CN112004935A - 获得微生物油的方法和通过维持低的碳水化合物浓度来减少乳液的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于通过在从一种或多种微生物细胞中获得包含一种或多种多不饱和脂肪酸(PUFA)的微生物油的过程期间将所述发酵肉汤中的碳水化合物水平维持在小于15g/Kg来减少乳液的方法。本文进一步公开了通过本文描述的至少一种方法从微生物细胞中回收的包含一种或多种PUFA的微生物油。

Description

获得微生物油的方法和通过维持低的碳水化合物浓度来减少 乳液的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月30日提交的美国临时专利申请号62/650,354和2018年4月4日提交的62/652,602的申请日的权益，将所述临时专利申请的公开内容特此通过引用以其整体并入。
技术领域
本发明涉及一种从含有脂质的生物质中获得含有多不饱和脂肪酸的脂质的方法。
背景技术
本文公开了用于从一种或多种微生物细胞中获得包含一种或多种多不饱和脂肪酸(PUFA)的微生物油的方法。本文进一步公开了通过本文描述的至少一种方法从微生物细胞中回收的包含一种或多种PUFA的微生物油。
含有一种或多种PUFA的微生物油通过例如像藻类和真菌的微生物产生。
用于从微生物细胞中获得含有PUFA的油的典型方法涉及使能够产生所希望的油的微生物在发酵罐、池或生物反应器中生长以产生微生物细胞生物质；从其中所述生物质生长的发酵培养基中分离所述生物质；使用水不混溶性有机溶剂(例如，己烷)将所述微生物细胞生物质干燥以从干燥的细胞中提取油；以及从所述油中除去有机溶剂(例如，己烷)。
另一种用于从微生物细胞中获得含有PUFA的油的方法涉及使能够产生所希望的油的微生物在发酵罐、池或生物反应器中生长以产生微生物细胞生物质；通过使用机械力(例如，均化)、酶处理、或化学处理破坏细胞壁将所述含有PUFA的油释放到其中所述细胞生长的发酵培养基中；以及使用水混溶性有机溶剂从包含含有PUFA的油、细胞碎片、和液体的所得组合物中回收所述油。可以将所述油从所述组合物中机械分离，并且必须从所述油和生物质含水废物流两者中除去醇。
更最近，开发了第三无溶剂方法，用于从微生物细胞中获得含有PUFA的油。所述用于从微生物细胞中获得含有PUFA的油的无溶剂方法涉及使能够产生所希望的油的微生物在发酵罐、池或生物反应器中生长以产生微生物细胞生物质；通过使用机械力(例如，均化)、酶处理、或化学处理破坏细胞壁将所述含有PUFA的油释放到其中所述细胞生长的发酵培养基中；以及通过升高pH，添加盐，加热和/或搅拌所得组合物从包含含有PUFA的油、细胞碎片、和液体的所得组合物中回收粗油。
以上无溶剂方法具有避免使用大量挥发性和易燃性有机溶剂的益处。然而，这种方法需要破坏在细胞裂解并且将油释放并且与细胞碎片和发酵肉汤组分混合后产生的浓稠乳液。这导致长的油回收时间、大量盐的使用和/或许多步骤，它们都可能增加加工成本。另外，在细胞裂解步骤过程中乳液的形成降低了油提取过程的效率，并且直接影响此类过程的提取产率。
因此，需要鉴定造成乳液形成并且影响油品质、分离和总方法效率的肉汤组分。成功鉴定此类组分可能导致乳液的减少或甚至消除，从而使油提取步骤的数目最少，缩短油回收时间，并且有助于提供高的含有PUFA的高品质油的产率。
发明内容
本发明涉及一种用于从发酵肉汤中含有的一种或多种微生物细胞中获得包含一种或多种多不饱和酸的微生物油的方法，其中在所述方法过程中，在所述发酵肉汤中维持小于15g/Kg的碳水化合物。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括：
(a)将包含所述微生物油的细胞裂解以形成裂解的细胞组合物；
(b)将所述裂解的细胞组合物破乳以形成破乳的裂解的细胞组合物；
(c)从所述破乳的裂解的细胞组合物中分离所述油；以及
(d)回收所述油。
本发明还涉及一种用于降低在从发酵肉汤中含有的一种或多种微生物细胞中提取包含一种或多种多不饱和酸的微生物油中使用的苛性剂的量的方法，其中在所述油提取过程期间，在所述发酵肉汤中维持小于15g/Kg的碳水化合物。在一个实施方案中，每1Kg发酵肉汤使用小于18g苛性钠。
在一些实施方案中，在以上方法过程中，在所述发酵肉汤中维持0-10g/Kg的碳水化合物。在一个实施方案中，在步骤(a)之前，在所述发酵肉汤中维持此水平的碳水化合物。
