JP6947810B2 - 油糧微生物を含む発酵ブロスから多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を抽出するための方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［関連出願の相互参照］
［0001］本出願は、その開示内容全体を本明細書に援用する、２０１６年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／３６１，７７０号明細書の出願日の利益を主張する。

［背景］
［0002］多くの有益な栄養素の食事摂取量を増やすことは望ましい。特に有益な栄養素として、オメガ３およびオメガ６長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）などの脂肪酸およびそれらのエステルが挙げられる。現在主に魚油または微生物油から得られる長鎖オメガ３およびオメガ６脂肪酸は、ヒトの食事の必須要素である。

［0003］乱獲問題のため、ヒトにおける健康効果を証明しているエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのオメガ脂肪酸の持続可能な代替源が求められている。そうしたオメガ３脂肪酸の代替源は、養殖魚がそのオメガ３脂肪酸を野生の微細藻類または海産植物プランクトンではなく、魚飼料中のサプリメントから摂るという事実から、魚飼料にも必要とされる。

［0004］栄養製品および動物用飼料に使用される脂質は、微生物により産生され得る。藻類で脂質を製造するには、たとえば、藻類を増殖すること、およびそれから細胞内脂質を抽出することが含まれ得る。ＰＵＦＡ含有脂質の優れた供給源は、数ある微生物の中でもヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の藻類株、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属の藻類株またはモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の真菌株などの油糧微生物由来である。

［0005］微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を得るための工業規模のプロセスでは、発酵槽または池で所望の油を産生できる微生物を増殖して微生物細胞バイオマスを製造すること、およびその後細胞バイオマスから油を抽出することが行われる。微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を抽出するためのプロセスは、費用がかかり、細胞を乾燥させるための熱などエネルギー集約的なステップを必要とするものもあれば、ＰＵＦＡ油を回収するための有機溶媒を必要とするものもあり、さらに細胞およびエマルションを破壊するための化学物質および酵素を必要とするものもある。熱は、ＰＵＦＡ含有油を分解および酸化し、したがって望ましくない味を生じることがある。溶媒の使用には、高価な装置、溶媒回収のための高いエネルギー費用および環境への悪影響を低下させるための廃棄物処理措置の実行が必要になる。化学物質および酵素の使用には、処理費用を増加させ、広範な廃棄物処分手順の実行も必要とされる。さらに、大規模生産には、装置および容器を、大きな体積を取り扱うのに好適的に構築することも求められる。それは、なおもう１つの技術的な課題であり、処理費用をさらに増加させる。

［0006］よって、より少ないエネルギーおよび物質を用いて微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を抽出するための効率的な方法を提供し、引いては全体的な生産費用を低下させることが本発明の目的であった。高品質のＰＵＦＡ含有油を得るための方法を提供することが、さらなる本出願の目的であった。

［発明の概要］
［0007］本発明は、溶解した油糧微生物を含む発酵ブロスの解乳化を促進するための方法であって、ａ）発酵ブロスから水を除去する（溶解した油糧微生物を含む発酵ブロスの体積は、その当初の体積の６０％未満である）こと；およびｂ）６０℃〜１１０℃の温度に加熱することにより発酵ブロスを解乳化することを含む方法を対象とする。

［0008］いくつかの実施形態では、解乳化は、ステップａ）が行われないときの解乳化に必要とされる時間の少なくとも１／３に解乳化の時間を短縮することにより促進される。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップｃ）発酵ブロスから油を回収することをさらに含む。

［0009］いくつかの実施形態では、油の回収は、無溶媒抽出法を用いて行われる。

［0010］いくつかの実施形態では、回収される油の量は、ステップａ）が行われないときの同じ方法と比較して少なくとも７％増加する。

［0011］いくつかの実施形態では、ステップａ）の溶解した油糧微生物を含む発酵ブロスの体積は、その当初の体積の７０％未満、好ましくは８０％未満に減少する。

［0012］いくつかの実施形態では、ステップａ）の水の除去は、発酵ブロスを１１０℃以下、好ましくは７０℃〜１００℃、一層好ましくは８０℃〜９０℃の温度で加熱することにより行われる。

［0013］いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、アルカリ化剤、好ましくは苛性ソーダを加えることを含む。

［0014］いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の発酵ブロスのｐＨは、５．５〜１２、好ましくは７．０〜１２．０、好ましくは９．５〜１０．５、一層好ましくは９．７〜１０．２のｐＨ値に調整される。

［0015］いくつかの実施形態では、ステップｂ）の温度は、８５℃〜９５℃、好ましくは約９０℃である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）の温度は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間および少なくとも４時間維持される、先行するいずれかの請求項に記載の方法。いくつかの実施形態では、ステップｂ）の温度は、２４〜７２時間、好ましくは２４〜３６時間維持される。

［0016］本発明はさらに、油糧微生物を含む発酵ブロスから１種または複数種の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を抽出するための方法であって、（ａ）溶解細胞組成物を形成するため、発酵ブロス中の油糧微生物を溶解すること；（ｂ）溶解細胞組成物から水を除去する（溶解細胞組成物の体積は、その当初の体積の６０％未満に減少する）こと；（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた溶解細胞組成物を６０℃〜１１０℃の温度に昇温すること；および（ｄ）微生物油を溶解細胞組成物から回収することを含む方法も対象とする。

［0017］いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の溶解細胞組成物の体積は、その当初の体積の７０％未満、好ましくは８０％未満に減少する。

［0018］いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の水の除去は、発酵ブロスを１１０℃以下、好ましくは７０℃〜１００℃、一層好ましくは８０℃〜９０℃の温度で加熱することにより行われる。

［0019］いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、アルカリ化剤、好ましくは苛性ソーダを加えることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の溶解細胞組成物のｐＨは、５．５〜１２、好ましくは７．０〜１２．０、好ましくは９．５〜１０．５、一層好ましくは９．７〜１０．２のｐＨ値に調整される。

［0020］いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、８５℃〜９５℃、好ましくは約９０℃である。

［0021］いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間および少なくとも４時間維持される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、２４〜７２時間、好ましくは２４〜３６時間維持される。

［0022］本発明はさらに、油糧微生物を含む発酵ブロスから１種または複数種の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を抽出するための方法であって、（ａ）発酵ブロスから水を除去する（発酵ブロスの体積は、その当初の体積の６０％未満に減少する）こと；（ｂ）溶解細胞組成物を形成するため、発酵ブロス中の油糧微生物を溶解すること；（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた溶解細胞組成物を６０℃〜１１０℃に温度に昇温すること；および（ｄ）微生物油を溶解細胞組成物から回収することを含む方法も対象とする。

