CN109477122A - 从含有产油微生物的发酵液中提取包含多不饱和脂肪酸的微生物油的方法 - Google Patents

从含有产油微生物的发酵液中提取包含多不饱和脂肪酸的微生物油的方法 Download PDF

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Abstract

用于从一种或多种微生物细胞中获得包含一种或多种多不饱和脂肪酸(PUFA)的微生物油的方法，包括在进行破乳之前从细胞发酵液或裂解的细胞组合物中去除水。这种方法具有减少破乳时间和减少盐的使用的益处。通过该方法可以从微生物细胞中回收包含一种或多种PUFA的微生物油。

Description

从含有产油微生物的发酵液中提取包含多不饱和脂肪酸的微 生物油的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月13日提交的美国临时专利申请号62/361,770的申请日的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
人们希望增加许多有益营养素的膳食摄入。特别有益的营养素包括脂肪酸例如ω-3和ω-6长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)及其酯。长链ω-3和ω-6脂肪酸是人类饮食的基本部分，其目前主要源自鱼油或微生物油。
由于过度捕捞的问题，需要替代性的已经证明在人类中有健康益处的可持续的ω-脂肪酸(例如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))来源。由于人工养殖的鱼类从鱼饲料的补充物中而非在野外从微藻或海洋浮游植物中获得其ω-3脂肪酸的事实，因此鱼饲料也需要这种替代性的ω-3脂肪酸来源。
可以由微生物产生用于营养品和动物饲料的脂质。例如，在藻类中制造脂质可包括种植藻类并从其中提取细胞内脂质。含有PUFA的脂质的良好来源来自产油微生物例如破囊壶菌目的藻类品系，隐甲藻属的藻类品系或被孢霉属的真菌菌株，以及许多其他微生物。
用于从微生物细胞获得含有PUFA的油的工业规模方法包含使能够产生所需油的微生物在发酵罐或池中生长以产生微生物细胞生物质，并随后从所述细胞生物质中提取所述油。从微生物细胞中提取含有PUFA的油的方法是昂贵的，其中一些需要能源消耗大的步骤，例如加热以干燥细胞，一些需要有机溶剂来回收PUFA油，另外一些需要化学品和酶来破坏细胞和乳液。加热可降解和氧化含有PUFA的油，且从而产生不良的味道。溶剂的使用需要昂贵的设备、用于溶剂回收的高能源成本和实施废物处理措施以减少对环境的负面影响。化学品和酶的使用增加了处理成本，并且还需要实施昂贵的废物处理程序。此外，大规模生产需要适当构造的设备和容器以处理大体积。它带来了另一项技术挑战，并进一步增加了处理成本。
因此，本发明的目的是提供一种从微生物细胞中提取含有PUFA的油的有效方法，所述方法使用较少能源和材料从而降低总体生产成本。本申请的进一步目的是提供一种获得高质量的含有PUFA的油的方法。
发明概述
本发明涉及一种增强含有裂解的产油微生物的发酵液的破乳的方法，其包括：a)从所述发酵液中去除水，其中所述含有裂解的产油微生物的发酵液的体积是其最初体积的60％以下；b)通过加热至60℃-110℃的温度使所述发酵液破乳。
在一些实施方案中，通过将破乳时间减少至不进行步骤a)时的破乳所需时间的至少1/3来增强所述破乳作用。在一些实施方案中，所述方法进一步包含步骤c)从所述发酵液中回收油。
在一些实施方案中，使用不使用溶剂的提取方法来实施所述油的回收。
在一些实施方案中，与不实施步骤a)时的相同的方法相比，回收的油量增加至少7％。
在一些实施方案中，步骤a)中的含有裂解的产油微生物的发酵液的体积减少至其最初体积的70％以下，且优选80％以下。
在一些实施方案中，在通过不高于110℃的温度下加热所述发酵液来实施步骤a)中的水的去除,所述温度优选在70℃至100℃之间，更优选在80℃和90℃之间。
在一些实施方案中，步骤b)包括添加碱化剂，优选苛性钠。
在一些实施方案中，将步骤b)中的所述发酵液的pH调节至pH值为5.5至12，优选7.0至12.0，优选9.5至10.5，且更优选9.7至10.2。
在一些实施方案中，步骤b)中的温度为85℃和95℃之间，且优选为约90℃。在一些实施方案中，任何前述权利要求的方法，其中将步骤b)中的温度维持至少一个小时、至少两个小时、至少三个小时和至少四个小时。在一些实施方案中，将步骤b)中的温度维持二十四小时至七十二小时，优选二十四小时至三十六小时。
本发明还涉及一种从含有产油微生物的发酵液中提取包含一种或多种多不饱和脂肪酸的微生物油的方法，其包含：(a)裂解所述发酵液中的产油微生物以形成裂解的细胞组合物；(b)从所述裂解的细胞组合物中去除水，其中将所述裂解的细胞组合物的体积减少至其最初体积的60％以下；(c)将在步骤(b)中获得的裂解的细胞组合物加热至60℃至110℃的温度；和(d)从所述裂解的细胞组合物中回收所述微生物油。
在一些实施方案中，步骤(b)中的裂解的细胞组合物的体积减少至其最初体积的70％以下，且优选80％以下。
在一些实施方案中，在通过不高于110℃的温度下加热所述发酵液来实施步骤(b)中的水的去除，所述温度优选在70℃至100℃之间，且更优选在80℃和90℃之间。
在一些实施方案中，步骤(c)包括添加碱化剂，优选苛性钠。在一些实施方案中，将步骤(c)中的裂解的细胞组合物的pH调节至pH值为5.5至12，优选7.0至12.0，优选9.5至10.5，且更优选9.7至10.2。
在一些实施方案中，步骤(c)中的温度为85℃和95℃之间，且优选为约90℃。
在一些实施方案中，将步骤(c)中的温度维持至少一个小时、至少两个小时、至少三个小时和至少四个小时。在一些实施方案中，将步骤(c)中的温度维持二十四小时至七十二小时，优选二十四小时至三十六小时。
本发明还涉及一种从含有产油微生物的发酵液中提取包含一种或多种多不饱和脂肪酸的微生物油的方法，其包括：(a)从所述发酵液中去除水，其中所述发酵液的体积减少至其最初体积的60％以下；(b)裂解所述发酵液中的产油微生物以形成裂解的细胞组合物；(c)将步骤(b)中获得的裂解的细胞组合物加热至60℃至110℃的温度；和(d)从所述裂解的细胞组合物中回收所述微生物油。