在一个实施方案中，以上使用的微生物细胞能够产生至少约10wt.％、至少约20wt.％、优选至少约30wt.％、更优选至少约40wt.％的作为脂质的其生物质。在一些实施方案中，所述多不饱和脂质包含DHA、EPA和ARA中的一种或任何组合。
在一个实施方案中，以上方法中使用的碳水化合物选自葡萄糖、蔗糖、右旋糖、多糖、及其混合物。
在一个实施方案中，所述微生物细胞选自藻类、真菌、原生生物、细菌、微藻、及其混合物。在ne实施方案中，所述微生物细胞来被孢霉属(Mortierella)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、或破囊壶菌目(Thraustochytriales)。在另一个实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌目。在另一个实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、或其混合物。在又另一个实施方案中，所述微生物细胞来自高山被孢霉(Mortierella Alpina)。
附图说明
图1是展示了实验设计的图，所述实验设计用于在下游过程(DSP)期间检查葡萄糖对乳液形成/相分离的影响。
图2示出了当在巴氏灭菌之前添加葡萄糖时，不同量的葡萄糖对乳液的影响。b1：0.2g/Kg的葡萄糖(对照)，b2：20g/Kg的葡萄糖，b3：40g/Kg的葡萄糖，b4：60g/Kg的葡萄糖。
图3示出了当在DSP过程的不同阶段添加葡萄糖时，添加20g/Kg的葡萄糖对乳液的作用。b1：0.2g/Kg的葡萄糖(对照)，b2：在巴氏灭菌之前添加的20g/Kg的葡萄糖，b5：在巴氏灭菌之后添加的20g/Kg的葡萄糖，b6：在细胞裂解之后添加的20g/Kg的葡萄糖，b7：在肉汤浓缩之后添加的20g/Kg的葡萄糖。
图4示出了在起始肉汤中不同残余葡萄糖量的情况下，破坏乳液所需的苛性剂的量的依赖性。
具体实施方式
在阅读下面详细描述时，本领域普通技术人员可以更容易地理解本发明的特征和优点。应当理解，出于清楚性原因而在单独的实施方案的背景下在上下文中描述的本发明的某些特征还可以组合以形成其子组合。
本文中鉴定为示例性的实施方案旨在是说明性的而非限制性的。
本文公开了一种用于从一种或多种微生物细胞中获得包含一种或多种多不饱和酸的微生物油的方法，其中所述方法包括：
(a)将包含所述微生物油的细胞裂解以形成裂解的细胞组合物；
(b)将所述裂解的细胞组合物破乳以形成破乳的裂解的细胞组合物；
(c)从所述破乳的裂解的细胞组合物中分离所述油；以及
(d)回收所述油；
其中在所述方法期间，在细胞组合物中维持小于15g/Kg的碳水化合物。
在本发明中描述的方法的特别优点是，通过在所述方法期间维持少量或最小量的碳水化合物，显著地减少了乳液的形成。根据本发明，非常令人惊讶地发现，肉汤组合物中较高浓度的碳水化合物影响游离油分离效率。进一步发现，当与其中碳水化合物水平不受控制或维持在较高水平的类似方法相比时，当将碳水化合物的量减少至较低水平时，乳液的形成减少。
在本发明中已经鉴定了优选的碳水化合物水平。在一个实施方案中，在油提取过程期间，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在小于15g/Kg。在另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在小于14g/Kg、小于13g/Kg、小于12g/Kg、小于11g/Kg、小于10g/Kg、小于9g/Kg、小于8g/Kg、小于7g/Kg、小于6g/Kg、小于5g/Kg、小于4g/Kg、小于3g/Kg、小于2g/Kg、小于1g/Kg、或小于0.2g/Kg。在另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在5-10g/Kg之间。在另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在0.2-5g/Kg之间。在另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在5-15g/Kg之间。在又另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在0-15g/Kg之间。在又另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在0.2-15g/Kg之间。
通过在提取过程的不同阶段添加葡萄糖来检查糖在乳液形成中的作用。发现在巴氏灭菌之前添加的量的葡萄糖(其可能与发酵肉汤中残余的糖类似)是造成提取过程中形成乳液的主要原因。