［0023］いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の発酵ブロスの体積は、その当初の体積の７０％未満、好ましくは８０％未満に減少する。

［0024］いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の水の除去は、発酵ブロスを１１０℃以下、好ましくは７０℃〜１００℃、一層好ましくは８０℃〜９０℃の温度で加熱することにより行われる。

［0025］いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、アルカリ化剤、好ましくは苛性ソーダを加えることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の溶解細胞組成物のｐＨは、５．５〜１２、好ましくは７．０〜１２．０、好ましくは９．５〜１０．５、一層好ましくは９．７〜１０．２のｐＨ値に調整される。

［0026］いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、８５℃〜９５℃、好ましくは約９０℃である。

［0027］いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間および少なくとも４時間維持される。いくつかの他の実施形態では、ステップ（ｃ）の温度は、２４〜７２時間、好ましくは２４〜３６時間維持される。

［0028］上述の実施形態のいずれも、油糧微生物は、１種または複数種の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を産生する。いくつかの実施形態では、多価不飽和脂肪酸は、オメガ３脂肪酸、オメガ６脂肪酸およびそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモガンマリノレン酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびそれらの混合物を含む。

［0029］いくつかの実施形態では、微生物細胞は、藻類細胞、酵母細胞、真菌細胞、プロテスト細胞または細菌細胞である。そうした微生物細胞は、たとえば、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目由来であってもよい。一実施形態では、微生物細胞は、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目由来である。一実施形態では、微生物細胞は、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはそれらの混合物由来である。別の実施形態では、微生物細胞は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）由来である。

［0030］上記の実施形態では、溶解細胞組成物は、液体、細胞片および微生物油を含む。

［0031］いくつかの実施形態では、油は、少なくとも１５重量％エイコサペンタエン酸を含む。他の実施形態では、油は、少なくとも３０重量％ドコサヘキサエン酸を含む。他の実施形態では、油は、少なくとも３０重量％アラキドン酸を含む。

［0032］本発明はさらに、上述のプロセスにより得られた油も対象とする。本発明はさらに、５％未満総多価不飽和脂肪酸を含む脱脂微生物バイオマスも対象とする。

［0033］本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明の実施形態を例証するもので、本説明と共に本発明の特徴、利点および原理を説明するのに役立つものである。

図１は、全細胞発酵培地を低温殺菌した直後に脱水ステップを用いた無溶媒抽出法の一実施形態を図示するプロセスフローダイアグラムである。 図２は、全細胞発酵培地中の細胞を低温殺菌し溶解した後に脱水ステップを用いた無溶媒抽出法の一実施形態を図示するプロセスフローダイアグラムである。 図３は、脱水ステップにより処理した溶解細胞組成物の写真であり、合一処理の２時間後の分離を示す。 図４は、脱水ステップにより処理しなかった溶解細胞組成物の写真であり、合一処理の４９時間後の分離を示す。 図５は、脱水ステップを用いた実験の合一処理中の相組成を示す 図６は、脱水ステップを用いない実験の合一処理中の相組成を示す。

［詳細な説明］
［0040］適例として本明細書に示した実施形態は、例示を意図しており、限定を意図するものではない。

［0041］脂肪酸は、炭素鎖の長さおよび飽和の特徴に基づき分類される。微生物油に存在する脂肪酸は、４〜２８個の炭素原子を有することがあり、鎖中に存在する炭素の数に基づき短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸または長鎖脂肪酸と呼ばれる。脂肪酸は、炭素原子間に二重結合が存在しない場合、飽和脂肪酸と呼ばれ、二重結合が存在する場合、不飽和脂肪酸と呼ばれる。不飽和長鎖脂肪酸は、二重結合が１つしか存在しない場合、一価不飽和であり、２つ以上の二重結合が存在する場合、多価不飽和である。

［0042］本明細書に記載の微生物油とは、１種または複数種のＰＵＦＡを含み、微生物細胞から得られる油をいう。

［0043］多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、脂肪酸のメチル末端からの最初の二重結合の位置に基づき分類され、オメガ３（ｎ−３）脂肪酸は、３番目の炭素に最初の二重結合を含むのに対し、オメガ６（ｎ−６）脂肪酸は、６番目の炭素に最初の二重結合を含む。たとえば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、２２個の炭素鎖長および６つの二重結合を有するオメガ３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）であり、多くの場合、「２２：６ｎ−３」と表される。一実施形態では、ＰＵＦＡは、オメガ３脂肪酸、オメガ６脂肪酸およびそれらの混合物から選択される。別の実施形態では、ＰＵＦＡは、ＬＣ−ＰＵＦＡから選択される。なおさらなる実施形態では、ＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモガンマリノレン酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびそれらの混合物から選択される。別の実施形態では、ＰＵＦＡは、ＤＨＡ、ＥＰＡおよびそれらの混合物から選択される。別の実施形態では、ＰＵＦＡは、ＤＨＡ、ＡＲＡおよびそれらの混合物から選択される。さらなる実施形態では、ＰＵＦＡはＤＨＡである。さらなる実施形態では、ＰＵＦＡはＥＰＡである。なおさらなる実施形態では、ＰＵＦＡはＡＲＡである。

［0044］ＬＣ−ＰＵＦＡは、少なくとも３つの二重結合を含み、１８個以上の炭素または２０個以上の炭素の鎖長を有する脂肪酸である。オメガ６系列のＬＣ−ＰＵＦＡとして、以下に限定されるものではないが、ジ−ホモ−ガンマリノール酸（Ｃ２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）（「ＡＲＡ」）、ドコサテトラエン酸またはアドレン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）およびドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−６）（「ＤＰＡｎ−６」）が挙げられる。オメガ３系列のＬＣ−ＰＵＦＡとしては、以下に限定されるものではないが、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）（「ＥＰＡ」）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６ｎ−３）が挙げられる。ＬＣ−ＰＵＦＡは、２２個を超える炭素および４つ以上の二重結合を有する脂肪酸、以下に限定されるものではないが、Ｃ２４：６（ｎ−３）およびＣ２８：８（ｎ−３）をさらに含む。

［0045］ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸、塩、脂肪酸エステル（たとえばメチルまたはエチルエステル）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）および／またはリン脂質（ＰＬ）の形態であってもよい。

［0046］高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、４つ以上の不飽和炭素−炭素結合を含むオメガ３および／またはオメガ６多価不飽和脂肪酸である。

