CN105506010A - 一种复合酶提取微藻油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合酶提取微藻油脂的方法，在超声波振荡后的悬浮藻泥中加入蜗牛酶、纤维素酶、胰蛋白酶组成的复合酶以及表面活性剂，使微藻细胞酶解破裂释放出油脂，后经氯仿甲醇组成的萃取剂提取，油脂提取率达到90％以上。本油脂提取方法反应条件温和，能耗低，处理成本低，适于大规模藻类油脂的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物能源领域，具体的涉及一种复合酶提取微藻油脂的方法。
背景技术
随着人口增长和自然资源短缺的矛盾日益突出，能源危机日益加剧，原有的化石燃料已不能满足人类的日常需求，发展新型生物能源已成为全球关注的焦点。其中，以可再生油脂为原料的生物柴油发展备受关注。生物柴油是由生物油脂(脂肪酸甘油三酯)与醇(甲醇或乙醇)经酯交换反应得到的脂肪酸单烷基酯，物理性质与石化柴油接近，其硫及芳烃含量低、闪点高、十六烷值高、具有良好的润滑性。微藻油脂是生物油脂的重要来源，可达细胞干重的20-75％，主要成分为饱和及低度不饱和的长链脂肪酸，是生产生物柴油和食用油的优质原料。微藻用于油脂生产具有以下几点优势：(1)藻类油脂含量高、环境适应力强、生长周期短、光合作用效率高、产量高，单位生产力高于农业油料作物；(2)微藻油脂在水中生产，不与其他作物竞争土地，有利于环境治理。
微藻油脂的提取方法有：有机溶剂提取法、亚临界水萃取法、超临界流体萃取法、水酶法等。其中有机溶剂提取法是传统的油脂提取方法，公开号CN102533430B、CN103571610A、CN103849458A等专利公开了采用有机溶剂和酸法、机械法协同等油脂提取方法，这种方法简单易操作，但存在易污染、易燃易爆等缺点。超临界萃取是环境友好的绿色提取方法，但涉及到温度和压力控制，处理过程能耗高、经济性能差，不适合大宗化学品的提取。水酶法是一种温和油脂提取方法，但因微藻油脂在细胞内通常和蛋白质和碳水化合物结合在一块，构成复杂的复合物，阻碍了油脂的释放，导致油脂的提取率低。
发明内容
针对现有藻类油脂提取方法中存在的高污染、高能耗、提取率低等问题，本发明提供了一种复合酶提取藻类油脂的方法。
本发明采用的技术方案如下：一种复合酶提取微藻油脂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)收集生长10-20天的微藻，5000-8000rpm离心5-10min，去上清液得到藻泥，加水振荡悬浮至藻泥重量占比达到30-50％；
2)向藻泥中加入占其重量0.1-12％的表面活性剂，在100-300W的超声波振荡5-15min，加入复合酶0.5-5％，调节pH5.5-8.5，控制温度为35-60℃，保温5-15h，最后煮沸5-10min，使酶失活；
3)酶解液冷却后加入萃取剂，30-50℃恒温振荡10-30h后选择5000-8000rpm离心5-10min，取下油层经蒸馏后得到微藻油脂。
具体地，所述步骤1)中的微藻为小球藻、布朗葡萄藻、隐甲藻、杜氏盐藻、菱形藻、微拟球藻、微绿色藻或等鞭金藻。
具体地，所述步骤2)中的表面活性剂为十二烷基磺酸钠或吐温80。
具体地，所述步骤2)中的复合酶为蜗牛酶、纤维素酶、胰蛋白酶中的几种，所述复合酶优选为蜗牛酶/纤维素酶/胰蛋白酶重量比3-5:1:1-2。复合酶酶活分别为蜗牛酶大于90％，纤维素酶为2000-5000U/g，胰蛋白酶为20000-50000U/g。
具体地，所述步骤3)中的萃取剂由甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、正己烷中的一种或几种组成。萃取剂优选为氯仿/甲醇重量比1-3:1。
本发明的优点和效果：本发明中使用的蜗牛酶包含了纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种酶，在外加纤维素酶、胰蛋白酶和表面活性剂的作用下，能使微藻细胞壁、细胞膜有效成分降解破裂，并对脂蛋白、脂糖组分进行破坏，加速油脂的有效分离；反应条件温和，不使用酸碱、常温常压操作，能耗低、环境安全系数高；提取过程不需要大型设备，样品处理量大，成本低，适于大规模的工业化生产应用。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例中所用的蜗牛酶活性大于90％(即每克酵母细胞经30mg蜗牛酶在37℃反应的破比率大于90％)，纤维素酶酶活为3000U/g,胰蛋白酶活性为30000U/g。