在一些实施方案中，步骤(a)中的发酵液的体积减少至其最初体积的70％以下，且优选80％以下。
在一些实施方案中，通过在不高于110℃的温度下加热所述发酵液来实施步骤(a)中的水的去除，所述温度优选在70℃至100℃之间，且更优选在80℃和90℃之间。
在一些实施方案中，步骤(c)包括添加碱化剂，优选苛性钠。在一些实施方案中，将步骤(c)中的所述裂解的细胞组合物的pH调节至pH值为5.5至12，优选7.0至12.0，优选9.5至10.5，且更优选9.7至10.2。
在一些实施方案中，步骤(c)中的温度为85℃和95℃之间，且优选为约90℃。
在一些实施方案中，将步骤(c)中的温度维持至少一个小时、至少两个小时、至少三个小时和至少四个小时。在一些其它实施方案中，将步骤(c)中的温度维持二十四小时至七十二小时，优选二十四小时至三十六小时。
在任一个上述实施方案中，所述产油微生物产生包含一种或多种多不饱和脂肪酸的微生物油。在一些实施方案中，所述多不饱和脂肪酸包含ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸和其混合物。在一些实施方案中，所述多不饱和脂肪酸包含二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(ARA)、γ-亚麻酸(GLA)、双高-γ-亚麻酸(DGLA)、十八碳四烯酸(SDA)和其混合物。
在一些实施方案中，所述微生物细胞是藻类、酵母、真菌、原生生物或细菌细胞。这些微生物细胞可以来自，例如隐甲藻属(Crypthecodinium)、被孢霉属(Mortierella)或破囊壶菌目(Thraustochytriales)。在一个实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌目。在一个实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)或其混合物。在另一个实施方案中，该微生物细胞来自高山被孢霉(Mortierella alpine)。
在上述实施方案中，所述裂解的细胞组合物包含液体、细胞碎片和微生物油。
在一些实施方案中，所述油包含以重量计至少15％的二十碳五烯酸。在其他实施方案中，所述油包含以重量计至少30％的二十二碳六烯酸。在其他实施方案中，所述油包含以重量计至少30％的花生四烯酸。
本发明还涉及通过上述的方法获得的油。本发明还涉及一种包含5％以下总多不饱和脂肪酸的去脂质的(delipidated)微生物生物质。
附图简述
合并在本说明书中并构成本说明书一部分的附图阐明了本发明的实施方案，并与说明书一起用于解释本发明的特征、优点和原理。在附图中：
图1是阐明在对全细胞发酵培养基进行巴氏灭菌后立即使用脱水(dewatering)步骤的不使用溶剂的提取方法的一个实施方案的工艺流程图。
图2是阐明在对全细胞发酵培养基中的细胞进行巴氏灭菌和裂解后使用脱水步骤的不使用溶剂的提取方法的一个实施方案的工艺流程图。
图3是通过所述脱水步骤处理的裂解的细胞组合物的照片，其显示聚结处理2小时后的分离。
图4是未通过所述脱水步骤处理的裂解的细胞组合物的照片，其显示聚结处理49小时后的分离。
图5显示了具有脱水步骤的实验的聚结期间的相组成。
图6显示了无脱水步骤的实验的聚结期间的相组成。
发明详述
本文中指定为示例性的实施方案旨在示例性说明性的而非限制性的。
基于碳链的长度和饱和特征对脂肪酸进行分类。存在于微生物油中的脂肪酸可以具有4至28个碳原子，并且基于链中存在的碳的数目，脂肪酸被命名为短链、中链或长链脂肪酸。当在碳原子之间不存在双键时，脂肪酸被命名为饱和脂肪酸；存在双键时，脂肪酸被命名为不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时，不饱和长链脂肪酸是单不饱和的；当存在一个以上双键时，不饱和长链脂肪酸是多不饱和的。
本文所述的微生物油是指包含一种或多种PUFA并且从微生物细胞中获得的油。
基于从脂肪酸的甲基末端开始的第一个双键的位置，对多不饱和脂肪酸(PUFA)进行分类；ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳上含有第一个双键，而ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳上含有第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(DHA)是一种链长为22个碳且具有6个双键的ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，通常被命名为“22:6n-3”。在一个实施方案中，所述PUFA选自ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸和其混合物。在另一个实施方案中，所述PUFA选自LC-PUFA。在更进一步的实施方案中，所述PUFA选自二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(ARA)、γ-亚麻酸(GLA)、双高-γ-亚麻酸(DGLA)、十八碳四烯酸(SDA)和其混合物。在另一个实施方案中，所述PUFA选自DHA、EPA和其混合物。在另一个实施方案中，所述PUFA选自DHA、ARA和其混合物。在进一步的实施方案中，所述PUFA是DHA。在进一步的实施方案中，所述PUFA是EPA。在另进一步的实施方案中，所述PUFA是ARA。
LU-PUFA是含有至少3个双键且链长为18个或更多个碳或20个或更多个碳的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFA包括但不限于双高-γ-亚麻酸(C20：3n-6)、花生四烯酸(C20：4n-6)(“ARA”)、二十二碳四烯酸或肾上腺酸(adrenic acid)(C22:4n-6)和二十二碳五烯酸(C22:5n-6)(“DPAn-6”)。ω-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20:3n-3)、二十碳四烯酸(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)(“EPA”)、二十二碳五烯酸(C22:5n-3)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3)。LC-PUFA还包括具有多于22个碳和4个或更多个双键的脂肪酸，其包括但不限于C24:6(n-3)和C28:8(n-3)。