［0047］本明細書で使用する場合、「溶解細胞組成物」とは、微生物油（溶解細胞由来の）と共に、細胞片および細胞の他の内容物を含む１つまたは複数の溶解細胞と、任意選択的に、液体（たとえば、水）、栄養素および微生物細胞を含む発酵ブロスとを含む組成物をいう。「溶解する」および「溶解」という用語は、微生物細胞の壁および／または膜が破裂するプロセスをいう。一実施形態では、微生物細胞は、機械的、化学的、酵素的、物理的およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの処理を施すことにより溶解される。別の実施形態では、このプロセスは、溶解細胞組成物を形成するため、微生物油を含む微生物細胞を溶解することを含み、溶解は、機械的、化学的、酵素的、物理的およびそれらの組み合わせおよびそれらの組み合わせから選択される。

［0048］本明細書で使用する場合、「細胞」とは、油糧微生物由来のバイオマテリアルなどの油含有バイオマテリアルをいう。微生物により産生されるまたは微生物細胞から得られる油は、「微生物油」という。一実施形態では、微生物油は、微生物のバイオマスから抽出され、その後処理していない粗油をいう。藻類および／または真菌により産生される油は、それぞれ藻類油および／または真菌油とも呼ばれる。

［0049］本明細書で使用する場合、「微生物細胞」または「微生物」は、藻類、細菌、真菌、酵母、原性生物およびそれらの組み合わせなどの生物、たとえば、単細胞生物をいう。いくつかの実施形態では、微生物細胞は真核細胞である。微生物細胞は、以下に限定されるものではないが、黄金色藻類（たとえばストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界の微生物）；緑藻類；珪藻類；渦鞭毛藻類（たとえば、クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）またはＣ．コーニー（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）などのクリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属のメンバーを含む渦鞭毛藻（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）目の微生物）；ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微細藻類；酵母（子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）または担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ））；ならびにムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、以下に限定されるものではないが、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）節シュムッケリ（ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）、ならびにフハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、以下に限定されるものではないが、ピチウム・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）の真菌が挙げられる。

［0050］一実施形態では、微生物細胞は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属またはヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目由来である。なおさらなる実施形態では、微生物細胞は、クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）由来である。なおさらに別の実施形態では、微生物細胞は、クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される。

［0051］なおさらなる実施形態では、微生物細胞として、以下に限定されるものではないが、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エントモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、エキノスポランギウム（Ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属およびサプロレグニア（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）属に属する微生物が挙げられる。別の実施形態では、ＡＲＡは、以下に限定されるものではないが、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・ハイグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ・シュムッケリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）およびモルティエレラ・ミヌティシマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）を含むモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属由来の微生物細胞から得られる。さらなる実施形態では、ＡＲＡは、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）ＩＦ０８５７１、モルティエレラ・ハイグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦ０５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＩＦ０８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０およびＣＢＳ７５４．６８ならびにそれらのミュータント由来の微生物細胞から得られる。なおさらなる実施形態では、微生物細胞は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）由来である。

［0052］なおさらなる実施形態では、微生物細胞は、以下に限定されるものではないが、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種は、アルジメンタレ（ａｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、アウレウム（ａｕｒｅｕｍ）、ベンチコラ（ｂｅｎｔｈｉｃｏｌａ）、グロボスム（ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、キンネイ（ｋｉｎｎｅｉ）、モチブム（ｍｏｔｉｖｕｍ）、ムルチルジメンタレ（ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、パキデルマム（ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）、プロリフェルム（ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）、ロセウム（ｒｏｓｅｕｍ）、ストリアツム（ｓｔｒｉａｔｕｍ）を含む）；シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種は、アグレガツム（ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、リムナセウム（ｌｉｍｎａｃｅｕｍ）、マングロベイ（ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）、ミヌツム（ｍｉｎｕｔｕｍ）、オクトスポルム（ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｍ）を含む）；ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属（種は、アモエボイデア（ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ）、ケルグエレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ミヌタ（ｍｉｎｕｔａ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ラジアテ（ｒａｄｉａｔｅ）、サイレンス（ｓａｉｌｅｎｓ）、サルカリアナ（ｓａｒｋａｒｉａｎａ）、シゾキトロプス（ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｏｐｓ）、ビスルゲンシス（ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ヨルケンシス（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）を含む）；オーランチアコキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉａｃｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；オブロンギチトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；シシオイドキチウム（Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｉｕｍ）属；パリエンチキトリウム（Ｐａｒｉｅｎｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；ボトリオキトリウム（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；およびそれらの組み合わせを含む、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微細藻類由来である。別の実施形態では、微生物細胞は、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目由来である。なお別の実施形態では、微生物細胞は、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）由来である。なおさらなる実施形態では、微生物細胞はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）由来である。なおさらなる実施形態では、微生物細胞は、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはそれらの混合物から選択される。

［0053］「約」という用語は、記載した数値と実質的に同じ結果を得られる、記載した数値の上下の変動を表すことを意図している。

［0054］本発明は、溶解した油糧微生物を含む発酵ブロスの解乳化を促進するための方法およびシステムを提供する。促進は、微生物油をそうした油を含む微生物から抽出する前に発酵ブロスを脱水することにより達成される。本発明はさらに、ブロス中の細胞を溶解する前に発酵ブロスを脱水することにより、発酵ブロス中に含まれる油糧微生物から微生物油を抽出するための方法およびシステムを提供する。発酵ブロスをその後の油抽出ステップ前に脱水することは、脱水ステップをまったく含まない一般に用いられる微生物油の無溶媒抽出法に対して多くの利点を有し得る。たとえば、本発明の方法は、１）解乳化ステップ中に加える塩または酵素が、はるかに少ないあるいはさらにはまったくない；２）解乳化ステップにかかる時間が短縮される、３）バイオミールに含まれる塩がかなり少なくなるため、産生されるそうしたバイオミールの最終産物が改善される；および４）より小さな遠心分離機およびより小さな処理容器槽など下流処理に使用される装置の容積をはるかに小さくできるため、以前の無溶媒抽出プロセスより優れている。さらに、容積の減少により、サンプルを処理するのに必要とされる時間およびエネルギーが少なくなり、引いては費用を節約する。

