CN105296137A

CN105296137A - 一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法

Info

Publication number: CN105296137A
Application number: CN201510663965.3A
Authority: CN
Inventors: 陈伟; 宋立荣; 吴莎
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明公开了一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，步骤是：A、在培养收获的产油微藻的湿藻泥、藻浆、干燥粉或发酵液中依次加入磷酸盐缓冲溶液、生物酶催化剂，搅拌并加热；B、酶催化降解反应完毕后，将反应体系调整pH值，将酶催化降解液温度提高并维持温度；C、待反应完毕后，将酶催化降解体系的温度降低，向反应体系中加入萃取剂进行油脂萃取，再加入破乳剂后通过离心进行分层；D、将分离获得的油相经减压蒸馏或者薄膜蒸发浓缩获得微藻油脂。方法易行，操作简便，针对产油微藻尤其是光合自养型产油微藻的高效破壁提油，降低了微藻提油过程的能量输入，提高了微藻能源的能效比，进而大大降低了微藻生物质能源的综合生产成本。

Description

一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法

技术领域

本发明涉及微藻生物化工、微藻生物质能源、微藻高附加值天然产物化学等领域，尤其涉及一种产油微藻的细胞破壁和油脂提取方法。

背景技术

随着化石燃料价格的不断上涨以及对于化石燃料不可再生性的认识,人们对于寻找可替代性新能源的需求也在不断扩大。微藻光合自养可以在常温常压下对CO₂进行高效吸收，将光能转化为脂肪或者淀粉贮存在细胞内，并释放氧气。微藻因其具备极高的光合作用效率、高效浓缩固定CO₂的能力以及可使用海洋、滩涂、荒漠等非粮食作物用地作为养殖场所等特性，被认为是未来一种极有希望的制备生物柴油的大宗原料。

微藻细胞拥有坚固的细胞壁且细胞体积较小，常规用于油料作物加工的压榨工艺不适用于微藻油脂的制备。目前微藻油脂的提取，常常需要辅以高温、高压、超声、搅拌、微波、强酸、强碱等高能量输入为代表的细胞壁破碎和溶剂提取技术才能够有效提高胞内油脂的萃取效率，但这将大大增加提取制备微藻油脂的成本，此外，高温、高压等处理过程会导致胞内油脂在破壁过程中发生水解、酸败等油脂变质反应，高附加值天然活性产物如类胡萝卜素等也将在极端的操作条件下遭到氧化破坏。此外，微藻培养后续的脱水和干燥等过程也造成能量输入的大幅提高。发展低能能耗、高效的湿藻泥微藻破壁油脂提取技术将能大大降低能量输入，提高微藻生物质能源的能耗比，推进微藻能源的商业化进程。

与高等植物的细胞壁相比较，多数产油微藻细胞壁主要成分可能不仅仅是纤维素。一些研究认为自养过程中，绿藻细胞壁中除了含有纤维素外，还有大量甲壳素、果胶、壳聚糖、糖蛋白等物质外，有些还含有一种叫做algaenan酸碱难以降解的高分子聚合物。目前，对微藻细胞壁的生物质组成的认识尚有待深入。多数酶法破碎细胞壁研究的成功案例主要集中在异养过程的菌类和藻类，如酵母、异养小球藻等。专利CN103787864B中公开了一种采用碱性蛋白酶对劣质壶菌发酵液进行破壁的成功案例；专利CN102875658B中采用碱性蛋白酶以及纤维素酶也成功对异养发酵的三种微藻进行了酶催化破壁，但该发明中还在破壁反应之前采用了高温热水处理，无法判断破壁过程的主要贡献是高温处理还是酶催化降解反应。此外，专利CN103173273A还公布了一种先用强酸、高温、高压处理后，再用蛋白酶等酶催化破壁的案例。上述发明依然无法克服目前异养型产油微藻在温和条件下的破壁和油脂提取等技术方面存在的瓶颈，对油脂提取设备的要求较高，能量输入也很大。本发明根据对微藻细胞壁生物质组成方面的初步认识，有针对性的采用生物酶催化进行自养型和异养型单细胞产油微藻细胞的破壁提油。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，方法易行，操作简便，针对产油微藻尤其是自养型产油微藻的高效破壁提油，旨在减少微藻生物能源及微藻高附加值活性产物的下游处理步骤，降低了微藻提油过程的能量输入，提高了微藻能源的能效比，进而大大降低了微藻生物质能源的综合生产成本。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：