PUFA可以是游离脂肪酸、盐、脂肪酸酯(如甲酯或乙酯)、单酰甘油(MAG)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)和/或磷脂(PL)的形式。
高度不饱和脂肪酸(HUFA)是含有4个或更多个不饱和碳-碳键的ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸。
如本文所用，“裂解的细胞组合物”是指包含与微生物油(来自所述裂解的细胞)和任选的含有液体(例如水)、营养素和微生物细胞的发酵液组合在一起的一种或多种裂解的细胞(包括细胞碎片和所述细胞的其他内容物)的组合物。术语“裂解(lyse)”和“裂解(lysing)”是指将所述微生物细胞的壁和/或膜破裂的方法。在一个实施方案中，通过进行选自机械处理、化学处理、酶促处理、物理处理及其组合的至少一种处理来裂解所述微生物细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括使包含所述微生物油的微生物细胞裂解以形成裂解的细胞组合物，其中所述裂解选自机械裂解、化学裂解、酶促裂解、物理裂解及其组合。
如本文所用，“细胞”是指含油的生物材料，例如源自产油微生物的生物材料。由微生物产生或从微生物细胞中获得的油被称为“微生物油”。在一个实施方案中，微生物油是指从所述微生物的生物质中提取的未进一步处理的粗制油。由藻类和/或真菌产生的油还分别称为海藻油和/或真菌油。
如本文所用，“微生物细胞”或“微生物”是指诸如藻类、细菌、真菌、酵母、原生生物及其组合的生物体，例如单细胞生物。在一些实施方案中，微生物细胞是真核细胞。微生物细胞包括但不限于金藻(golden algae)(例如，茸鞭生物界(Stramenopile)的微生物)；绿藻；硅藻；甲藻(dinoflagellates)(例如，包括隐甲藻属(Crypthecodinium)成员(诸如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii或C.cohnii))在内的甲藻纲(Dinophyceae)目的微生物)；破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微藻；酵母(子囊菌(Ascomycetes)或担子菌(Basidiomycetes))；毛囊菌属(Mucor)、被孢霉属(Mortierella)(包括但不限于高山被孢霉(Mortierella alpina)和Mortierella sect)、schmuckeri和腐霉属(Pythium)(包括但不限于Pythium insidiosum)的真菌。
在一个实施方案中，所述微生物细胞来自被孢霉属、隐甲藻属或破囊壶菌目。在更进一步的实施方案中，所述微生物细胞来自寇氏隐甲藻。在甚至更进一步的实施方案中，所述微生物细胞选自寇氏隐甲藻、高山被孢霉、破囊壶菌属、裂殖壶菌属及其混合物。
在更进一步的实施方案中，所述微生物细胞包括但不限于属于被孢霉属、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属、疫霉属(Phytophthora)、青霉属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉属、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属(Entomophthora)、Echinosporangium属和水霉属(Saprolegnia)的微生物。在另一个实施方案中，从来自被孢霉属的微生物细胞中获得ARA，所述被孢霉属包括但不限于长孢被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、Mortierella hygrophila、Mortierella alpine、Mortierella schmuckeri和小被孢霉(Mortierella minutissima)。在进一步的实施方案中，从来自长孢被孢霉IFO8570、微小被孢霉IF08571、Mortierella hygrophila IF05941、高山被孢霉IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70和CBS754.68及其突变体的微生物细胞中获得ARA。在更进一步的实施方案中，所述微生物细胞来自高山被孢霉。
在更进一步的实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌目的微藻，其包括但不限于破囊壶菌属(种包括arudimentale、aureum、benthicola、globosum、kinnei、motivum、multirudimentale、pachydermum、proliferum、roseum、striatum)；裂殖壶菌属(种包括aggregatum、limnaceum、mangrovei、minutum)、欧托(octosporum))。吾肯氏壶藻属(Ulkenia)(种包括amoeboidea、kerguelensis、minuta、profunda、radiate、sailens、sarkariana、schizochytrops、visurgensis、yorkensis)；Aurantiacochytrium属；Oblongichytrium属；Sicyoidochytium属；Parientichytrium属；Botryochytrium属及其组合物。在另一个实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌目。在另一个实施方案中，所述微生物细胞来自破囊壶菌属。在又一个实施方案中，所述微生物细胞来自裂殖壶菌属。在更进一步的实施方案中，所述微生物细胞选自破囊壶菌属、裂殖壶菌属或其混合物。