［0055］油糧微生物から微生物油を得るための典型的なプロセスでは、発酵槽または池で所望の油を産生できる微生物を増殖させて、そうした油を含む微生物細胞バイオマスを製造すること；および、その後バイオマスから油を抽出することが行われる。油を抽出するための１つの方法は、有機溶媒を必要とする。その方法では、バイオマスが増殖した発酵ブロスからバイオマスを分離すること；微生物細胞バイオマスを乾燥させ、続いてヘキサンなどの有機溶媒を使用して微生物油を抽出すること、およびその後蒸発により有機溶媒を除去し、もって微生物油を放置することが行われる。あるいは、油を抽出するには、有機溶媒を使用しない無溶媒抽出法が使用された。典型的な無溶媒抽出法では、以下のステップ：細胞含有発酵ブロスを低温殺菌または加熱するステップ；溶液形態の溶解細胞組成物を形成するため、細胞から微生物油を放出させるべく細胞を溶解させるステップ；油滴を合一させ溶液からエマルションを除去するため、熱、塩およびｐＨ調整により溶解細胞組成物を処理するステップが行われる。これに続いて、解乳化した溶液をさらに遠心し、溶液の残部から油を分離する。

［0056］本発明の一実施形態では、脱水ステップは、低温殺菌ステップと、溶解細胞組成物の水分レベルを著しく低下させる細胞溶解ステップとの両方の後に行われる。別の実施形態では、脱水ステップは、低温殺菌ステップの直後、かつ全細胞発酵ブロスの水分レベルを著しく低下させる細胞溶解ステップの前に行われる。どちらの実施形態も、処理される液体組成物の体積が、その後の油抽出ステップの前に著しく減少し、引いては費用の削減および効率の増加が達成される。

［0057］他方より一方の方法を使用するという選択は、無溶媒抽出プロセスの開始時の発酵ブロスの物理的特性に左右される。無溶媒抽出プロセスの開始時の発酵ブロスの粘度が低い場合、追加の脱水ステップは、低温殺菌ステップ直後に行ってもよい。無溶媒抽出プロセスの開始時の発酵ブロスの粘度が高い場合、追加の脱水ステップは、低温殺菌ステップおよび細胞溶解ステップの両方の後に行ってもよい。

［0058］いくつかの実施形態では、脱水ステップは、全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物を少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、少なくとも１００℃、少なくとも１０５℃または少なくとも１１０℃に加熱することを含む。他の実施形態では、脱水ステップは、全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物を約７０℃〜約１１０℃、約７０℃〜約１００℃、約８０℃〜約１００℃または約９０℃〜約１００℃で加熱することを含む。他の実施形態では、脱水ステップは、全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物を約８５℃、約９０℃または約９５℃で加熱することを含む。

［0059］いくつかの実施形態では、上記の脱水ステップの温度は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間または少なくとも３０時間維持される。

［0060］いくつかの実施形態では、細胞および／または溶解細胞組成物は、エバポレーターを備えたシステムで加熱してもよい。いくつかの実施形態では、細胞および／または溶解細胞組成物は、細胞および／または溶解細胞組成物中に存在する水の一部が蒸発により除去されるように、エバポレーターを備えたシステムで加熱してもよい。

［0061］いくつかの実施形態では、このプロセスは、全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の体積（または重量）を脱水ステップの開始時の全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の少なくとも３０体積（または重量）％、３５体積（または重量）％、４０体積（または重量）％、４５体積（または重量）％、５０体積（または重量）％、５５体積（または重量）％、６０体積（または重量）％、６５体積（または重量）％、７０体積（または重量）％、７５体積（または重量）％または８０体積（または重量）％に減少させるため、エバポレーターを備えたシステムで全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、このプロセスは、全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の体積（または重量）を脱水ステップの開始時の全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の３０体積（または重量）％〜８０体積（または重量）％、４０体積（または重量）％〜８０体積（または重量）％、５０体積（または重量）％〜８０体積（または重量）％、６０体積（または重量）％〜８０体積（または重量）％、７０体積（または重量）％〜８０体積（または重量）％、４０体積（または重量）％〜７５体積（または重量）％、５０体積（または重量）％〜７５体積（または重量）％、６０体積（または重量）％〜７５体積（または重量）％、５０体積（または重量）％〜７０体積（または重量）％または５５体積（または重量）％〜６５体積（または重量）％に減少させるため、全細胞エバポレーターを備えたシステムで発酵ブロスまたは溶解細胞組成物を加熱することを含む。

［0062］いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物は、連続水相および分散油相の混合物を含む水中油型エマルションの形態である。

［0063］いくつかの実施形態では、微生物細胞の溶解の結果、細胞または細胞バイオマス内の内在性物質、以下に限定されるものではないが、タンパク質、リン脂質、炭水化物およびそれらの組み合わせからエマルションが形成される。「エマルション」および「乳化された」という用語は、ある相または層が別の相または層に分散している、２つ以上の非混和性の相または層の混合物をいう。「破壊する」、「崩壊」、「解乳化する」、「解乳化」、「解乳化すること」および「破壊すること」という用語は、エマルションの非混和性の相または層を分離するプロセスをいう。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明のプロセスは、油含有エマルションを単相から２つ以上の相に破壊する。いくつかの実施形態では、２つの相は、軽相および重相を含む。いくつかの実施形態では、本発明のプロセスは、油含有エマルションを少なくとも３つの相に破壊する。いくつかの実施形態では、３つの相は、油相、エマルション相および水相である。いくつかの実施形態では、本発明のプロセスは、油含有エマルションを少なくとも４つの相に破壊する。いくつかの実施形態では、４つの相は、油相、エマルション相、水相および固相である。

［0064］本方法は、エマルションを破壊するため、溶解して脱水された細胞組成物溶液を加熱することをさらに含む。いくつかの実施形態では、解乳化ステップは、溶解して脱水された細胞組成物溶液を少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、少なくとも１００℃、少なくとも１０５℃または少なくとも１１０℃に加熱することを含む。他の実施形態では、解乳化ステップは、細胞または溶解細胞組成物を約６０℃〜約１１０℃、約７０℃〜約１００℃、約８０℃〜約１００℃または約９０℃〜約１００℃に加熱することを含む。他の実施形態では、解乳化ステップは、細胞または溶解細胞組成物を約８５℃に、約９０℃でまたは約９５℃で加熱することを含む。

［0065］上記のように、一実施形態では、脱水ステップは、低温殺菌ステップ後に行われ、もって全細胞発酵ブロス中の塩などの溶解した可溶性固体成分を効率的に凝縮する。次いで、脱水した全細胞発酵ブロス中の細胞を溶解して、溶解細胞組成物を形成する。別の実施形態では、脱水ステップは、細胞溶解ステップ後に行われ、もって溶解細胞組成物由来の塩などの溶解した可溶性固体成分を効率的に凝縮する。溶解細胞組成物中の塩濃度は、脱水ステップ後に上昇する。