因此，在一个实施方案中，在发酵过程结束时但在油提取过程之前将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在小于14g/Kg、小于13g/Kg、小于12g/Kg、小于11g/Kg、小于10g/Kg、小于9g/Kg、小于8g/Kg、小于7g/Kg、小于6g/Kg、小于5g/Kg、小于4g/Kg、小于3g/Kg、小于2g/Kg、小于1g/Kg、或小于0.2g/Kg。在另一个实施方案中，在发酵过程结束时并且在整个油提取过程中维持发酵肉汤中碳水化合物的浓度
术语“碳水化合物”通常是指通常在任何发酵肉汤中提供的碳能源。通常包含在发酵肉汤中的碳水化合物包括但不限于葡萄糖、蔗糖、右旋糖和多糖。
在一个实施方案中，通过在发酵过程结束时耗尽碳水化合物源，将碳水化合物的浓度设定为小于15g/Kg。这可以通过例如使发酵过程运行足够长的时间段以便让全部或几乎全部碳水化合物被发酵罐中的细胞消耗来实现。在另一个实施方案中，可以在油提取过程之前除去过量的碳水化合物，从而将碳水化合物的浓度降低至小于15g/Kg。
在本发明中描述的方法的另一个优点是，通过在所述过程期间维持少量或最小量的碳水化合物，显著地减少了破乳过程中使用的苛性钠的量。令人惊讶地发现，裂解的细胞组合物中较高的碳水化合物浓度导致使用大量的苛性钠来破坏乳液。
在本发明中已经鉴定了所使用的苛性钠的最低水平。在一个实施方案中，当在油提取过程期间将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在每Kg发酵肉汤小于15g时，可以使用小于18g/KG的苛性钠。在另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在小于14g/Kg、小于13g/Kg、小于12g/Kg、小于11g/Kg、小于10g/Kg、小于9g/Kg、小于8g/Kg、小于7g/Kg、小于6g/Kg、小于5g/Kg、小于4g/Kg、小于3g/Kg、小于2g/Kg、小于1g/Kg、或小于0.2g/Kg。在另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在5-10g/Kg之间。在另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在0.2-5g/Kg之间。在另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在5-15g/Kg之间。在又另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在0-15g/Kg之间。在又另一个实施方案中，将发酵肉汤中碳水化合物的浓度维持在0.2-15g/Kg之间。
本文还公开了一种通过本文描述的任何方法获得的微生物油。
本文描述的微生物油是指包含一种或多种PUFA并且从微生物细胞中获得的油。
多不饱和脂肪酸(PUFA)是基于从脂肪酸的甲基末端开始的第一双键的位置来分类的；ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳处含有第一双键，而ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳处含有第一双键。例如，二十二碳六烯酸(DHA)是具有22个碳的链长和6个双键的ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，通常命名为“22:6n-3”。在一个实施方案中，PUFA选自ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、及其混合物。在另一个实施方案中，PUFA选自LC-PUFA。在仍进一步的实施方案中，PUFA选自二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(ARA)、γ-亚麻酸(GLA)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)、十八碳四烯酸(SDA)、及其混合物。在另一个实施方案中，PUFA选自DHA、ARA、及其混合物。在进一步的实施方案中，PUFA是DHA。在进一步的实施方案中，PUFA是EPA。在又进一步的实施方案中，PUFA是ARA。
