CN102605012A - 采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用脂肪酶、并在最佳酶催化反应条件下提高以微藻油脂制备生物柴油的产率。属于微藻油脂制备生物柴油技术领域。具体操作实施的过程为：采用中心组合设计方案(Central Composite Design)，考察酶催化反应体系中，4因子(脂肪酶量、甲醇量、反应温度、反应时间)及5水平不同组合条件下对微藻油脂转酯化反应制备生物柴油产率的影响，并通过建立响应面模型方程，确立可达到微藻油脂制备生物柴油最大产率的最佳酶催化反应条件。在最佳酶催化反应条件下，微藻油脂转酯化的生物柴油产率可高达73.41-76.48％。酶催化反应制备微藻生物柴油具有较高的产率，且催化反应条件温和、环境污染程度小，具有良好的实用性。

Description

采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率

技术领域

本发明属于微藻油脂酶催化反应制备生物柴油的技术领域，具体是涉及一种采用脂肪酶、并在最佳酶催化反应条件下提高以微藻油脂制备生物柴油产率的技术方法。

背景技术

由于当前全球性的能源短缺与环境恶化，世界各国都在积极进行可替代化石燃料的可再生新能源的开发和利用，例如生物柴油(脂肪酸甲酯)的研发。生物柴油是指由可再生的油脂原料经过酯交换反应而得到的长链脂肪酸甲酯，是一种可以替代普通柴油使用的环保燃油。

采用生物油脂为原料，经过酯交换催化反应制备生物柴油的反应，即脂肪酸甘油酯在各种不同的催化剂(例如酸、碱、脂肪酶)和一定的反应温度条件的作用下，与甲醇产生酯交换反应，生成脂肪酸甲酯(生物柴油)和甘油。

近年来，随着经济发展和人们生活水平的不断提高，世界各国的环保意识不断增强，具有“工业血液”、国民经济命脉之称的石油，虽然促进了世界的繁荣和经济的发展，但因其资源有限性而带来的能源危机以及使用过程造成的负面环境污染问题，迫使人们寻求其它的途径解决这些存在的问题。当前，包括生物柴油在内的各种替代燃料的研究已引起了世界各国广泛的关注和重视。由于生物柴油是用植物油、动物脂肪或废弃食用油等为原料加工而成的，没有毒性，而且可以再生，燃后排出的废气有害成分也相对少得多，所以具有环保、减小对人体毒害程度的效果。应用结果表明，生物柴油与普通柴油的能源效益较为相近，可以用来替代或部分替代普通柴油。此外，与其它替代燃料相比，生物柴油也具有独特的优越性，因此，近年来许多国家都加大了对生物柴油的研究开发和推广应用的力度，为发展洁净环保型的绿色能源提供了很好的机遇，已成为十分重要的生物质能研发的方向。

微藻细胞中存在的油脂形式是脂肪酸甘油酯，主要是甘油三酯(TG)，也包括少量甘油单酯(MG)和甘油二酯(DG)，酯交换过程的进行分三步反应，三者之间可互相转化。

式中TG、DG、MG和GL分别为甘油三酯(Triglyceride)，甘油二酯(Diglyceride)，甘油单酯(Monoglyceride)和甘油(Glycerol)。微藻具有生物量大、生长周期短、易培养、油脂含量高等优点.从微藻中提取油脂成分，通过转酯化反应，可制备出具有良好燃性和环保特性的生物燃油，因此，微藻是产生可再生性绿色清洁能源的良好生物质材料。

酶是一种适宜的生物催化剂，它能够在亲脂性有机溶剂或者超临界介质中催化甘油三酯与短链醇的酯交换反应，生成生物柴油。它可以是来源于动物、细菌、真菌或真核细胞的任何脂肪酶，主要是酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、毛霉脂肪酶和猪胰脂肪酶等。生物酶法合成生物柴油，即用生物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯或乙酯。采用酶法合成生物柴油可以避免象化学催化法通常存在的对原料要求较高，能耗大，腐蚀性较强，容易产生环境污染等问题，具有反应条件温和、醇用量小、无污染排放等优点，是属于绿色环保型的生物酶催化反应.近年来，生物酶法合成生物柴油已越来越受到人们的普遍关注。采用脂肪酶制备生物柴油，反应物中的游离脂肪酸和水对酶催化剂没有影响，反应液静置后，脂肪酸甲酯即可得到分离。由于脂肪酶的来源不同，其价格成本和催化特性也存在很大差异。因此酶法生产生物柴油并商业化的主要瓶颈问题就是酶的成本相对比较高。