［0066］本方法は、脱水ステップ前に細胞発酵ブロスを低温殺菌することをさらに含む。一実施形態では、６０℃で少なくとも１時間、少なくとも１．５時間または少なくとも２時間細胞を加熱することを含む低温殺菌プロセス。別の実施形態では、６０〜７０℃の温度で少なくとも１時間、少なくとも１．５時間または少なくとも２時間細胞を加熱することを含む低温殺菌プロセス。別の実施形態では、４０℃〜（６０℃または）７０℃（４０℃と（６０℃または）７０℃を含む温度）で３０分以下細胞を加熱すること、または細胞を少なくとも０．５℃／分の速度で加熱することを含む低温殺菌プロセス。一実施形態では、温度（℃）−時間（分）グラフ下面積が６，０００℃．分になるような低温殺菌プロトコルを使用することを含む低温殺菌プロセス。別の実施形態では、温度（℃）−時間（分）グラフ下面積が１３，０００℃．分未満になるような低温殺菌プロトコルを使用することを含む低温殺菌プロセス。時間−温度グラフ下面積は、低温殺菌プロセス中に細胞を加熱する際に消費されるエネルギーの量を与える。

［0067］本発明の方法の特定の利点は、それが解乳化ステップを加速できることである。一実施形態では、解乳化プロセスを実施するための時間が、脱水ステップが行われるときに、脱水ステップが行われないときと比較して短縮される。別の実施形態では、同じ解乳化作用を達成するための時間が、脱水ステップが行われない場合のプロセスと比較して、必要とされる時間の少なくとも６０％、少なくとも４５％または少なくとも４０％に短縮される。別の実施形態では、油抽出の全体の時間が、脱水ステップが行われるときに、脱水ステップが行われないときと比較して短縮される。別の実施形態では、油抽出のための全体のエネルギー使用が、脱水ステップが行われるときに、脱水ステップが行われないときと比較して減少する。

［0068］いくつかの実施形態では、解乳化ステップの温度は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間または少なくとも３０時間維持される。いくつかの実施形態では、上記の解乳化ステップの温度は、１０〜３６時間、１０〜１２時間、１０〜１４時間、１０〜２４時間、１２〜３６時間、１４〜３６時間、１６〜３６時間、１８〜３６時間、２０〜３６時間、２２〜３６時間、２４〜３６時間、２６〜３６時間、２８〜３６時間、１６〜２６時間、１８〜２６時間、２０〜２６時間、２２〜２６時間、２２〜２４時間、２３〜２５時間、３０〜３６時間または３０〜３４時間維持される。

［0069］いくつかの実施形態では、解乳化ステップは、ｐＨ調整をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｐＨは、７〜１２、７．５〜１１．５、９．５〜１１．５、好ましくは１０．０〜１１．０、一層好ましくは１０．３〜１０．７に調整される。

［0070］本発明の方法のさらなる利点は、それが、エマルションを破壊する際の塩の使用を減らすまたはなくすことができることである。本発明の方法はさらに、細胞を溶解する際の塩の使用を減らすあるいはなくすことができるというメリットも有する。以前の無溶媒抽出法の解乳化ステップでは、エマルションを破壊しやすくするため塩が加えられる。さらに、場合によっては、溶解ステップ中および溶解ステップ後にエマルションを破壊しやすくするため、過剰量の細胞壁破壊酵素が溶解ステップ中に加えられる。上の段落に開示されたように、脱水ステップは、全細胞発酵ブロスまたは溶解細胞組成物中の塩濃度の上昇を可能にする。これにより、解乳化ステップでエマルションの破壊に必要とされる塩の量が減少するか、あるいはそうした必要がまったくなくなる。一実施形態では、油抽出プロセス全体に使用される塩、特に塩化ナトリウムは、２ｗｔ％未満である。別の実施形態では、油抽出プロセス全体に使用される塩、特に塩化ナトリウムは、１ｗｔ％未満である。別の実施形態では、油抽出プロセス全体に使用される塩、特に塩化ナトリウムは、０．５ｗｔ％未満である。別の実施形態では、塩は、油抽出プロセス全体に使用されない。一実施形態では、使用される細胞破壊酵素は、１ｗｔ％未満である。別の実施形態では、使用される細胞破壊酵素は、０．５ｗｔ％未満である。別の実施形態では、使用される細胞破壊酵素は、０．１５ｗｔ％未満である。別の実施形態では、細胞破壊酵素は、使用されない。

［0071］本発明の方法のさらにもう１つの利点は、それが、油抽出プロセスに必要とされる容器の体積を減少させることである。容器体積も減少すると、装置費用の削減、エネルギー使用の減少および混合効率の上昇という利点がある。本発明の一実施形態では、解乳化ステップ中に使用される容器は、脱水ステップが行われない場合に必要とされる容器の少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％に小さくなる。容器体積の減少により、総撹拌電力も削減することができる。別の実施形態では、解乳化ステップ中に使用される容器の撹拌電力は、脱水ステップが行われない場合に消費される、その当初の電力量の少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％に削減される。

［0072］本発明の方法のもう１つの利点は、解乳化ステップを支援し、その結果収率向上および／または解乳化時間の短縮化がもたらされることである。理論に束縛されるものではないが、解乳化が起こるには、乳化油滴が合一してより大きな液滴になる必要があると考えられる。油滴が大きくなるにつれ、遠心分離により油を水相から分離することが容易になる。油タイター（油のＬ／ブロスのＬ）の上昇により、油滴はブロス中でより濃縮されて、より大きな液滴を形成するためより容易かつ効率的に合一し、最終的に遠心分離により水相から分離することができる。油滴を密にすることに加えて、脱水プロセスは、エマルションの破壊に資する、ブロス中の塩濃度の上昇という効果も有すると考えられる。一実施形態では、上記の脱水プロセスを用いて回収される油の量は、脱水ステップが行われないときの同じ方法と比較して約５〜９％増加する。一実施形態では、上記の脱水プロセスを用いて回収される油の量は、脱水ステップが行われないときの同じ方法と比較して少なくとも７％増加する。別の実施形態では、上記の脱水プロセスを用いて回収される油の量は、約８５％から９０〜９４％増加する。別の実施形態では、解乳化ステップを実施するための時間の量は、約１２時間減少されている。別の実施形態では、解乳化ステップを実施するための時間の量は、約３６時間〜約２４時間減少されている。