术语“约”旨在获取高于和低于所述数量的变化，其可以实现与所述数量基本相同的结果。
本发明提供用于增强含有裂解的产油微生物的发酵液的破乳的方法和体系。通过在从这种含有油的微生物中提取微生物油之前使所述发酵液脱水来实现所述增强。本发明还提供了通过在裂解发酵液中的细胞之前使所述发酵液脱水而从包含在发酵液中的产油微生物中提取微生物油的方法和体系。在随后的油提取步骤之前使发酵液脱水可具有许多优于常用的微生物油的不使用溶剂的提取方法(不包括任何脱水步骤)的优点。例如，本发明的方法优于先前的不使用溶剂的提取方法，因为1)在破乳步骤中加入少得多的盐或酶，甚至不加入盐或酶；2)在破乳步骤中时间缩短，3)产生更好的生物膳食(biomeal)最终产物，因为这种生物体含有更少的盐；和4)下游处理中可使用体积小得多的设备，例如更小的离心机和更小的处理容器罐。此外，减小的体积需要更少的时间和能源来处理样品，从而节省成本。
从产油微生物中获得微生物油的典型方法包括使能够产生所需油的微生物在发酵罐或池中生长，以产生含有这种油的微生物细胞生物质；且随后从所述生物质中提取所述油。一种提取油的方法涉及有机溶剂。它包括将生物质从所述生物质在其中生长的发酵液中分离；干燥所述微生物细胞生物质，然后使用有机溶剂(如己烷)提取所述微生物油，且随后通过蒸发去除所述有机溶剂，从而留下所述微生物油。或者，使用不使用溶剂的提取方法来提取油，其中不使用有机溶剂。典型的不使用溶剂的提取方法包括下列步骤：对含有细胞的发酵液进行巴氏灭菌或加热；裂解所述细胞以从所述细胞中释放微生物油以形成溶液形式的裂解的细胞组合物；用加热、盐和pH调节处理所述裂解的细胞组合物，以使所述油滴聚结并从溶液中去除乳液。然后进一步离心破乳的溶液，使油与溶液的其余物质分离。
在本发明的一个实施方案中，在巴氏灭菌步骤和细胞裂解步骤之后实施脱水步骤，其使得所述裂解的细胞组合物的水分含量显著降低。在另一个实施方案中，在巴氏灭菌步骤之后和细胞裂解步骤之前立即实施脱水步骤，其使得全细胞发酵液的水分含量显著降低。在这两个实施方案中，待处理的液体组合物的体积在随后的油提取步骤之前显著降低，从而实现了成本的降低和效率的提高。
使用一种方法而非另一种方法的选择取决于不使用溶剂的提取方法起始时发酵液的物理性质。如果在不使用溶剂的提取方法起始时发酵液的粘度低，则可在巴氏灭菌步骤之后立即进行额外的脱水步骤。如果在不使用溶剂的提取方法起始时发酵液的粘度高，则可以在巴氏灭菌步骤和细胞裂解步骤之后进行额外的脱水步骤。
在一些实施方案中，所述脱水步骤包含将全细胞发酵液或裂解的细胞组合物加热至至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、至少100℃、至少105℃或至少110℃。在其他实施方案中，所述脱水步骤包含将全细胞发酵液或裂解的细胞组合物加热至约70℃和约110℃之间，约70℃和约100℃之间，约80℃和约100℃之间或约90℃和约100℃之间。在其他实施方案中，所述脱水步骤包含将全细胞发酵液或裂解的细胞组合物加热至约85℃、约90℃或约95℃。
在一些实施方案中，将上述脱水步骤中的温度保持至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时，至少15小时，至少16小时，至少17小时，至少18小时、至少19小时，至少20小时，至少21小时，至少22小时，至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时、至少28小时、至少29小时或至少30小时。
在一些实施方案中，可以在具有蒸发器的系统中加热细胞和/或裂解的细胞组合物。在一些实施方案中，可以在具有蒸发器的系统中加热细胞和/或裂解的细胞组合物，使得通过蒸发去除存在于细胞和/或裂解的细胞组合物中的一部分水。
在一些实施方案中，所述方法包含在具有蒸发器的系统中加热全细胞发酵液或裂解的细胞组合物，以将所述全细胞发酵液或裂解的细胞组合物的体积(或重量)减少至在所述脱水步骤起始时全细胞发酵液或裂解细胞组合物的体积(或重量)的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方案中，所述方法包含在具有蒸发器的系统中加热全细胞发酵液或裂解的细胞组合物，以将所述全细胞发酵液或所述裂解的细胞组合物的体积(或重量)减少至在所述脱水步骤开始时全细胞发酵液或裂解细胞组合物的体积(或重量)的30％至80％、40％至80％、50％至80％、60％至80％、70％至80％、40％至75％、50％至75％、60％至75％、50％至70％，或55％至65％。
在一些实施方案中，裂解的细胞组合物是水包油乳液的形式，其包含连续水相和分散油相的混合物。
在一些实施方案中，裂解微生物细胞导致由细胞或细胞生物质中的内源性物质形成乳液，所述内源性物质包括但不限于蛋白质、磷脂、碳水化合物和其组合物。术语“乳液”和“乳化的”是指两个或更多个互不相容的相或层的混合物，其中一个相或层分散在另一个相或层中。术语“破坏(break)”，“崩裂(break-up)”，“破乳(demulsify)”，“破乳作用(demulsification)”，“破乳化(demulsifying)”和“破坏(breaking)”是指分离乳液的互不相容的相或层的方法。例如，在一些实施方案中，本发明的方法将含油的乳液从单相破坏为两相或更多相。在一些实施方案中，所述两相包括轻相和重相。在一些实施方案中，本发明的方法将含油的乳液破坏成至少三相。在一些实施方案中，所述三相是油相、乳液相和水相。在一些实施方案中，本发明的方法将含油的乳液破坏成至少四相。在一些实施方案中，所述四相是油相、乳液相、水相和固相。