因此，研发出采用微藻油脂为原料，通过以价格低廉的普通工业脂肪酶为转酯化反应的催化剂，建立较高微藻生物柴油产率技术方法，具有重要的现实意义，目前尚缺少通过采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率的相关研究和报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是针对上面所述的背景技术，通过采用价格低廉的普通工业脂肪酶、并在最佳酶催化反应条件下提高以微藻油脂制备生物柴油的产率。属于微藻油脂制备生物柴油技术领域。通过采用中心组合设计方案(Central Composite Design)，考察酶催化反应体系中，4因子(脂肪酶量、甲醇量、反应温度、反应时间)及5水平不同组合条件下对微藻油脂转酯化反应制备生物柴油产率的影响，并通过建立响应面模型方程，确立可达到微藻油脂制备生物柴油最大产率的最佳酶催化反应条件。在最佳酶催化反应条件下，微藻油脂转酯化的生物柴油产率可高达73％以上。本发明采用的酶催化反应制备微藻生物柴油的技术方法具有较高的产率，效果良好，且催化反应条件温和、环境污染程度小，安全环保，成本低，具有操作实施可行性。目前尚缺少通过采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率的相关研究和报道。

本发明采用的研究材料和方法：

(1)微藻生物油脂的获取：

微藻细胞在适宜的培养条件下扩增培养，采收微藻细胞，藻体离心浓缩，冷冻干燥处理，得到的微藻干品采用酸热法提取油脂，用于微藻生物柴油的制备。

(2)微藻生物柴油制备的酶催化反应具体操作过程：

准备好三角烧瓶，烘干，准确称取一定量藻油，加入到三角烧瓶中。按照实验设计的具体方案，加入一定量的工业用脂肪酶(工业酶制剂，2000单位/克，价格低廉，100-150元/KG)和无水甲醇，为了减小甲醇对脂肪酶的抑制作用，有利目标产物的生成，甲醇总量在设定的总反应时间长度的平均时间点分3次等量加入，为了保证脂肪酶活性，反应系统中加入少量的蒸馏水。反应在控温的摇床中按设定的催化温度进行，控制适宜的转速，反应进行到设定的时间，终止催化反应。

(3)催化反应结束后的处理步骤：

将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分转移至分液漏斗，静置分层。取出静置分层后的下层液相(为生物柴油粗品)，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm，静置分层后得到的上层有机相即为生物柴油，分离、取出上层有机相，准确称取所获得的生物柴油重量。

(4)生物柴油产率的计算：

产率(Y)＝100X生物柴油重量/微藻油脂重量

(5)考察酶反应条件对生物柴油产率的影响：

通过采用4因子5水平的随机化中心组合实验设计方案，同时运用方差分析方法，考察主效应因子(脂肪酶量、甲醇量、催化反应温度和反应时间长度)对目标产物生物柴油产率的影响程度，分析这些关键性因子对目标产物生物柴油产率影响程度大小的顺序，以及通过构建优化的生物柴油产率与催化反应条件因子的相关数学模型，确定出最佳化的催化反应条件，并从多个方面评价构建的数学模型的适配拟合性。

数学模型的构建：经过尝试多种形式的变量响应性模式，最后确定出以采用多元二次回归模型(Quadratic model)的适配拟合效果最好，因而酶催化反应的实验数据采用下述的数学模型进行最小二乘法适配拟合，即模型的表达式为：

$Y_{\mathrm{prod}}\left(\mathrm{xi}\right)={\mathrm{\β}}_0+\underset{i=1}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\β}}_i{X}_i+\underset{i=1}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\β}}_{\mathrm{ii}}{X}_i^2$