实施例1
选用培养10天的小球藻，在5000rpm离心5min，去上清液得到藻泥，加水振荡悬浮至藻泥重量占比达到30％；在藻泥中加入表面活性剂十二烷基磺酸钠0.1％，在100W的超声波中振荡5min，加入蜗牛酶：纤维素酶：胰蛋白酶比例为3:1:1的复合酶0.5％，调节pH5.5，控制温度为35℃，保温5h，最后煮沸5min使酶失活。酶解液冷却后加入氯仿：甲醇为1:1的萃取剂，选择30℃恒温振荡10h后5000rpm离心5min，取下油层经蒸馏后得到微藻油脂，经计算得知，油脂提取率为92.7％。
实施例2
选用培养20天的小球藻，在8000rpm离心10min，去上清液得到藻泥，加水振荡悬浮至藻泥重量占比达到50％；在藻泥中加入表面活性剂十二烷基磺酸钠1％，在300W的超声波中振荡15min，加入蜗牛酶：纤维素酶：胰蛋白酶比例为5:1:2的复合酶5％，调节pH8.5,控制温度为60℃，保温15h，最后煮沸10min使酶失活。酶解液冷却后加入氯仿：甲醇为3:1的萃取剂，选择50℃恒温振荡30h后8000rpm离心10min，取下油层经蒸馏后得到微藻油脂，经计算得知，油脂提取率为93.6％。
实施例3
选用培养15天的小球藻，在6000rpm离心7min，去上清液得到藻泥，加水振荡悬浮至藻泥重量占比达到40％；在藻泥中加入表面活性剂十二烷基磺酸钠12％，在200W的超声波中振荡10min，加入蜗牛酶：纤维素酶：胰蛋白酶比例为4:1:1的复合酶3％，调节pH6,控制温度为45℃，保温10h，最后煮沸7min使酶失活。酶解液冷却后加入氯仿：甲醇为2:1的萃取剂，选择40℃恒温振荡20h后6000rpm离心7min，取下油层经蒸馏后得到微藻油脂，经计算得知，油脂提取率为98.3％。
实施例4
选用培养15天的微拟球藻，在6000rpm离心7min，去上清液得到藻泥，加水振荡悬浮至藻泥重量占比达到40％；在藻泥中加入表面活性剂吐温800.5％，在200W的超声波中振荡10min，加入蜗牛酶：纤维素酶：胰蛋白酶比例为4:1:1的复合酶3％，调节pH6,控制温度为45℃，保温10h，最后煮沸7min使酶失活。酶解液冷却后加入氯仿：甲醇为2:1的萃取剂，选择40℃恒温振荡20h后6000rpm离心7min，取下油层经蒸馏后得到微藻油脂，经计算得知，油脂提取率为96.1％。
实施例5
选用培养15天的布朗葡萄藻，处理过程同实施例4，最后经计算得知，油脂提取率为94.8％。
Claims (8)
1.一种复合酶提取微藻油脂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)收集生长10-20天的微藻，5000-8000rpm离心5-10min，去上清液得到藻泥，加水振荡悬浮至藻泥重量占比达到30-50％；
2)向藻泥中加入占其重量0.1-12％的表面活性剂，在100-300W的超声波振荡5-15min，加入复合酶0.5-5％，调节pH5.5-8.5，控制温度为35-60℃，保温5-15h，最后煮沸5-10min，使酶失活；
3)酶解液冷却后加入萃取剂，30-50℃恒温振荡10-30h后选择5000-8000rpm离心5-10min，取下油层经蒸馏后得到微藻油脂。
2.根据权利要求1所述的复合酶提取微藻油脂的方法，其特征在于，所述步骤1)中的微藻为小球藻、布朗葡萄藻、隐甲藻、杜氏盐藻、菱形藻、微拟球藻、微绿色藻或等鞭金藻。
3.根据权利要求1所述的复合酶提取微藻油脂的方法，其特征在于，所述步骤2)中的表面活性剂为十二烷基磺酸钠或吐温80。
4.根据权利要求1所述的复合酶提取微藻油脂的方法，其特征在于，所述步骤2)中的复合酶为蜗牛酶、纤维素酶、胰蛋白酶中的几种。
5.根据权利要求4所述的复合酶提取微藻油脂的方法，其特征在于，所述复合酶优选为蜗牛酶/纤维素酶/胰蛋白酶重量比3-5:1:1-2。
6.根据权利要求4或5所述的复合酶提取微藻油脂的方法，其特征在于，所述复合酶酶活分别为蜗牛酶大于90％，纤维素酶为2000-5000U/g，胰蛋白酶为20000-50000U/g。
7.根据权利要求1所述的复合酶提取微藻油脂的方法，其特征在于，所述步骤3)中的萃取剂由甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、正己烷中的一种或几种组成。
8.根据权利要求7所述的复合酶提取微藻油脂的方法，其特征在于，所述萃取剂优选为氯仿/甲醇重量比1-3:1。
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