滤饼，将上清液抽滤吸附处理后，用于配置新的培养基，循环利用实现清洁化生产，5.0千克的可处理200升上清液；
第二步、向藻泥中加入pH为7.5的磷酸缓冲液，料水比1:6(g/mL)，复合酶为溶菌酶、果胶酶和纤维素酶，溶菌酶的添加量为藻泥重量的0.7％、果胶酶的添加量为藻泥重量的0.6％、纤维素酶的添加量为藻泥重量的1.9％，酶解温度45℃条件下水解0.6h得到酶解液；
第三步、将酶解液4500rpm离心15min处理，得到游离油和乳状液，乳状液进一步破乳离心得到游离油，破乳剂选择为吐温-80，游离油合并即为毛油；
第四步、毛油经过超临界C02纯化法进一步纯化获得EPA。提纯剂选择乙酸乙酯，加入量为毛油重量的6.5％，萃取温度为35℃，萃取时间为30min。
经生化检测，本实施例总脂的提取率可达干重的46％，其中EPA占总脂的35％，获得的EPA纯度为96％。
实施例5：
与实施例1不同之处在于，采用壳聚糖酶、果胶酶和溶菌酶进行酶解。
经生化检测，总脂的提取率为干重的50％，其中EPA占总脂的33％，获得的EPA纯度为95％。
对比例1：
与实施例1不同之处在于，采用壳聚糖没进行酶解。
经生化检测，总脂的提取率为干重的30％，其中EPA占总脂的20％，获得的EPA纯度为80％。
本发明中未述及的部分借鉴现有技术即可实现。
需要说明的是：在本说明书的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式，或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种提取微拟球藻中EPA的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
a、将微拟球藻发酵液进行离心，得到上清液和藻泥，收集藻泥；
b、向步骤a所得藻泥中加入一定量的缓冲溶液，接着加入复合酶，在一定条件下反应获得酶解液；
c、将酶解液离心处理，得到第一游离油和乳状液，将所述乳状液进一步破乳离心得到第二游离油，将第一游离油和第二游离油合并得毛油；
d、将步骤c所得毛油经过超临界CO2纯化法进一步纯化获得EPA；
步骤b中，所述的复合酶为壳聚糖酶、果糖酶和碱性蛋白酶，加入复合酶后，控制酶解温度35～50℃水解0.6～1.2h；
所述的壳聚糖酶的添加量为所述藻泥重量的0.8％，果糖酶的添加量为所述藻泥重量的0.5％，碱性蛋白酶的添加量为所述藻泥重量的1.8％；
步骤d中，超临界CO2纯化法中所选用的改性剂为乙酸乙酯，所述改性剂的加入量为微拟球藻干重的5～8％，提取温度为35℃，提取时间为30min。
2.根据权利要求1所述的一种提取微拟球藻中EPA的方法，其特征在于：步骤a中，所述的上清液经过吸附剂吸附处理后，用于配置新的培养基。
3.根据权利要求1所述的一种提取微拟球藻中EPA的方法，其特征在于：步骤c中，离心处理时其转速控制为4500～5000rpm，离心时间15～25min；在破乳离心时破乳剂选择吐温-80、十二烷基磺酸钠的一种或两种。
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