［0073］本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法のいずれかにより得られる微生物油またはバイオミールである。

［0074］本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されたプロセスのいずれかにより微生物細胞から得ることができる微生物油である。いくつかの実施形態では、油は、少なくとも１５重量％エイコサペンタエン酸を含む。いくつかの実施形態では、油は、少なくとも３０重量％ドコサヘキサエン酸を含む。いくつかの実施形態では、油は、少なくとも３０重量％アラキドン酸を含む。

［0075］一実施形態では、本明細書に記載のプロセスのいずれかにより得られるおよび／または回収される微生物油は、粗油である。別の実施形態では、本明細書に記載の油は、精製油である。「粗油」は、さらに処理されていない、微生物細胞から得られた油である。「精製油」は、粗油を精製、漂白および／または脱臭の標準的な処理で処理することにより得られた油である。たとえば、米国特許第５，１３０，２４２号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、精製は、以下に限定されるものではないが、塩基精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、冷却、加熱、漂白、脱臭、脱酸およびそれらの組み合わせを含む。

［0076］いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて得られた油は、１種または複数種のＰＵＦＡを含む。いくつかの実施形態では、油は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％ＰＵＦＡ（ＰＵＦＡ重量で）を含む。いくつかの実施形態では、油は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％ＤＨＡ（ＤＨＡ重量で）を、および／または少なくとも１０％、少なくとも１５％もしくは少なくとも２０％ＤＰＡｎ−６（ＤＰＡｎ−６重量で）を、および／または少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％ＥＰＡ、少なくとも２５％ＥＰＡ、少なくとも３０％ＥＰＡ、少なくとも３５％ＥＰＡ、少なくとも４０％ＥＰＡ、少なくとも４５％ＥＰＡもしくは少なくとも５０％ＥＰＡ（ＥＰＡ重量で）を、および／または少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも８０％ＡＲＡ（ＡＲＡ重量で）を含む。いくつかの実施形態では、油は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満ＥＰＡ（ＥＰＡ重量で）を含む。いくつかの実施形態では、油は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満ＤＨＡ（ＤＨＡ重量で）を含む。いくつかの実施形態では、油は、１０重量％未満、５重量％未満、２重量％未満、１重量％未満または０．５重量％未満のステロールを含む。

［0077］いくつかの実施形態では、上記の油は、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％または５０重量％〜９５重量％、５０重量％〜９０重量％、５０重量％〜８５重量％、５０重量％〜８０重量％、５０重量％〜７５重量％、６０重量％〜９５重量％、６０重量％〜９０重量％、６０重量％〜８５重量％、７０重量％〜９５重量％、７０重量％〜９０重量％、７０重量％〜８５重量％、７５重量％〜９５重量％、７５重量％〜９０重量％もしくは７５重量％〜８５重量％のトリグリセリドを含む。

［0078］いくつかの実施形態では、上記のトリグリセリドは、少なくとも５０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも１０重量％または少なくとも５重量％ＥＰＡを含む。いくつかの実施形態では、トリグリセリドは、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％または少なくとも８０重量％ＤＨＡを含む。いくつかの実施形態では、トリグリセリドは、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％または少なくとも８０重量％ＡＲＡを含む。

［0079］いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて得られた油は、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％もしくは少なくとも６０重量％ＤＨＡおよび／または１５重量％未満、１０重量％未満もしくは８重量％未満ＥＰＡを含む。いくつかの実施形態では、上記の油は、少なくとも７０重量％、８０重量％、９０重量％または９５重量％トリグリセリドを含む。一実施形態では、微生物油は粗油である。別の実施形態では、微生物油は精製油である。

［0080］いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて得られた油は、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％もしくは少なくとも４０重量％ＤＨＡおよび／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％もしくは少なくとも２０重量％ＥＰＡを含む。いくつかの実施形態では、上記の油は、少なくとも７０重量％、８０重量％、９０重量％または９５重量％トリグリセリドを含む。一実施形態では、微生物油は粗油である。別の実施形態では、微生物油は精製油である。

［0081］いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて得られた油は、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％もしくは少なくとも５０重量％ＤＨＡおよび／または２５重量％未満、２０重量％未満もしくは１５重量％未満ＤＰＡｎ−６を含む。いくつかの実施形態では、上記の油は、少なくとも７０重量％、８０重量％、９０重量％または９５重量％トリグリセリドを含む。一実施形態では、微生物油は粗油である。別の実施形態では、微生物油は精製油である。

［0082］いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて得られた油は、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％または少なくとも６５重量％ＤＨＡを含む。いくつかの実施形態では、上記の油は、少なくとも７０重量％、８０重量％、９０重量％または９５重量％トリグリセリドを含む。一実施形態では、微生物油は粗油である。別の実施形態では、微生物油は精製油である。

［0083］いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて得られた油は、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％もしくは少なくとも４０重量％ＤＨＡおよび／または５重量％未満、２重量％未満もしくは１重量％未満ＤＰＡｎ−６を含む。いくつかの実施形態では、上記の油は、少なくとも７０重量％、８０重量％、９０重量％または９５重量％トリグリセリドを含む。一実施形態では、微生物油は粗油である。別の実施形態では、微生物油は精製油である。

［0084］いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて得られた油は、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％もしくは少なくとも３５重量％ＤＨＡおよび／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％もしくは少なくとも２０重量％ＥＰＡおよび／または１０重量％未満、５重量％未満もしくは３重量％未満ＤＰＡｎ−６および／または１５重量％未満、１０重量％未満もしくは７重量％未満ＤＰＡｎ−３を含む。いくつかの実施形態では、上記の油は、少なくとも７０重量％、８０重量％、９０重量％または９５重量％トリグリセリドを含む。一実施形態では、微生物油は粗油である。別の実施形態では、微生物油は精製油である。

［0085］いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて得られた油は、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％または少なくとも５０重量％ＡＲＡを含む。いくつかの実施形態では、上記の油は、少なくとも７０重量％、８０重量％、９０重量％または９５重量％を含む。一実施形態では、微生物油は粗油である。別の実施形態では、微生物油は精製油である。

［0086］本発明の方法は、バイオマスからの非常に効率的な油の抽出を可能にする。本発明の方法を使用することにより、バイオマスからより多くの油を除去することが可能であり、よって脱脂したバイオマスに残存する油がはるかに少なくなる。したがって、一実施形態では、本発明は、１０％未満の総脂肪酸を含む脱脂したバイオマスに関する。別の実施形態では、本発明は、５％未満の総脂肪酸を含む脱脂したバイオマスに関する。