式中Y_prod(xi)是根据优化适配拟合模型计算的生物柴油产率估测值，即响应性变量的估测值，X_i代表反应条件因子数值项，

代表反应条件因子数值的二次项，β₀、β_i和β_ii分别表示适配模型展开项中的截距、独立变量X_i和

参数的系数。

(6)数学模型的适配拟合度的评价：

考察酶催化反应构建模型的独立变量显著性(F值，P值)；考察模型参数的估计值和显著性(t值，P值)；模型的回归显著性(R²值，F值，P值)；考察观察值、模型的预测值及残差值。

经优化适配拟合的模型有重要用途，例如可用来预测拟设定的任何各种反应条件因子数值情况下生物柴油的产率，并且通过求解模型函数的极大值，达到确立最佳化的反应条件，因而十分有利于目标产物的生成调控。

(7)实验数据均采用统计软件分析处理。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

通过采用采用价格低廉的普通工业脂肪酶、并通过采用有效的中心组合设计方案(Central Composite Design)，考察酶催化反应体系中，4因子(脂肪酶量、甲醇量、反应温度、反应时间，分别用A，B，C，D表示)及5个水平值不同组合条件下对微藻油脂转酯化反应制备生物柴油产率的影响，并构建出适宜的响应面回归模型方程，确立可达到微藻油脂制备生物柴油最大产率的最佳酶催化反应条件。以便达到采用的酶催化反应制备微藻生物柴油的技术方法具有较高的产率，且催化反应条件温和、环境污染程度小，安全环保，成本低，具有操作实施可行性的效果。

脂肪酶催化反应制备微藻生物柴油的实验设计、研究结果及分析见下表：

表一、酶催化反应制备生物柴油的实验因子水平表

表二、中心组合实验设计酶催化反应结果(实验顺序随机化)

表三、酶催化反应主效应因子的ANNOVA分析

表四、酶催化反应主效应因子的ANNOVA分析回归显著性

表五、酶催化反应构建模型的独立变量显著性分析

表六、酶催化反应构建模型的参数估计结果

表七、酶催化反应构建模型的回归显著性

表八、酶催化反应观察值与构建模型的预测值估测

酶催化反应制备生物柴油实验研究结果的分析讨论：

(1)ANNOVA分析讨论

由采用中心组合实验设计获得的酶催化反应结果(表二)可看出，酶催化反应条件因子对生物柴油产率的影响大，不同的反应条件组合形式下，生物柴油产率的的变动范围在49.48-76.48％，产率变动极差值达27％，说明通过控制反应条件是达到提高生物柴油生成率的有效途径之一.当加入的酶量少(2克)、甲醇量少(25毫升)、反应温度较低(42.5℃)、反应时间短(25小时)，生物柴油产率低，仅为49.48％；而提供的反应条件为加酶量4克、加甲醇量35毫升、反应温度47.5℃、反应时间为35小时，生物柴油生成率达最高值的76.48％，此为最佳化的反应条件，表明在酶催化反应制备生物柴油过程中，若采用最佳化的反应条件，可以达到的生物柴油产率最高。其它不同反应条件组合形式下的生物柴油产率介于最低和最高值之间。

酶催化反应因子的ANNOVA分析和显著性检验结果(表三和表四)进一步表明，生物柴油产率与反应条件因子关系密切，按分析结果中各因子对产率影响的显著性(P值)的大小，可看出反应条件因子对产率影响程度的大小顺序依次为加酶量(A)＞反应时间长度(D)＞加甲醇量(B)＞反应温度(C)。其中主效应因子：加酶量(A)、加甲醇量(B)、反应时间长度(D)对生物柴油产率具有十分显著的效应(P＜0.01)，说明酶催化反应制备生物柴油中，所考察的关键性因子对生物柴油生成率的效应是相当明显的。虽然不同的温度情况下，生物柴油生成率有差别，但其效应统计检验的结果是不显著的(P＝0.2696＞0.05)，表明在所考察的实验温度范围内对产率的影响是不显著的。

从考察的4个反应条件因子对生物柴油产率影响的ANOVA分析结果(表五)可看出，主效应因子与生物柴油产率的相关系数R为0.9602，判别系数R²为0.9219，它们对产率影响的总效果是十分显著的(P＝0.000038＜＜0.01)。