LC-PUFA是含有至少3个双键并且具有18个或更多个碳或20个或更多个碳的链长的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFA包括但不限于二-高-γ亚油酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6)、二十二碳四烯酸或肾上腺酸(C22:4n-6)、和二十二碳五烯酸(C22:5n-6)。ω-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20:3n-3)、二十碳四烯酸(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)、二十二碳五烯酸(C22:5n-3)、和二十二碳六烯酸(C22:6n-3)。LC-PUFA还包括具有多于22个碳和4个或更多个双键的脂肪酸，包括但不限于C24:6(n-3)和C28:8(n-3)。
PUFA可以呈游离脂肪酸、盐、脂肪酸酯(例如，甲酯或乙酯)、单酰基甘油(MAG)、二酰基甘油(DAG)、三酰基甘油(TAG)、和/或磷脂(PL)的形式。
高度不饱和脂肪酸(HUFA)是含有4个或更多个不饱和碳-碳键的ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸。
如本文所用，“细胞”是指含有油的生物材料，诸如源自产油微生物的生物材料。由微生物产生或从微生物细胞中获得的油被称为“微生物油”。由藻类和/或真菌产生的油也分别被称为藻油和/或真菌油。
如本文所用，“微生物细胞”或“微生物”是指诸如以下的生物体：藻类、细菌、真菌、酵母、原生生物、及其组合，例如单细胞生物体。在一些实施方案中，微生物细胞是真核细胞。微生物细胞包括但不限于金藻(例如，不等鞭毛界(Stramenopiles)微生物)；绿藻；硅藻；鞭毛藻(例如，横裂甲藻目(Dinophyceae)微生物，包括隐甲藻属(Crypthecodinium)，例如像寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii或C.cohnii))；破囊壶菌目微藻；酵母(子囊菌(Ascomycetes)或担子菌(Basidiomycetes))；和毛霉属(Mucor)、被孢霉属(Mortierella)(包括但不限于高山被孢霉(Mortierella alpina)和Mortierella sect.schmuckeri)和腐霉属(Pythium)(包括但不限于隐袭腐霉(Pythium insidiosum))真菌。
在一个实施方案中，所述微生物细胞来被孢霉属(Mortierella)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、或破囊壶菌目(Thraustochytriales)。在仍进一步的实施方案中，所述微生物细胞来自寇氏隐甲藻。在又甚至进一步的实施方案中，所述微生物细胞选自寇氏隐甲藻、高山被孢霉、破囊壶菌属、裂殖壶菌属、及其混合物。
在仍进一步的实施方案中，所述微生物细胞包括但不限于属于以下的微生物：被孢霉属、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属、疫霉属(Phytophthora)、青霉菌属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉属、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属(Entomophthora)、刺孢囊霉属(Echinosporangium)、和水霉属(Saprolegnia)。在另一个实施方案中，ARA获得自来自被孢霉属的微生物细胞，所述被孢霉属包括但不限于长孢被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜湿被抱霉(Mortierella hygrophila)、高山被孢霉、Mortierella schmuckeri、和小被孢霉(Mortierella minutissima)。