所述方法进一步包含加热所述裂解且脱水的细胞组合物溶液以破坏所述乳液。在一些实施方案中，所述破乳步骤包含将所述裂解且脱水的细胞组合物溶液加热至至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、至少100℃、至少105℃或至少110℃。在其他实施方案中，所述破乳步骤包含将所述细胞或所述裂解的细胞组合物加热至约60℃和约110℃之间、约70℃和约100℃之间、约80℃和约100℃之间或约90℃和约100℃之间。在其他实施方案中，所述破乳步骤包含将所述细胞或所述裂解的细胞组合物加热至约85℃、约90℃或约95℃。
如上所述，在一个实施方案中，所述脱水步骤在巴氏灭菌步骤之后实施，从而有效地将全细胞发酵液中溶解的可溶性固体组分(如盐)凝聚(condense)。然后使所述脱水的全细胞发酵液中的细胞裂解以形成裂解的细胞组合物。在另一个实施方案中，所述脱水步骤在细胞裂解步骤后实施，从而有效地将溶解的可溶性固体组分(如盐)从所述裂解的细胞组合物中凝聚。在所述脱水步骤之后，所述裂解的细胞组合物中的盐浓度增加。
所述方法进一步包含在所述脱水步骤之前对所述细胞发酵液进行巴氏灭菌。在一个实施方案中，所述巴氏灭菌方法包含在60℃加热所述细胞至少1小时、至少1.5小时或至少2小时。在另一个实施方案中，所述巴氏灭菌方法包含在60-70℃之间的温度下加热所述细胞至少1小时、至少1.5小时或至少2小时。在另一个实施方案中，所述巴氏灭菌过程包含在(包括)40℃至(60℃或)70℃的温度下加热所述细胞不超过30分钟，或以至少0.5℃/分钟的速率加热所述细胞。在一个实施方案中，所述巴氏灭菌方法包含使用巴氏灭菌方案，使得温度(℃)对时间(分钟)曲线图下的面积低于6,000℃.分钟。在另一个实施方案中，所述巴氏灭菌方法包括使用巴氏灭菌方案，使得温度(℃)对时间(分钟)曲线图下的面积低于13,000℃.分钟。时间对温度曲线图下的面积给出了在巴氏灭菌过程中加热所述细胞所消耗的能量。
本发明方法的一个特别的优点是它可以加快破乳步骤。在一个实施方案中，与不实施所述脱水步骤时相比，进行脱水步骤时进行破乳过程的时间减少。在另一个实施方案中，实现相同破乳效果的时间减少至不实施所述脱水步骤的方法所需时间的至少60％、至少45％或至少40％。在另一个实施方案中，与不实施所述脱水步骤时相比，当进行所述脱水步骤时油提取的总时间减少。在另一个实施方案中，与不实施所述脱水步骤时相比，当实施所述脱水步骤时，用于油提取的总能源消耗减少。
在一些实施方案中，将所述破乳步骤中的温度保持至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、在至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、在至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时、至少28小时、至少29小时或至少30小时。在一些实施方案中，将上述破乳步骤中的温度保持10小时和36小时之间、10小时和12小时之间、10小时和14小时之间、10小时和24小时之间、12小时和36小时之间、14小时和36小时之间、16小时和36小时之间、18小时和36小时之间、20小时和36小时之间、22小时和36小时之间、24小时和36小时之间、26小时和36小时之间、28小时和36小时之间、16小时和26小时之间、18小时和26小时之间、20小时和26小时之间、22小时和26小时之间、22小时和24小时之间、23小时和25小时之间、30小时和36小时之间或30小时和34小时之间。
在一些实施方案中，所述破乳步骤进一步包含pH调节。在一些实施方案中，将所述pH调节至7至12之间、7.5至11.5之间、9.5至11.5之间，优选10.0至11.0之间，且更优选10.3至10.7之间。
本发明方法的另一个优点是它可以减少或消除在破坏乳液中使用盐。本发明的方法进一步具有在裂解所述细胞时使用很少盐或不使用盐的益处。在先前的不使用溶剂的提取方法的破乳步骤中，添加盐以帮助破坏乳液。此外，有时在裂解步骤中添加过量的细胞壁破壁酶，以在裂解步骤期间和之后帮助破坏乳液。如以上段落中所公开的，所述脱水步骤能够增加全细胞发酵液或裂解的细胞组合物中盐的浓度。这减少了在破乳步骤中破坏乳液所需的盐量或完全消除了这种需求。在一个实施方案中，在整个油提取方法中使用2％wt以下的盐，特别是氯化钠。在另一个实施方案中，在整个油提取方法中使用1％wt以下的盐，特别是氯化钠。在另一个实施方案中，在整个油提取过程中使用0.5％wt以下的盐，特别是氯化钠。在另一个实施方案中，在整个油提取方法中不使用盐。在一个实施方案中，使用1％wt以下的细胞壁破壁酶。在另一个实施方案中，使用0.5％wt以下的细胞壁破壁酶。在另一个实施方案中，使用0.15％wt以下的细胞壁破壁酶。在另一个实施方案中，不使用细胞壁破壁酶。
本发明方法的另一个优点是它减小了油提取方法中所需的容器的体积。减小的容器体积具有设备成本更低、能源使用更少和混合效率更高的优点。在本发明的一个实施方案中，所述破乳步骤期间使用的容器减小至如果不实施所述脱水步骤所需的容器的至少50％、至少60％或至少70％。由于容器体积的减小，还可以降低总搅拌功率。在另一个实施方案中，所述破乳步骤中使用的容器的搅拌功率降低至如果不实施所述脱水步骤所消耗的其原始功率量的至少50％、至少60％或至少70％。
本发明方法的另一个优点有助于所述破乳步骤，其导致产量提高和/或更短的破乳时间。不受理论束缚，认为为了发生破乳，乳化的油滴需要聚结成更大的液滴。随着油滴变大，更容易通过离心将油与水相分离。通过增加油滴度(油L/发酵液L)，油滴在发酵液中更浓缩并且可以更容易地和有效地聚结以形成更大的液滴并最终通过离心与水相分离。除了使油滴更靠近在一起之外，认为脱水方法也具有增加发酵液中盐浓度的作用，其有助于破坏乳液。在一个实施方案中，与不实施所述脱水步骤的相同方法相比，使用上述脱水方法回收的油量增加约5-9％。在一个实施方案中，与不实施所述脱水步骤的相同方法相比，使用上述脱水方法回收的油量增加至少7％。在另一个实施方案中，使用上述脱水方法回收的油量从约85％增加至90-94％。在另一个实施方案中，进行破乳步骤的时间量已经减少了约12个小时。在另一个实施方案中，进行破乳步骤的时间量已经从约36个小时减少至约24个小时。
本文公开了通过本文描述的任何方法获得的微生物油或生物膳食(biomeal)。