步骤1：在培养收获的产油微藻的湿藻泥、藻浆、干燥粉或发酵液中依次加入磷酸盐缓冲溶液、生物酶催化剂，搅拌反应体系并加热至25℃-60℃，启动微藻细胞壁酶催化降解反应；

步骤2：酶催化降解反应完毕后，将步骤1中的反应体系调整pH值至7.5－9，然后将酶催化降解液温度提高至70－80℃并维持该温度0.5小时-4小时；

步骤3：待反应完毕后，将步骤2中酶催化降解体系的温度降低至40℃，并向反应体系中加入萃取剂进行油脂萃取操作(萃取操作参照文献Bigognoetal.,2002Phytochemistry60,497-503中所述方法进行)，然后再加入破乳剂后通过离心进行分层；

步骤4:将步骤3中分离获得的油相经减压蒸馏（蒸馏时间与压力和温度有关系，无需注明，操作温度40-60℃，真空度10mbar-500mbar)或者薄膜蒸发浓缩获得微藻油脂，薄膜蒸发操作温度为60-80℃，转膜速度为50-200rpm，真空度为40mbar-200mbar。

本发明中，步骤1所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01-0.5M，优选0.05M；所述的生物酶催化剂为甲壳素酶与果胶酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、酯酶、甘露糖异构化酶、木瓜蛋白酶等生物酶中的一种或与其它二至七种任意混合形成的复合酶；复合酶的用量为微藻干物质重量的0.1%-3.5%，优选1.25%；酶催化降解反应的温度为25℃-60℃，优选50℃；酶催化降解反应的时间为：0.5小时-8小时，优选4小时；

本发明中，步骤2中反应体系pH值优选9，所述温度优选80℃，所述反应时间优选1.5小时；所述的酶催化可以看作是介于均相与非均相催化反应之间的一种催化反应。既可以看成是反应物与酶形成了中间化合物，也可以看成是在酶的表面上首先吸附了反应物，然后再进行反应。

本发明中，步骤3所述的萃取剂为脂溶性且不溶于水的溶剂或多种（正己烷、环己烷、乙醚、氯仿、二氯甲烷、石油醚等）脂溶性溶剂（萃取溶剂及其它无机盐均购自国药集团化学试剂有限公司）任意比例的混合物，优选己烷类溶剂；所述的破乳剂为无机盐溶液，优选1%（质量百分比）食盐水，或者低链醇类，优选甲醇或乙醇，或者其它油水破乳剂。

所述的脂溶性是指物质能在非极性溶剂(如苯、乙醚、四氯化碳、石油醚等)中溶解的性能。脂溶性物质的分子中通常带有较长的碳链。

所述的溶剂是一种可以溶化固体，液体或气体溶质的液体，继而成为溶液。在日常生活中最普遍的溶剂是水。而所谓有机溶剂即是包含碳原子的有机化合物。溶剂通常拥有比较低的沸点和容易挥发。或是可以由蒸馏来去除，从而留下被溶物。因此，溶剂不可以对溶质产生化学反应。它们必须为惰性。溶剂可从混合物萃取可溶化合物，最普遍的例子是以热水冲泡咖啡或茶。溶剂通常是透明，无色的液体，他们大多都有独特的气味。

所述的离心分层方式为碟式连续离心或者管式离心，离心速率大于转速5000－6000rpm，即分离因素Fr5000－6000。

所述的破乳剂的用量根据微藻油脂含量和破乳效果来确定，破乳剂用量的确定以形成明显分层效应的最小用量为适（5-30%，体积比）含油量超过干重50%的微藻可不添加破乳剂或者减少破乳剂用量。

本发明中所述的微藻为光合自养（请详见中国专利200410012862.2）或者异养发酵培养（请见中国专利申请：200810246702.2）的小球藻、栅藻、雨生红球藻等产油微藻。

本发明所带来的有益技术效果是：

本发明可采用湿藻作为原料，在温和的条件下进行酶催化降解破碎细胞壁，使得多种光合自养型和异养型单细胞产油微藻油脂的提取效率提高至90%以上，大大减少了微藻能源下游干燥、提取等步骤，显著降低了微藻油脂制备过程的能量输入。相比传统的微藻生物柴油下游提取过程常采用的高温高压破壁提取方法而言，本发明仅在微藻油脂提取过程的综合成本将降低50%。同时，酶法破壁的温和过程也不会破坏微藻中的不饱和色素和不饱和油脂等高附加值天然活性产物，酶法破壁后能高效回收微藻细胞内75%以上的虾青素和叶黄素等高附加值天然色素，以及90%以上DHA、EPA等高值不饱和油脂，因此，本发明将为微藻资源的生物炼制综合开发提供了高效、可靠的手段。