在甚至进一步的实施方案中，所述微生物细胞来自以下的微藻：破囊壶菌目，其包括但不限于破囊壶菌属(物种包括arudimentale、金黄色破囊壶菌(aureum)、benthicola、球破囊壶菌(globosum)、金尼破囊壶菌(kinnei)、动孢破囊壶菌(motivum)、多增殖性破囊壶菌(multirudimentale)、厚皮破囊壶菌(pachydermum)、层出破囊壶菌(proliferum)、粉红破囊壶菌(roseum)、纹带破囊壶菌(striatum))；裂殖壶菌属(物种包括聚生裂殖壶菌(aggregatum)、limnaceum、红树林裂殖壶菌(mangrovei)、微小裂殖壶菌(minutum)、八孢裂殖壶菌(octosporum))；吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(物种包括变形吾肯氏壶菌(amoeboidea)、克格伦吾肯氏壶菌(kerguelensis)、小吾肯氏壶菌(minuta)、深海吾肯氏壶菌(profunda)、、辐射吾肯氏壶菌(radiate)、sailens、沙氏吾肯氏壶菌(sarkariana)、schizochytrops、威瑟氏吾肯氏壶菌(visurgensis)、约肯氏吾肯氏壶菌(yorkensis))；Aurantiacochytrium属；Oblongichytrium属；Sicyoidochytium属；Parientichytrium属；Botryochytrium属；及其组合。描述在吾肯氏壶菌属中的物种将被认为是裂殖壶菌属的成员。在另一个实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌目。在又另一个实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌属。在仍进一步的实施方案中，所述微生物细胞来自裂殖壶菌属。在仍进一步的实施方案中，所述微生物细胞选自破囊壶菌属、裂殖壶菌属、或其混合物。
在一个实施方案中，所述方法包括将包含微生物油的微生物细胞裂解以形成裂解的细胞组合物。术语“裂解(lyse和lysing)”是指微生物细胞的壁和/或膜破裂的过程。在一个实施方案中，通过经受选自机械、化学、酶、物理、及其组合的至少一种处理来将微生物细胞裂解。在另一个实施方案中，所述方法包括将包含微生物油的微生物细胞裂解以形成裂解的细胞组合物，其中所述裂解选自机械、化学、酶、物理、及其组合。
如本文所用，“裂解的细胞组合物”是指包含以下的组合物：一种或多种裂解的细胞(包括细胞碎片和细胞的其他内容物)与微生物油(来自裂解的细胞)的组合以及任选地含有液体(例如，水)、营养素和微生物细胞的发酵肉汤。在一些实施方案中，微生物细胞包含在发酵肉汤或包含水的培养基中。在一些实施方案中，裂解的细胞组合物是指包含以下的组合物：裂解的细胞组合物是指包含一种或多种裂解的细胞、细胞碎片、微生物油、细胞的天然内容物、和来自发酵肉汤的水性组分。在一个实施方案中，裂解的细胞组合物包含液体、细胞碎片、和微生物油。在一些实施方案中，裂解的细胞组合物呈水包油乳液的形式，所述水包油乳液包含连续水相和分散油相的混合物。
一般而言，本文描述的方法可以应用于在脂质提取过程期间可以形成乳液的任何含有脂质的微生物细胞。在一个实施方案中，所述微生物细胞选自藻类、真菌、原生生物、细菌、微藻、及其混合物。在另一个实施方案中，所述微藻选自不等鞭毛门(Stramenopiles)，特别是破囊壶菌科，优选裂殖壶菌属。在另一个实施方案中，表面描述的微生物细胞能够产生至少约10wt.％、至少约20wt.％、优选至少约30wt.％、更优选至少约40wt.％的作为脂质的其生物质。在另一个实施方案中，所述多不饱和脂质包含DHA、EPA和ARA中的一种或任何组合。
实施例
实施例1
在此实施例中，检查葡萄糖浓度对乳液形成/相分离的影响。
实验设计在图1中示出。在DSP过程的不同阶段，向肉汤中添加不同量的葡萄糖。在DPS过程结束时取出样品，并且分析其乳液程度。这些条件和步骤在图1中标记为b1-b7。
b1：对照，在下游过程之前和整个过程中，维持0.2g/Kg的残余葡萄糖浓度，
b2：在巴氏灭菌之前，20g/Kg的葡萄糖，
b3：在巴氏灭菌之前，40g/Kg的葡萄糖，
b4：在巴氏灭菌之前，60g/Kg的葡萄糖，
b5：在巴氏灭菌之后，20g/Kg的葡萄糖，
b6：在细胞裂解之后，20g/Kg的葡萄糖，以及
b7：在浓缩之后，20g/Kg的葡萄糖。
对照实验
在此实验中，在下游过程之前和整个过程中，维持0.2g/Kg的残余葡萄糖浓度，如图1，b1所示。在下游过程结束时，通过移液出在离心乳化肉汤之后分离的游离油来测量破乳程度。