［0087］本発明で使用される微生物細胞の効率的な培養条件として、以下に限定されるものではないが、効率的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび油産生を許容する酸素条件が挙げられる。効率的な培地とは、微生物細胞、たとえば、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物細胞が一般的に培養される任意の培地をいう。そうした培地は典型的には、同化性の炭素源、窒素源およびリン酸塩源の他、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養素、たとえばビタミンを有する水性培地を含む。本発明で使用される微生物細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートで培養することができる。

［0088］いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスのいずれかにより得られた油、脱脂したバイオマスまたはそれらの組み合わせは、食品または食品成分、任意の非ヒト動物（たとえば、その産物（たとえば、肉、乳または卵）がヒトにより消費されるもの）の飼料または飼料サプリメント；および栄養補助食品として直接使用してもよい。「動物」という用語は、動物界に属する任意の生物をいい、任意のヒト動物および産物（たとえば、乳、卵、家禽肉、牛肉、豚肉、子羊肉および魚肉）が得られる元となる非ヒト動物を含む。いくつかの実施形態では、油および／またはバイオマスは、シーフードと見なされる海洋動物の給餌に使用してもよい。シーフードは、以下に限定されるものではないが、魚、エビおよび甲殻類に由来する。「産物」という用語は、以下に限定されるものではないが、肉、卵、乳または他の産物を含め、そうした動物から得られる任意の産物を含む。そうした動物に油および／またはバイオマスが給餌されると、多価不飽和油は、そうした動物の肉、乳、卵または他の産物に取り込まれ、それらのこうした油の含有量を増加させることができる。

［実施例］
［実施例１］
［0089］図１および２に図示したように、微生物細胞懸濁液は、微生物細胞の溶解前、溶解中または溶解後のいずれで脱水してもよい。細胞溶解後の脱水の１つの特定の例を以下に説明する。

［0090］微生物細胞（シゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．））を含む未洗浄細胞ブロス（１４１．８ｋｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。低温殺菌後のｐＨは７．４、全固形分量は１６．７％であった。ブロスを均等に分け、２つの１００リットル撹拌槽に移した。温度を６０℃で制御しながら、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）酵素（ノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）（フランクリントン（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ），ノースカロライナ州（ＮＣ））から入手可能）を細胞ブロスの重量に対して０．１５％の量で加えた。ブロスを２００ＲＰＭの撹拌速度で２時間保持し、ｐＨを２０％ＮａＯＨ溶液で７．５に制御した。その後、ブロス温度を９０℃に上昇させ、ブロス蒸発のためヘッドスペースポートをすべて開放した。約１３時間後、２つの槽中のブロスを合わせて、ブロス中の全固形分量が３６．５％になるまで蒸発プロセスをさらに８時間継続した。総蒸発時間は、２１時間であった。発酵ブロスの体積減少率は、５４．４％であった。

［0091］次のステップでは、解乳化プロセスを行った。ｐＨは、２０％ＮａＯＨ溶液を用いて５．８〜１０．５に調整した。７．６ｋｇのＮａＯＨ溶液を使用した。ブロスを２００ｒｐｍの撹拌速度にて９０℃で保持し、小さな蒸気の通気ラインを除いてすべてのポートを閉鎖した。８時間後、ｐＨは９．５に低下し、０．７７ｋｇの２０％ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨを１０．０に上げた。約２６時間後に、３．９ｋｇの３ＮＨ_２ＳＯ_４を用いてｐＨを７．６に調整した。温度を８０℃まで下げた。上記の解乳化プロセスにより、油相、エマルション相および水相の相分離が起きる。

［0092］次に、遠心分離により（Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｄｉｓｃ Ｓｔａｃｋ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＬＡＰＸ ４０４／Ｃｌａｒａ ２０）油を溶解細胞組成物から分離した。抽出収率は９１．６１％であった。脱水ステップのない以前の実験と比較して、解乳化ステップを実施するための時間の量は、１／２または２４時間減少している。

［実施例２］
［0093］微生物細胞（シゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．））を含む未洗浄細胞ブロス（１５７．４ｋｇ）を６０℃で１時間低温殺菌した。次いでブロスのｐＨを７．５に調整し、アルカラーゼ（登録商標）酵素（ノボザイムズ（フランクリントン，ノースカロライナ州）から入手可能）を細胞ブロスの重量に対して０．１５％の量で加えた。ブロスを１４０ＲＰＭの速度で撹拌し、温度を６０℃で２時間維持した。２時間後、溶解細胞組成物を９０℃に加熱し、１６．９％の当初の全固形分量から３０．５％の最終全固形分量に蒸発させた。この結果、微生物油および細胞片を含む８７．２ｋｇの濃縮ブロスが得られた。体積減少率は４４．５％であった。この溶解し濃縮した細胞組成物のｐＨを、２．６ｋｇの５０％ＮａＯＨを加えることにより１０．５に調整した。ブロスを１４０ＲＰＭで撹拌し、２４時間保持した。保持期間中、ｐＨが９未満に下がったときｐＨを１０に戻すため、ＮａＯＨを用いてさらに１回ｐＨ調整を行った。合一期間の終了時、２．８ｋｇの３Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨを９．７から８．０に調整し、温度を８０℃に低下させた。形成された粗油相を、遠心（Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｄｉｓｃ Ｓｔａｃｋ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＬＡＰＸ ４０４／Ｃｌａｒａ ２０）により溶解細胞組成物から分離した。抽出収率は９１．８％であった。

［0094］図３に示した時間傾向により明らかなように、脱水ステップを含めて処理した発酵ブロスは、合一処理後２時間という短い時間で良好な油分離を示した。

［0095］溶解細胞組成物を脱水しなかった対照実験と比較すると（図４を参照）、エマルション相が、重相から分離できるまで、より長い期間存続したことが示された。エマルションの一部は遊離油と混合しており、最終的に遠心分離の軽相となったが、含水量の多い油が生じ、さらなる精製ステップが必要となった。

［0096］遊離油相、エマルション相および水相の体積を推定し、総体積に対する各相のパーセンテージを算出して油合一処理の進行を示した。図５を図６と比較すると、脱水ステップの利益が明確に証明された。脱水ステップがないと、遊離油相は、２６時間で総体積のわずか２％であった一方（図６）、脱水ステップがあると、遊離油相は２時間ですでに総体積の１５％であった（図５）。脱水ステップがある実験では、水の減少により、油濃度が約２倍になり、油相の体積は、合一処理の終了時に総体積の１８％であったのに対し、脱水ステップなしの実験では、遊離油相の体積は、終了時に総体積のわずか８％であった。