具体实施方式

结合下列实施例，对本发明做进一步说明：

实施例1：

一种新型生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是：

A、称取异养发酵培养获得小球藻冷冻干燥藻粉10g置于具塞三角瓶中，加入50ml0.05M的磷酸盐缓冲溶液（PH7.2）与藻充分混合，然后加入150mg由甲壳素酶、纤维素酶和脂肪酶组成的复合酶（1：1：1，m/m/m）后摇匀，置于50℃水浴中反应4h。

B、进一步，用0.1M氢氧化钠溶液调整体系pH值为7.5或8.5或9并将水浴温度升高至70或75或80℃继续维持2小时。反应完毕后将三角瓶冷却至40℃以下，然后加入10ml正己烷与乙醚的混合溶剂（1:1，v/v）并转移至离心管中剧烈摇动进行萃取，然后再加入20ml甲醇后继续摇动萃取。

C、进一步将上述离心管置于离心机总离心10min，离心机转速为5000rpm。D、进一步，用巴斯德吸管小心转移上清液至干净玻璃瓶中，在离心管中添加上述正己烷与乙醚的混合溶剂10ml，重复上述萃取步骤，共计萃取三次。合并三次萃取液并以旋转浓缩仪去除溶剂（旋转蒸发温度为45℃，真空度为300mbar），并在高真空冷冻干燥仪中干燥至恒重，得微藻总脂9.21g，总脂提取效率92.1%。无酶对照组除去复合酶未加入，其它所有步骤同上述破壁提取方法一样，获得总脂2.18g，油脂提取效率为21.8%。上述酶法破壁所提取获得总脂经硅胶薄层层析法分析，展开剂为正己烷/乙醚/乙酸乙酯，体积比为80/20/2，未发现油脂有氧化和水解酸败的情况。

实施例2：

一种新型生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是：

A、取光合自养小球藻新鲜藻泥500g，该藻泥固含量21.0%置于三口瓶中，加入400ml0.05M的磷酸盐缓冲溶液（PH7.2）与藻泥搅拌充分混合，然后加入2.0g由甲壳素酶、果胶酶和碱性蛋白酶组成的复合酶（1：1：1，m/m/m）后搅拌均匀，置于50℃水浴中反应4h。

B、进一步，用0.1M氢氧化钠溶液调整体系pH值为7.8或8.3或9并将水浴温度升高至70或73或76或80℃继续维持2小时。反应完毕后将三角瓶冷却至40℃以下，然后往三口瓶加入150ml正己烷与乙醚的混合溶剂（1:1，v/v）剧烈摇动进行萃取，然后再加入200ml甲醇后继续摇动萃取5min。

C、进一步将三口瓶中萃取体系转移至离心管中离心10min，离心转速5000rpm。

D、离心完毕后用吸管将离心上清液转移至玻璃蒸发瓶中。然后将水相倒入三口瓶中并加入150ml正己烷搅拌重复该搅拌提取步骤2次，合并萃取上清液用旋转浓缩仪浓缩脱除溶剂（旋转蒸发温度为45℃，真空度为300mbar），并用高真空干燥仪进一步干燥脱除痕量水，得干燥后总脂32.6g，总脂提取率为88.7%。无酶对照组除去复合酶未加入，其它所有步骤同上述破壁提取方法一样，获得总脂4.59g，总脂提取效率为12.5%。上述酶法破壁所提取获得总脂经硅胶薄层层析法分析，展开剂为正己烷/乙醚/乙酸乙酯，体积比为80/20/2，未发现油脂有氧化和水解酸败的情况。

实施例3：

一种新型生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是：

A、取异养劣质壶藻发酵液20L置于玻璃萃取釜中，该发酵液的含固量为108g/L，依次加入磷酸二氢钾4.8g和36克磷酸氢二钾搅拌溶解均匀，然后加入32g由甲壳素酶、碱性蛋白酶组成的复合酶（1：1，m/m）后搅拌均匀后加热至45℃反应3h。

B、进一步，用0.1M氢氧化钠溶液调整体系pH值为7.5或7.8或8，并将水浴温度升高至70或74或78或80℃继续维持,1小时。反应完毕后在上述体系中加入5L乙醇和3L正己烷搅拌萃取30min。