将生物质密度超过100g/Kg的含有微生物细胞(裂殖壶菌属物种)的未洗涤细胞肉汤在搅拌的3颈圆底烧瓶中加热至70℃。在加热悬浮液之后，通过使用苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH调节至8.5，然后添加0.075wt.-％的量(按肉汤重量计)的呈液体形式的蛋白酶(Novozymes产品37071)。在70℃下继续搅拌2小时。之后，将裂解的细胞混合物加热至90℃的温度。通过从裂解的肉汤中蒸发水来浓缩混合物，直到达到约34.8wt.-％的总干物质含量。然后通过添加苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH改为10.5，使浓缩的肉汤破乳。在破乳开始时添加的苛性钠的总量为约6.7wt.-％(基于初始肉汤重量)，确保pH始终低于10.5。24小时后，通过添加硫酸溶液(3N)将破乳的肉汤中和至pH 7.5。中和后，将约250g均化的肉汤样品取出到50mL离心管中，并且通过以4500rpm离心15min来进行细胞碎片的分离。测量从油相中回收的油、从乳液相中回收的油以及在重相中损失的油的脂肪分布百分比，并且在图2，b1中示出。
葡萄糖加标实验：
测试1A。在巴氏灭菌之前的葡萄糖加标
在此实验中，检查不同浓度的残余葡萄糖(发酵运行完成后肉汤中仍未消耗的葡萄糖)对破乳的影响。将测量量的葡萄糖添加到原始的未经巴氏灭菌的肉汤中，以制造最终葡萄糖浓度为20g/Kg、40g/Kg和60g/Kg的模拟肉汤。通过油与细胞碎片的分离程度来测量残余葡萄糖对破乳的作用。
将发酵后残余葡萄糖为0.2g/Kg的未经巴氏灭菌的肉汤用20、40和60g/Kg的葡萄糖加标。葡萄糖加标后，将此肉汤在搅拌的3颈圆底烧瓶中在60℃下巴氏灭菌1小时。将经巴氏灭菌的肉汤加热至70℃，通过使用苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH调节至8.5，然后添加0.075wt.-％的量(按肉汤重量计)的呈液态形式的蛋白酶(Novozymes产品37071)。在70℃下继续搅拌2小时。之后，将裂解的细胞混合物加热至90℃的温度。通过从裂解的肉汤中蒸发水来浓缩混合物，直到达到约35wt.-％的总干物质含量。然后通过添加苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH改为10.5，使浓缩的肉汤破乳。在破乳开始时添加的苛性钠的总量为约6-7wt.-％(基于初始肉汤重量)，确保pH始终低于10.5。24小时后，通过添加硫酸溶液(3N)将破乳的肉汤中和至pH 7.5。中和后，将约250g均化的肉汤样品取出到50mL离心管中，并且通过以4500rpm离心15min来进行细胞碎片的分离。测量从油相中回收的油、从乳液相中回收的油以及在重相中损失的油的脂肪分布百分比，并且分别在图2，b2、b3和b4中示出。
测试1B当在巴氏灭菌之后添加时20g/Kg的葡萄糖对DSP的影响
在此实验中，检查当在巴氏灭菌步骤之后添加时20g/Kg的残余葡萄糖对破乳的影响。将肉汤巴氏灭菌后，将测量量的葡萄糖添加到肉汤中以制造最终葡萄糖浓度为20g/Kg的模拟肉汤。通过油与细胞碎片的分离程度来测量这些残余葡萄糖对破乳的作用。
将肉汤(20g/Kg的葡萄糖浓度)在搅拌的3颈圆底烧瓶中加热至70℃。在加热悬浮液之后，通过使用苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH调节至8.5，然后添加0.075wt.-％的量(按肉汤重量计)的呈液体形式的蛋白酶(Novozymes产品37071)。在70℃下继续搅拌2小时。之后，将裂解的细胞混合物加热至90℃的温度。通过从裂解的肉汤中蒸发水来浓缩混合物，直到达到约36.9wt.-％的总干物质含量。然后通过添加苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH改为10.5，使浓缩的肉汤破乳。在破乳开始时添加的苛性钠的总量为约6.5wt.-％(基于初始肉汤重量)，确保pH始终低于10.5。24小时后，通过添加硫酸溶液(3N)将破乳的肉汤中和至pH 7.5。中和后，将约250g均化的肉汤样品取出到50mL离心管中，并且通过以4500rpm离心15min来进行细胞碎片的分离。测量从油相中回收的油、从乳液相中回收的油以及在重相中损失的油的脂肪分布百分比，并且在图3，b5中示出。
测试1C当在细胞裂解之后添加时20g/Kg的葡萄糖对DSP的影响
在此实验中，检查当在细胞裂解之后添加时20g/Kg的残余葡萄糖对破乳的影响。将肉汤裂解后，将测量量的葡萄糖添加到肉汤中以制造最终葡萄糖浓度为20g/Kg的模拟肉汤。通过油与细胞碎片的分离程度来测量这些残余葡萄糖对破乳的作用。