Claims (43)

1. 溶解した油糧微生物を含む未洗浄の発酵ブロスの解乳化を促進するための方法であって、
   ａ）前記発酵ブロスから水を除去して、前記溶解した油糧微生物を含む前記発酵ブロスの体積を、その当初の体積の６０％未満に減少させること；および
   ｂ）前記発酵ブロスを６０℃〜１１０℃の温度に加熱することにより解乳化すること
   を含み、前記解乳化において塩を加えない方法。
2. 前記解乳化は、解乳化の時間をステップａ）が行われないときの解乳化に必要とされる時間の少なくとも１／３に短縮することにより促進される、請求項１に記載の方法。
3. ｃ）前記発酵ブロスから油を回収することをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 油の前記回収は、溶媒の使用なしに行われる、請求項３に記載の方法。
5. 前記回収される油の量は、ステップａ）が行われないときの同じ方法と比較して少なくとも７％増加する、請求項４に記載の方法。
6. ステップａ）の溶解した油糧微生物を含む前記発酵ブロスの体積は、その当初の体積の７０％未満、好ましくは８０％未満に減少する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ステップａ）の水の除去は、前記発酵ブロスを１１０℃以下、好ましくは７０℃〜１００℃、一層好ましくは８０℃〜９０℃の温度で加熱することにより行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ステップｂ）は、アルカリ化剤、好ましくは苛性ソーダを加えることを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記発酵ブロスのｐＨは、５．５〜１２、好ましくは７．０〜１２．０、好ましくは９．５〜１０．５、一層好ましくは９．７〜１０．２のｐＨ値に調整される、請求項８に記載の方法。
10. ステップｂ）の前記温度は、８５℃〜９５℃、好ましくは約９０℃である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ステップｂ）の前記温度は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間および少なくとも４時間維持される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ステップｂ）の前記温度は、２４〜７２時間、好ましくは２４〜３６時間維持される、請求項８に記載の方法。
13. 油糧微生物を含む未洗浄の発酵ブロスから１種または複数種の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を抽出するための方法であって、
    （ａ）溶解細胞組成物を形成するため前記発酵ブロス中の前記油糧微生物を溶解すること；
    （ｂ）前記溶解細胞組成物から水を除去して、前記溶解細胞組成物の体積を、その当初の体積の６０％未満に減少させること；
    （ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記溶解細胞組成物を６０℃〜１１０℃の温度に昇温すること；および
    （ｄ）前記微生物油を前記溶解細胞組成物から回収すること
    を含み、前記抽出するための方法全体において塩が使用されない方法。
14. ステップ（ｂ）の前記溶解細胞組成物の体積は、その当初の体積の７０％未満、好ましくは８０％未満に減少する、請求項１３に記載の方法。
15. ステップ（ｂ）の水の除去は、１１０℃以下、好ましくは７０℃〜１００℃、一層好ましくは８０℃〜９０℃の温度で前記溶解細胞組成物を加熱することにより行われる、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
16. ステップ（ｃ）は、アルカリ化剤、好ましくは苛性ソーダを加えることを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記溶解細胞組成物のｐＨは、５．５〜１２、好ましくは７．０〜１２．０、好ましくは９．５〜１０．５、一層好ましくは９．７〜１０．２のｐＨ値に調整される、請求項１６に記載の方法。
18. ステップ（ｃ）の前記温度は、８５℃〜９５℃、好ましくは約９０℃である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ステップ（ｃ）の前記温度は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間および少なくとも４時間維持される、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ステップ（ｃ）の前記温度は、２４〜７２時間、好ましくは２４〜３６時間維持される、請求項１９に記載の方法。
21. 油糧微生物を含む未洗浄の発酵ブロスから１種または複数種の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を抽出するための方法であって、
    （ａ）前記発酵ブロスから水を除去して、前記発酵ブロスの体積を、その当初の体積の６０％未満に減少させること；
    （ｂ）溶解細胞組成物を形成するため前記発酵ブロス中の前記油糧微生物を溶解すること；
    （ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記溶解細胞組成物を６０℃〜１１０℃の温度に昇温すること；および
    （ｄ）前記微生物油を前記溶解細胞組成物から回収すること
    を含み、前記抽出するための方法全体において塩が使用されない方法。
22. ステップ（ａ）の前記発酵ブロスの体積は、その当初の体積の７０％未満、好ましくは８０％未満に減少する、請求項２１に記載の方法。
23. ステップ（ａ）の水の除去は、前記発酵ブロスを１１０℃以下、好ましくは７０℃〜１００℃、一層好ましくは８０℃〜９０℃の温度で加熱することにより行われる、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
24. ステップ（ｃ）は、アルカリ化剤、好ましくは苛性ソーダを加えることを含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記溶解細胞組成物のｐＨは、５．５〜１２、好ましくは７．０〜１２．０、好ましくは９．５〜１０．５、一層好ましくは９．７〜１０．２のｐＨ値に調整される、請求項２４に記載の方法。
26. ステップ（ｃ）の前記温度は、８５℃〜９５℃、好ましくは約９０℃である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
27. ステップ（ｃ）の前記温度は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間および少なくとも４時間維持される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
28. ステップ（ｃ）の前記温度は、２４〜７２時間、好ましくは２４〜３６時間維持される、請求項２７に記載の方法
29. 前記油糧微生物は、１種または複数種の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を産生する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記多価不飽和脂肪酸は、オメガ３脂肪酸、オメガ６脂肪酸およびそれらの混合物を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモガンマリノレン酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびそれらの混合物を含む、請求項２９に記載の方法。
32. 前記多価不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記多価不飽和脂肪酸は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である、請求項３１に記載の方法。
34. 前記多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ）である、請求項３１に記載の方法。
35. 前記微生物細胞は、藻類細胞、酵母細胞、真菌細胞、プロテスト細胞または細菌細胞である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記微生物細胞は、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目由来である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記微生物細胞は、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目由来である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記微生物細胞は、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはそれらの混合物由来である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記微生物細胞は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）由来である、請求項３６に記載の方法。
40. 前記溶解細胞組成物は、液体、細胞片および微生物油を含む、請求項１３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記油は、少なくとも１５重量％エイコサペンタエン酸を含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記油は、少なくとも３０重量％ドコサヘキサエン酸を含む、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
43. 前記油は、少なくとも３０重量％アラキドン酸を含む、請求項４２に記載の方法。

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