本文公开了可通过本文公开的任何方法从微生物细胞中获得的微生物油。在一些实施方案中，所述油包含以重量计至少15％的二十碳五烯酸。在一些实施方案中，所述油包含以重量计至少30％的二十二碳六烯酸。在一些实施方案中，所述油包含以重量计至少30％的花生四烯酸。
在一个实施方案中，通过本文所述的任何方法获得和/或回收的微生物油是粗制油。在另一个实施方案中，本文所述的油是精制油。“粗制油”是从微生物细胞获得的无进一步处理的油。“精制油”是藉由精制、脱色及/或除臭的标准制程处理粗制油而制得的油。参见例如美国专利号5,130,242。在一些实施方案中，精制包括但不限于基础精制、脱胶、酸处理、碱处理、冷却、加热、脱色、除臭、脱酸和其组合。
在一些实施方案中，使用本发明的方法获得的油包含一种或多种PUFA。在一些实施方案中，所述油包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％PUFA(以PUFA重量计)。在一些实施方案中，所述油包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％DHA(以DHA重量计)，和/或至少10％、至少15％或至少20％DPA n-6(以DPA n-6重量计)，和/或至少10％、至少15％、至少20％EPA、至少25％EPA、至少30％EPA、至少35％EPA、至少40％EPA、至少45％EPA或至少50％EPA(以EPA重量计)，和/或至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％ARA(以ARA重量计)。在一些实施方案中，油包含50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、15％以下、10％以下或5％以下EPA(以EPA重量计)。在一些实施方案中，油包含50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、15％以下、10％以下或5％以下DHA(以DHA重量计)。在一些实施方案中，油包含以重量计10％以下、5％以下、2％以下、1％以下或0.5％以下的甾醇。
在一些实施方案中，上述油包含以重量计至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或50％至95％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、60％至95％、60％至90％、60％至85％、70％至95％、70％至90％、70％至85％、75％至95％、75％至90％或75％至85％的甘油三酯。
在一些实施方案中，上述甘油三酯包含以重量计至50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少15％、至少10％或至少5％的EPA。在一些实施方案中，所述甘油三酯包含以重量计至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的DHA。在一些实施方案中，所述甘油三酯包含以重量计至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％的ARA。
在一些实施方案中，使用本发明方法获得的油包含以重量计至少40％、至少50％或至少60％的DHA，和/或以重量计15％以下、10％以下或8％以下的EPA。在一些实施方案中，上述油包含以重量计至少70％、80％、90％或95％的甘油三酯。在一个实施方案中，所述微生物油是粗制油。在另一个实施方案中，所述微生物油是精制油。
在一些实施方案中，使用本发明方法获得的油包含以重量计至少30％、至少35％或至少40％的DHA，和/或以重量计至少10％、至少15％或至少20％的EPA。在一些实施方案中，上述油包含以重量计至少70％、80％、90％或95％的甘油三酯。在一个实施方案中，所述微生物油是粗制油。在另一个实施方案中，所述微生物油是精制油。
在一些实施方案中，使用本发明方法获得的油包含以重量计至少40％、至少45％或至少50％的DHA，和/或以重量计25％以下、20％以下或15％以下的DPAn-6。在一些实施方案中，上述油包含以重量计至少70％、80％、90％或95％的甘油三酯。在一个实施方案中，所述微生物油是粗制油。在另一个实施方案中，所述微生物油是精制油。
在一些实施方案中，使用本发明方法获得的油包含以重量计至少55％、至少60％或至少65％的DHA。在一些实施方案中，上述油包含以重量计至少70％、80％、90％或95％的甘油三酯。在一个实施方案中，所述微生物油是粗制油。在另一个实施方案中，所述微生物油是精制油。
在一些实施方案中，使用本发明的方法获得的油包含以重量计至少30％、至少35％或至少40％的DHA，和/或以重量计5％以下、2％以下或1％以下的DPAn-6。在一些实施方案中，上述油包含以重量计至少70％、80％、90％或95％的甘油三酯。在一个实施方案中，所述微生物油是粗制油。在另一个实施方案中，所述微生物油是精制油。
在一些实施方案中，使用本发明的方法获得的油包含以重量计至少25％、至少30％或至少35％的DHA，和/或以重量计至少10％、至少15％或至少20％的EPA，和/或以重量计10％以下、5％以下或3％以下的DPAn-6，和/或以重量计15％以下、10％以下或7％以下的DPAn-3。在一些实施方案中，上述油包含以重量计至少70％、80％、90％或95％的甘油三酯。在一个实施方案中，所述微生物油是粗制油。在另一个实施方案中，所述微生物油是精制油。
在一些实施方案中，使用本发明方法获得的油包含以重量计至少40％、至少45％或至少50％的ARA。在一些实施方案中，上述油包含以重量计至少70％、80％、90％或95％的甘油三酯。在一个实施方案中，所述微生物油是粗制油。在另一个实施方案中，所述微生物油是精制油。
本发明的方法允许非常有效地从生物质中提取油。通过使用本发明的方法，可以从所述生物质中移出更多的油，从而少得多的油残留在去脂质的生物质中。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含10％以下的总脂肪酸的去脂质的生物质。在另一个实施方案中，本发明涉及包含5％以下的总脂肪酸的去脂质的生物质。