将发酵后残余葡萄糖为0.2g/Kg的经巴氏灭菌的肉汤在搅拌的3颈圆底烧瓶中加热至70℃。在加热悬浮液之后，通过使用苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH调节至8.5，然后添加0.075wt.-％的量(按肉汤重量计)的呈液体形式的蛋白酶(Novozymes产品37071)。在70℃下继续搅拌2小时。将发酵后残余葡萄糖为0.2g/Kg的此裂解肉汤用测量量的葡萄糖加标以制造最终葡萄糖浓度为20g/Kg的模拟肉汤。之后，将裂解的细胞混合物加热至90℃的温度。通过从裂解的肉汤中蒸发水来浓缩混合物，直到达到约35.3wt.-％的总干物质含量。然后通过添加苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH改为10.5，使浓缩的肉汤破乳。在破乳开始时添加的苛性钠的总量为约6.6wt.-％(基于初始肉汤重量)，确保pH始终低于10.5。24小时后，通过添加硫酸溶液(3N)将破乳的肉汤中和至pH 7.5。中和后，将约250g均化的肉汤样品取出到50mL离心管中，并且通过以4500rpm离心15min来进行细胞碎片的分离。测量从油相中回收的油、从乳液相中回收的油以及在重相中损失的油的脂肪分布百分比，并且在图3，b6中示出。
测试1D当在肉汤浓缩之后添加时20g/Kg的葡萄糖对DSP的影响
在此实验中，检查当在浓缩肉汤之后添加时20g/Kg的残余葡萄糖对破乳的影响。将肉汤巴氏灭菌后，将测量量的葡萄糖添加到肉汤中以制造最终葡萄糖浓度为20g/Kg的模拟肉汤。通过油与细胞碎片的分离程度来测量这些残余葡萄糖对破乳的作用。
将发酵后残余葡萄糖为0.2g/Kg的经巴氏灭菌的肉汤在搅拌的3颈圆底烧瓶中加热至70℃。在加热悬浮液之后，通过使用苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH调节至8.5，然后添加0.075wt.-％的量(按肉汤重量计)的呈液体形式的蛋白酶(Novozymes产品37071)。在70℃下继续搅拌2小时。之后，将裂解的细胞混合物加热至90℃的温度。通过从裂解的肉汤中蒸发水来浓缩混合物，直到达到约33.8wt.-％的总干物质含量。将发酵后残余葡萄糖为0.2g/Kg的此浓缩肉汤用测量量的葡萄糖加标以制造最终葡萄糖浓度为20g/Kg的模拟肉汤。然后通过添加苛性钠(20wt.-％NaOH溶液)将pH改为10.5，使浓缩的肉汤破乳。在破乳开始时添加的苛性钠的总量为约6.4wt.-％(基于初始肉汤重量)，确保pH始终低于10.5。24小时后，通过添加硫酸溶液(3N)将破乳的肉汤中和至pH 7.5。中和后，将约250g均化的肉汤样品取出到50mL离心管中，并且通过以4500rpm离心15min来进行细胞碎片的分离。测量从油相中回收的油、从乳液相中回收的油以及在重相中损失的油的脂肪分布百分比，并且在图3，b7中示出。
实施例2
在此实施例中，检查葡萄糖浓度对在DSP过程中使用的苛性钠的量的影响。
将收获时含有微生物细胞(裂殖壶菌属物种)的细胞肉汤的葡萄糖水平控制在5g/Kg与37g/Kg之间。将细胞肉汤在搅拌的3颈圆底烧瓶中加热至60℃。在加热悬浮液之后，通过使用苛性钠(50wt.-％NaOH溶液)将pH调节至7-8之间，然后添加0.3wt.-％的量(按肉汤重量计)的呈液体形式的蛋白酶(Novozymes产品37071)。在60℃下继续搅拌2小时。然后通过添加苛性钠(50wt.-％NaOH溶液)将pH维持在10-11之间直到观察不到pH进一步下降，将肉汤破乳。然后将溶液加热至90℃，直到在12000g下的离心显示出轻质油负载相和重质水性负载相的可见分离。图4显示，破乳所需的苛性钠的量受起始肉汤中残余葡萄糖的量影响。较低的残余葡萄糖浓度导致使用较少苛性钠。

Claims (26)

1.一种用于从发酵肉汤中含有的一种或多种微生物细胞中获得包含一种或多种多不饱和酸的微生物油的方法，其中在所述方法过程中，在所述发酵肉汤中维持小于15g/Kg的碳水化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(a)将包含所述微生物油的细胞裂解以形成裂解的细胞组合物；
(b)将所述裂解的细胞组合物破乳以形成破乳的裂解的细胞组合物；
(c)从所述破乳的裂解的细胞组合物中分离所述油；以及
(d)回收所述油。