C、进一步采用三相碟式分离机分离出油相，碟式离心速率为6000rpm。

D、分理处的水相和固相倒回提取釜加入3L正己烷重复上述萃取步骤2次，然后将三次油相合并用薄膜蒸发器去除溶剂（薄膜蒸发油浴温度70℃，真空度为100mbar，转膜速度为120rpm），然后进一步并采用高真空分子蒸馏设备去除痕量溶剂，得毛油1.22kg，油脂提取效率为97.4%。无酶对照组除去复合酶未加入，其它所有步骤同上述破壁提取方法一样，获得总脂554.9g，油脂提取效率44.3%。上述酶法破壁所提取获得总脂经硅胶薄层层析法分析，展开剂为正己烷/乙醚/乙酸乙酯，体积比为80/20/2，未发现油脂有氧化和水解酸败的情况。经GC/MS检测也未发现多不饱和脂肪酸组份发生明显改变。

实施例4：

一种新型生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是：

A、称取自养雨生红球藻藻粉10g置于具塞三角瓶中，加入50ml0.05M的磷酸盐缓冲溶液（PH7.2）与藻充分混合，然后加入150mg由甲壳素酶、甘露糖异构化酶、木瓜蛋白酶组成的复合酶（1：1：1，m/m/m）后摇匀，置于50℃水浴中反应4h。

B、进一步，用0.1M氢氧化钠溶液调整体系pH值为7.5或7.7或8并将水浴温度升高至70或72或75或80℃继续维持1小时。反应完毕后将三角瓶冷却至室温并离心10min，转速5000rpm，进一步去除上清液，然后再再固相中加入50ml丙酮进行搅拌萃取30min。

C、进一步将上述含有丙酮和藻的萃取体系置于离心机离心10min，离心机转速为5000rpm。

D、进一步，用巴斯德吸管小心转移上清液至干净玻璃瓶中，并将固相转移至三角瓶中再加入50ml丙酮，重复上述萃取步骤，共计萃取三次。合并三次萃取液并以旋转浓缩仪去除溶剂（旋转蒸发温度为45℃，真空度为300mbar），并在高真空冷冻干燥仪中避光干燥至恒重，得微藻总脂1.63g，总脂提取效率79.6%。无酶对照组除去复合酶未加入，其它所有步骤同上述破壁提取方法一样，获得总脂0.58g，油脂提取效率为28.3%。上述酶法破壁所提取获得总脂经硅胶薄层层析法分析，展开剂为正己烷/乙醚/乙酸乙酯，体积比为80：20：2，未发现油脂有氧化和水解酸败的情况。虾青素油脂、叶黄素等抗氧化色素还经TLC薄层层析法进一步检测，展开溶剂为正己烷/丙酮，体积比7:3,也未发现虾青素的氧化分解现象。

上面结合实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是：

A、在培养收获的产油微藻的湿藻泥、藻浆、干燥粉或发酵液中依次加入磷酸盐缓冲溶液、生物酶催化剂，搅拌反应体系并加热至25℃-60℃，启动微藻细胞壁酶催化降解反应；

B、酶催化降解反应完毕后，将步骤A中的反应体系调整pH值至7.5－9，将酶催化降解液温度提高至70－80℃并维持温度0.5-4小时；

C、待反应完毕后，将步骤B中酶催化降解体系的温度降低至40℃，并向反应体系中加入萃取剂进行油脂萃取操作，再加入破乳剂后通过离心进行分层；

D、将步骤C中分离获得的油相经减压蒸馏或薄膜蒸发浓缩获得微藻油脂，所述的减压蒸馏：操作温度40-60℃，真空度10mbar-500mbar；所述的薄膜蒸发：操作温度为60-80℃，转膜速度为50-200rpm，真空度为40mbar-200mbar；

所述的步骤A中的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01-0.5M，所述的生物酶催化剂为甲壳素酶与果胶酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、酯酶、甘露糖异构化酶、木瓜蛋白酶等生物酶中的一种或二至七种任意混合形成的复合酶；复合酶的用量为微藻干物质重量的0.1%-3.5%；酶催化降解反应的温度为25℃-60℃；酶催化降解反应的时间为：0.5小时-8小时；

所述的步骤C中的萃取剂为脂溶性不溶于水的溶剂为正己烷、环己烷、乙醚、氯仿、二氯甲烷、石油醚；所述的破乳剂为无机盐溶液，食盐水或甲醇或乙醇。

2.根据权利要求1所述的一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其特征在于：所述的脂溶性是指物质能在非极性溶剂为苯、乙醚、四氯化碳、石油醚。

3.根据权利要求1所述的一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其特征在于：所述的离心分层为碟式连续离心或者管式离心，离心速率大于转速5000－6000rpm，分离因素Fr5000－6000。

4.根据权利要求1所述的一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其特征在于：所述的微藻为自养或异养发酵培养的小球藻、栅藻、雨生红球藻产油微藻。