用于本发明的微生物细胞的有效培养条件包括但不限于允许产油的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基是指通常培养微生物细胞(例如破囊壶菌目微生物细胞)的任何培养基。此类培养基通常包含具有可吸收的碳源、氮源和磷源以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养素(例如维生素)的水性培养基。用于本发明的微生物细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和培养皿中培养。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何方法获得的油、去脂质的生物质或其组合可以直接用作任何非人类动物(诸如其产品(如肉、奶或蛋)被人类食用的那些)的食物或食物成分、饲料或饲料补充剂；和食品补充剂。术语“动物”是指属于动物界的任何生物，且包括任何人类动物以及由其生产产品(如奶、蛋、禽肉、牛肉、猪肉、羊肉和鱼肉)的非人类动物。在一些实施方案中，所述油和/或生物质可用于喂养被认为是海产食品的海洋动物。海产食品源自但不限于鱼、虾和贝类。术语“产品”包括源自这些动物的任何产品，包括但不限于肉、蛋、奶或其他产品。当将所述油和/或生物质喂给这些动物时，多不饱和油可以被掺入到这些动物的肉、奶、蛋或其他产品中以增加这些油在其中的含量。
实施例
实施例1
如图1和2所示，可以在微生物细胞裂解之前、期间或之后将所述微生物细胞悬浮液脱水。下面解释说明了细胞裂解后脱水的一个具体的实施例。
将未洗涤的含有微生物细胞(裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.))的细胞培养液(141.8kg)在60℃巴氏灭菌1小时。巴氏灭菌后，pH为7.4，且总固体含量为16.7％。将培养液平均分配并转移至两个100升搅拌罐中。当将温度控制在60℃时，以基于细胞培养液重量0.15％的量加入酶(可购自诺维信(Franklinton,NC))。将所述培养液以200RPM的搅拌速度保持2小时，用20％NaOH溶液将pH控制在7.5。之后，将所述培养液温度升至90℃，所有顶部空间端口打开以进行培养液蒸发。约13小时后，将两个罐中的培养液合并，并继续蒸发另一个8小时，直至培养液中的总固体含量达到36.5％。总蒸发时间为21小时。所述发酵液的体积减少了54.4％。
在下一步骤中，实施破乳过程。使用20％NaOH溶液将pH从5.8调节至10.5。使用7.6kg NaOH溶液。将培养液保持在90℃，搅拌速度为200rpm，除了小的蒸汽排出管线外，所有的端口都关闭。8小时后，pH降至9.5，并加入0.77kg的20％NaOH溶液使pH升高到10.0。约26小时后，用3.9kg 3N H2SO4将pH调节至7.6。将所述温度降至80℃。上述破乳过程产生油相、乳液相和水相的相分离。
下一步，通过离心(Alfa Laval Disc Stack Centrifuge,LAPX 404/Clara20)将油从所述裂解的细胞组合物中分离。提取率为91.61％。与先前的没有脱水步骤的实验相比，进行破乳步骤的时间量已减少1/2或减少24小时。
实施例2
将未洗涤的含有微生物细胞(裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.))的细胞培养液(157.4kg)在60℃巴氏灭菌1小时。然后将培养液的pH调节至7.5，并以基于细胞培养液重量0.15％的量加入酶(可购自诺维信(Franklinton,NC))。将培养液以140RPM的速度搅拌，并将温度保持在60℃2小时。2小时后，将裂解的细胞组合物加热至90℃并使其从16.9％的初始总固体含量蒸发至30.5％的最终总固体含量。这产生了87.2kg的含有微生物油和细胞碎片的浓缩培养液。体积减少量为44.5％。通过添加2.6kg的50％NaOH将裂解且浓缩的细胞组合物的pH调节至10.5。以140RPM搅拌培养液保持24小时。在保持期间，当pH值降至9以下时用NaOH进行一次额外的pH调节，以使pH值恢复到10。在聚结期结束时，用2.8kg的3N H2SO4将pH从9.7调节至8.0，并将温度降至80℃。通过离心(Alfa Laval Disc StackCentrifuge,LAPX 404/Clara 20)将已经形成的粗制油相从所述裂解的细胞组合物中分离。提取率为91.8％。
如图3中所示的时间趋势所证明的，通过包括脱水步骤处理的发酵液在聚结处理后的仅仅2小时内就显示出良好的油分离。
当与不使裂解的细胞组合物脱水的对照实验比较时(参见图4)，已经显示出在与重相分离之前乳液相持续了更长的时间。乳液中的一些与游离油混合并最终到离心轻相中，其形成具有高水分含量的油并且需要进一步的精制步骤。
评估了游离油相、乳液相和水相的体积，并计算每个相相对于总体积的百分比以显示油聚结的进展。比较图5和图6，它清楚地证明了脱水步骤的益处。没有脱水步骤的情况下，游离油相在26小时时仅是总体积的2％(图6)，而在具有脱水步骤的情况下，游离油相在2小时时已经是总体积的15％(图5)。在具有脱水步骤的实验中，由于水的减少，油浓度大约增加了一倍，在聚结结束时油相的体积是总体积的18％，而对于没有脱水步骤的实验，结束时游离油相的体积仅为总体积的8％。

Claims (45)

1.一种增强含有裂解的产油微生物的发酵液的破乳的方法，其包括：
a)从所述发酵液中去除水，其中所述含有裂解的产油微生物的发酵液的体积是其最初体积的60％以下；和
b)通过加热至60℃至110℃的温度使所述发酵液破乳。
2.权利要求1的方法，其中通过将破乳时间减少至不实施步骤a)时的破乳所需时间的至少1/3来增强所述破乳。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其进一步包括c)从所述发酵液中回收油。
4.权利要求3的方法，其中在不使用溶剂的情况下实施所述油的回收。
5.权利要求4的方法，其中与不实施步骤a)时的相同的方法相比，回收的油量增加至少7％。
6.前述任一权利要求的方法，其中步骤a)中的所述含有裂解的产油微生物的发酵液的体积减少至其最初体积的70％以下，优选80％以下。