3.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中在所述方法过程中，在所述发酵肉汤中维持0-10g/Kg的碳水化合物。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)之前，在所述发酵肉汤中维持所述碳水化合物水平。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物细胞能够产生至少约10wt.％、至少约20wt.％、优选至少约30wt.％、更优选至少约40wt.％的作为脂质的其生物质。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多不饱和脂质包含DHA、EPA和ARA中的一种或任何组合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物选自葡萄糖、蔗糖、右旋糖、多糖、及其混合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物细胞选自藻类、真菌、原生生物、细菌、微藻、及其混合物。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述微生物细胞来被孢霉属(Mortierella)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、或破囊壶菌目(Thraustochytriales)。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述微生物细胞来自破囊壶菌目。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述微生物细胞来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、或其混合物。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述微生物细胞来自高山被孢霉(MortierellaAlpina)。
13.根据权利要求1-12所述的方法，其中在步骤(b)中每1Kg发酵肉汤添加小于18g苛性钠。
14.一种通过前述权利要求中任一项获得的油。
15.一种用于降低在从发酵肉汤中含有的一种或多种微生物细胞中提取包含一种或多种多不饱和酸的微生物油中使用的苛性剂的量的方法，其中在所述油提取过程期间，在所述发酵肉汤中维持小于15g/Kg的碳水化合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中每1Kg发酵肉汤使用小于18g苛性钠。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中在所述方法过程中，在所述发酵肉汤中维持0-10g/Kg的碳水化合物。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述微生物细胞能够产生至少约10wt.％、至少约20wt.％、优选至少约30wt.％、更优选至少约40wt.％的作为脂质的其生物质。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述多不饱和脂质包含DHA、EPA和ARA中的一种或任何组合。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物选自葡萄糖、蔗糖、右旋糖、多糖、及其混合物。
21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述微生物细胞选自藻类、真菌、原生生物、细菌、微藻、及其混合物。
22.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述微生物细胞来被孢霉属(Mortierella)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、或破囊壶菌目(Thraustochytriales)。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述微生物细胞来自破囊壶菌目。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述微生物细胞来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、或其混合物。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述微生物细胞来自高山被孢霉(MortierellaAlpina)。
26.一种通过权利要求15-25中任一项获得的油。
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