(2)构建模型的分析讨论

从酶催化反应构建模型的独立变量显著性分析结果(表五)可看出：构建的多元二次项响应模型中，独立变量项X₁在构建模型中的显著性最明显(P＜0.01)，截距参数项、变量项X₁ ²、X₃、X₃ ²和X₄在构建模型中的显著性也相当明显(P＜0.05)，变量项X₂、X₄ ²在构建模型的a＝0.1的水平也是显著的。根据酶催化反应构建模型的回归显著性结果(表六)也可看出生物柴油产率与模型的变量参数项回归的相关系数R值为0.8855，判别系数R²为0.784，检验结果是高度显著的(P＝0.000118＜＜0.01)；由酶催化反应观察值与拟合适配的模型预测值的比较结果(表七)可看出两者数值大小相当接近，残差量小，表明所拟合适配的多元二次项模型是适宜用来反映酶催化反应的数据，适配的效果好，拟合度高。

由模型构建产生的各个参数项系数，酶催化反应中生物柴油生成率与独立变量项的具体形式可表示如下：

$Y_{\mathrm{prod}}\left(\mathrm{xi}\right)={\mathrm{\β}}_0+\underset{i=1}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\β}}_i{X}_i+\underset{i=1}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\β}}_{\mathrm{ii}}{X}_i^2$

即：Y_prod(xi)＝-955.32+24.746X₁-3.086X₁ ²+4.857X₂-0.071X₂ ²+35.399X₃-0.39X₃ ²+5.663

               X₄-0.083X₄ ²

采用反复迭代法求解上述模型函数的极大值，当酶催化反应条件参数设置为：

                    加酶量(X₁)＝4克，

                    加甲醇量(X₂)＝34毫升

                    反应温度(X₃)＝45℃

                    反应时间(X₄)＝34小时

生物柴油生成率有最大值77.15％，因而上述的酶催化反应条件是最优化的反应条件，即是能够达到最高生物柴油生成率的反应条件。

本发明的优点是：

本发明采用的是价格低廉的普通工业脂肪酶、并通过采用有效的中心组合设计方案(Central Composite Design)，考察酶催化反应体系中，4因子(脂肪酶量、甲醇量、反应温度、反应时间，分别用A，B，C，D表示)及5个水平值不同组合条件下对微藻油脂转酯化反应制备生物柴油产率的影响，构建出适宜的响应面回归模型方程，确定出微藻油脂制备生物柴油最大产率的最佳酶催化反应条件，使采用的酶催化反应制备微藻生物柴油的技术方法具有较高的产率，并且催化反应实施过程的条件温和、环境污染程度小，安全环保，成本低，具有操作可行性的效果，是值得应用于制备微藻生物柴油的好方法。

本发明的目的是：

为了探讨采用价格低廉的普通工业脂肪酶，应用于制备微藻生物柴油的酶催化反应过程中各种反应条件因子及数值水平不同组合条件下对微藻油脂转酯化反应制备生物柴油产率的影响，以便确立可达到微藻油脂制备生物柴油最大产率的最佳酶催化反应条件。

进一步具体实施例证

采用前述的酶催化反应体系，考察了4因子(脂肪酶量、甲醇量、反应温度、反应时间)及5个水平值不同组合条件下对微藻油脂转酯化反应制备生物柴油产率的影响，并构建出适宜的响应面回归模型方程，确立了可达到微藻油脂制备生物柴油最大产率的最佳酶催化反应条件。以下采用已获得的最佳酶催化反应条件，按照前述的方法，再实施微藻油脂制备生物柴油的操作过程，以便进一步验证所得结果的有效性。

实施例证1

具体的操作过程为：(1)酶催化反应的实施，准备好三角烧瓶，烘干，准确称取10藻油，加入到三角烧瓶中，并加入4克量的工业用脂肪酶和11.3毫升无水甲醇，催化反应进行到11.3和22.6小时后，再分别加入11.3毫升无水甲醇。催化反应在控温为45℃的摇床中进行，控制适宜的摇床转速，反应进行到设定的34小时，终止催化反应。(2)酶催化反应结束后的处理步骤，将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分转移至分液漏斗，静置分层。取出静置分层后的下层液相(为生物柴油粗品)，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm，静置分层后得到的上层有机相即为生物柴油，分离、取出上层有机相，准确称取所获得的生物柴油重量。(3)生物柴油产率的计算，产率(Y)＝100X生物柴油重量/微藻油脂重量。本次采用微藻油脂经酶催化反应所获得的生物柴油重量为7.593克，生物柴油制备过程的产率为75.93％.