7.前述任一权利要求的方法，其中通过在不高于110℃的温度下加热所述发酵液来实施步骤a)中的水的去除,所述温度优选70℃至100℃之间，更优选在80℃至90℃之间。
8.前述任一权利要求的方法，其中步骤b)包括添加碱化剂，优选苛性钠。
9.权利要求8的方法，其中将所述发酵液的pH调节至pH值为5.5至12，优选7.0至12.0，优选9.5至10.5，更优选9.7至10.2。
10.前述任一权利要求的方法，其中步骤b)中的温度为85℃与95℃之间，优选为约90℃。
11.前述任一权利要求的方法，其中将步骤b)中的温度维持至少一个小时、至少两个小时、至少三个小时和至少四个小时。
12.权利要求8的方法，其中将步骤b)中的温度维持二十四小时至七十二小时，优选二十四小时至三十六小时。
13.一种从含有产油微生物的发酵液中提取包含一种或多种多不饱和脂肪酸的微生物油的方法，其包括：
(a)裂解所述发酵液中的产油微生物以形成裂解的细胞组合物；
(b)从所述裂解的细胞组合物中去除水，其中将所述裂解的细胞组合物的体积减少至其最初体积的60％以下；
(c)将步骤(b)中获得的裂解的细胞组合物加热至60℃至110℃的温度；和
(d)从所述裂解的细胞组合物中回收所述微生物油。
14.权利要求13的方法，其中将步骤(b)中的裂解的细胞组合物的体积减少至其最初体积的70％以下，优选80％以下。
15.权利要求13或权利要求14的方法，其中通过在不高于110℃的温度下加热所述裂解的细胞组合物来实施步骤(b)中水的去除，所述温度优选70℃至100℃之间，更优选80℃与90℃之间。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中步骤(c)包括添加碱化剂，优选苛性钠。
17.权利要求16的方法，其中将所述裂解的细胞组合物的pH调节至pH值为5.5至12，优选7.0至12.0，优选9.5至10.5，更优选9.7至10.2。
18.权利要求13-17任一项的方法，其中步骤(c)中的温度为85℃与95℃之间，优选为约90℃。
19.权利要求13-18任一项的方法，其中将步骤(c)中的温度维持至少一个小时、至少两个小时、至少三个小时和至少四个小时。
20.权利要求19的方法，其中将步骤(c)中的温度维持二十四小时至七十二小时，优选二十四小时至三十六小时。
21.一种从含有产油微生物的发酵液中提取包含一种或多种多不饱和脂肪酸的微生物油的方法，其包括：
(a)从所述发酵液中去除水，其中将所述发酵液的体积减少至其最初体积的60％以下；
(b)裂解所述发酵液中的产油微生物以形成裂解的细胞组合物；
(c)将步骤(b)中获得的裂解的细胞组合物加热至60℃至110℃的温度；和
(d)从所述裂解的细胞组合物中回收所述微生物油。
22.权利要求21的方法，其中将步骤(a)中的发酵液的体积减少至其最初体积的70％以下，优选80％以下。
23.权利要求21或权利要求22的方法，其中通过在不高于110℃的温度下加热所述发酵液来实施步骤(a)中的水的去除，所述温度优选70℃至100℃之间，更优选80℃与90℃之间。
24.权利要求21-23的方法，其中步骤(c)包括添加碱化剂，优选苛性钠。
25.权利要求24的方法，其中将所述裂解的细胞组合物的pH调节至pH值为5.5至12，优选7.0至12.0，优选9.5至10.5，更优选9.7至10.2。
26.前述权利要求21-24任一项的方法，其中步骤(c)中的温度为85℃与95℃之间，优选为约90℃。
27.前述权利要求21-25任一项的方法，其中将步骤(c)中的温度维持至少一个小时、至少两个小时、至少三个小时和至少四个小时。
28.权利要求27的方法，其中将步骤(c)中的温度维持二十四小时至七十二小时，优选二十四小时至三十六小时。
29.前述任一权利要求的方法，其中所述产油微生物产生包含一种或多种多不饱和脂肪酸的微生物油。
30.权利要求29的方法，其中所述多不饱和脂肪酸包含ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸和其混合物。
31.权利要求29的方法，其中所述多不饱和脂肪酸包含二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(ARA)、γ-亚麻酸(GLA)、双高-γ-亚麻酸(DGLA)、十八碳四烯酸(SDA)和其混合物。
32.权利要求31的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。
33.权利要求31的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)。
34.权利要求31的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)。
35.前述任一权利要求的方法，其中所述微生物细胞是藻类、酵母、真菌、原生生物或细菌细胞。
36.前述任一权利要求的方法，其中所述微生物细胞来自隐甲藻属(Crypthecodinium)、被孢霉属(Mortierella)或破囊壶菌目(Thraustochytriales)。
37.权利要求36的方法，其中所述微生物细胞来自破囊壶菌目。
38.权利要求37的方法，其中所述微生物细胞来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)或其混合物。
39.权利要求36的方法，其中所述微生物细胞来自高山被孢霉(Mortierella alpine)。
40.权利要求13-39任一项的方法，其中所述裂解的细胞组合物包含液体、细胞碎片和微生物油。
41.权利要求40的方法，其中所述油包含以重量计至少15％的二十碳五烯酸。
42.权利要求40或权利要求41的方法，其中所述油包含以重量计至少30％的二十二碳六烯酸。
43.权利要求42的方法，其中所述油包含以重量计至少30％的花生四烯酸。
44.一种通过前述任一权利要求的方法获得的油。
45.一种去脂质的微生物生物质，其包含5％以下的总多不饱和脂肪酸。
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