实施例证2

具体的操作过程为：(1)酶催化反应的实施，准备好三角烧瓶，烘干，准确称取10藻油，加入到三角烧瓶中，并加入4克量的工业用脂肪酶和11.3毫升无水甲醇，催化反应进行到11.3和22.6小时后，再分别加入11.3毫升无水甲醇。催化反应在控温为45℃的摇床中进行，控制适宜的摇床转速，反应进行到设定的34小时，终止催化反应。(2)酶催化反应结束后的处理步骤，将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分转移至分液漏斗，静置分层。取出静置分层后的下层液相(为生物柴油粗品)，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm，静置分层后得到的上层有机相即为生物柴油，分离、取出上层有机相，准确称取所获得的生物柴油重量。(3)生物柴油产率的计算，产率(Y)＝100X生物柴油重量/微藻油脂重量。本次采用微藻油脂经酶催化反应所获得的生物柴油重量为7.341克，生物柴油制备过程的产率为73.41％.

实施例证3

具体的操作过程为：(1)酶催化反应的实施，准备好三角烧瓶，烘干，准确称取10藻油，加入到三角烧瓶中，并加入4克量的工业用脂肪酶和11.3毫升无水甲醇，催化反应进行到11.3和22.6小时后，再分别加入11.3毫升无水甲醇。催化反应在控温为45℃的摇床中进行，控制适宜的摇床转速，反应进行到设定的34小时，终止催化反应。(2)酶催化反应结束后的处理步骤，将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分转移至分液漏斗，静置分层。取出静置分层后的下层液相(为生物柴油粗品)，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm，静置分层后得到的上层有机相即为生物柴油，分离、取出上层有机相，准确称取所获得的生物柴油重量。(3)生物柴油产率的计算，产率(Y)＝100X生物柴油重量/微藻油脂重量。本次采用微藻油脂经酶催化反应所获得的生物柴油重量为7.637克，生物柴油制备过程的产率为76.37％.

由最佳化的酶催化反应条件下制备微藻生物柴油的进一步验证结果表明：三次的生物柴油产率分别为75.93％，73.41％和76.37％，平均值为75.24％，说明采用构建模型求解的最佳酶催化反应条件是能够比较稳定达到良好的生物柴油生成率，最佳化的酶催化反应条件是相当有效的。

Claims (7)

1.一种采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率，其特征在于：采用培养的微藻，萃取出微藻油脂用于酶催化反应制备微藻生物柴油。并采用中心组合设计方案(Central Composite Design)，考察酶催化反应体系中，4因子(脂肪酶量、甲醇量、反应温度、反应时间)及5水平不同组合条件下对微藻油脂转酯化反应制备生物柴油产率的影响，并通过建立响应面模型方程，确立可达到微藻油脂制备生物柴油最大产率的最佳酶催化反应条件，在最佳酶催化反应条件下使微藻油脂的生物柴油产率达最高。

2.按照权利要求1所述的一种采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率，其特征是所述的用于酶催化反应制备微藻生物柴油的微藻可以是微粒球藻、小球藻、金藻、角毛藻、褐指藻等微藻，或是各种微藻的混合培养物。

3.按照权利要求1所述的一种采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率，其特征是所述的酶催化反应体系中，每10克微藻油脂加入的脂肪酶量范围在1-8克。

4.按照权利要求1所述的一种采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率，其特征是所述的酶催化反应体系中，每10克微藻油脂加入的甲醇量范围在20-80毫升。

5.按照权利要求1所述的一种采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率，其特征是所述的酶催化反应的温度范围在25-55℃。

6.按照权利要求1所述的一种采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率，其特征是所述的酶催化反应的时间范围在10-50小时。

7.按照权利要求1所述的一种采用最佳酶催化反应条件提高微藻油脂制备生物柴油产率，其特征是所述的酶催化反应过程中的摇床转速的控制范围在100-500rpm。