CN104498544A - 利用微藻发酵生产生物柴油的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于能源技术领域，具体是涉及一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：(1)微藻培养；(2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵；菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为，微藻20-30g/L，柠檬酸钠3-5g/L，邻甲苯胺1.5-2.5g/L，氯化钠10-15g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁3-5g/L；(3)将发酵产物进行油脂的提取；(4)将上述油脂进行酶催化反应；本发明的利用微藻发酵生产生物柴油，产油速度快，生产成本低。

Description

利用微藻发酵生产生物柴油的方法
技术领域
本发明属于能源技术领域，具体是涉及一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法。
背景技术
生物柴油是一种清洁的可再生能源，也称之为“再生燃油”或“生物质燃料”，是优质的石油柴油代用品，通常所指的生物柴油是以大豆、油菜籽、棉籽等油料作物，油棕、黄连木等油料林木果实以及动物油脂、废餐饮油等为原料，在催化剂(碱或酸)的作用下与甲醇进行脂交换反应生成的脂肪酸甲酯。
随着环境保护和石化资源枯竭间题的日益突出，生物柴油已经成为新能源研制和开发的热点，引起了世界各国政府的高度重视。世界各国纷纷根据本国国情选择合适的油脂原料生产生物柴油。欧洲和北美地区耕地资源丰富，农业高度发达。因此欧洲各国，都采用菜籽油生产生物柴油，美国主要是利用高产转基因大豆油为原料。东南亚国家适于种植油棕，棕榈油成为当地发展生物柴油的重要原料。世界可再生能源大国巴西，主要利用蓖麻籽油进行生产生物柴油。
最近两年我国生物柴油的产能快速扩张，许多企业盲目上马生物柴油项目，并且不断扩大生产规模，已经开始出现严重后果。主要表现在：大型生物柴油企业无法保证原料供应，开工率严重不足；在国际市场原油价格高位回落，生物柴油生产原料价格上涨，尤其是食用植物油价格大幅上涨以后，使用食用植物油生产生物柴油的企业普遍亏损。因此，依托农业油脂为原料生产生物柴油并不现实。
中国发明专利申请号为201310040334.7的专利申请公开了一种利用城市生活污水培养微藻生产生物柴油的方法及系统，包括如下步骤：
降解有机废水并培养微藻：微藻通过光合作用及包括氮磷的营养物质合成藻体自身细胞物质并释放出氧气，加入的菌株群利用水中氧气对有机污染物进行降解，为微藻生长提供应用物质，以维持微藻的生长繁殖；
收集微藻：采用滤膜收集微藻，实现藻水分离；
生成生物柴油：对收集的微藻采用超声波破碎微波辅助法提取油脂，在碱性条件下加入甲醇或者乙醇作为催化剂将油脂转化为脂肪酸甲酯，再向反应体系中加入乙醚和盐溶液混合后分层，分离出乙醚相候再进行真空蒸馏获得生物柴油。
上述发明利用超声波破碎油脂，利用甲醇或乙醇作为催化剂转化油脂，虽然所使用的原料的价格都比较低，但是整个反应的效率并不高，因为利用甲醇和乙醇转化油脂的效率并不高。
中国专利申请号为201310600827.1，申请公布号为CN103642579A的专利申请公开了一种用微藻制备生物柴油的方法，包括如下步骤：
(1)微藻培养：以微藻为原料将其培养至对数生长期，以0.2-0.4的接种密度接种至新鲜培养基，培养温度为20-30℃，培养光照条件为3000-40001x，收集微藻细胞，离心浓缩，进行冷冻干燥，然后将藻粉充分研磨备用；
(2)微藻油脂的提取：称取一定量藻粉，加入氯仿甲醇水混合液进行提取，氯仿∶甲醇∶水的体积比为1∶2∶0.8-3.0，其中藻粉加入量与氯仿甲醇水的比例为1g∶100mL，混匀静置3-5h，收集上清液，加入氯仿水，使氯仿∶甲醇∶水的比例为1∶1∶0.9，收集下层氯仿层，并于60℃蒸去氯仿，得微藻油脂；
(3)微藻生物柴油制备的酶催化反应：将步骤(2)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶，脂肪酶添加量为步骤2中微藻油脂重量的20-30％，30-40℃反应48-60h，得生物柴油。
上述微藻油脂首先采用氯仿甲醇水混合液进行提取，然后蒸去氯仿，得微藻油脂；最后利用甲醇和脂肪酶对上述得到的微藻油脂进行催化反应，得到生物柴油，酶的催化效率虽然高，但是由于酶的反应受到多种物质的影响，对反应条件较为苛刻，不能达到最大反应速度和反应效率，生产成本较高，不能达到市场化的要求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法。本发明的利用微藻发酵生产生物柴油，产油速度快，生产成本低。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
本发明的目的是提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：
(1)微藻培养；
(2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为，微藻20-30g/L，柠檬酸钠3-5g/L，邻甲苯胺1.5-2.5g/L，氯化钠10-15g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁3-5g/L；
(3)将发酵产物进行油脂的提取；
(4)将上述油脂进行酶催化反应。
所述微藻优选为小球微藻或绿色巴夫藻。
所述微藻的接种密度为0.4-0.5，所述微藻的培养温度为28℃，所述微藻的培养光照为35001x。
所述发酵温度为30-32℃，所述发酵时间为2-3天。
所述发酵的接种量为5-10％。
所述发酵的pH值为5-6。
所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCCNO.M 2010119，所述根霉菌为根霉Rhizopus，保藏编号为CCTCC NO：M 209007。
所述发酵培养基的配方为，微藻25-30g/L，柠檬酸钠4-5g/L，邻甲苯胺1.5-2.0g/L，氯化钠10-12g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁3-4g/L。
所述步骤(3)中，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是，将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产物∶氯仿∶甲醇的体积比为1-2∶1∶1-2，混匀静置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇，使上清液∶氯仿∶甲醇的比例为1-2∶2∶1-2，收集下层氯仿层，并于60℃蒸去氯仿，得油脂。
所述步骤(4)中，将上述油脂进行酶催化反应的步骤是，将步骤(3)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶，脂肪酶添加量为油脂重量的20-30％，35-40℃反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪酶的重量配比为1-2∶1。其中脂肪酶为假丝酵母脂肪酶、铜铝假单胞菌脂肪酶或曲霉脂肪酶中的任意一种或多种的混合物。
本发明的有益效果在于：本发明的通过对粉碎的微藻进行混合发酵，混合发酵菌采用哈茨木霉菌和根霉菌，哈茨木霉菌和根霉菌将微藻作为氮源和碳源，使组成微藻的部分得以分解为油脂，微藻内的油脂从上述破碎的微藻细胞流出微藻细胞外，从而使培养后的微藻不需要进行粉碎操作，只需要进行收集，将大大的节省制备的时间和成本。本发明不仅可以通过一步法得到微藻内通过微藻生长积累的油脂，而且可以将微藻细胞分解成油脂，使微藻得以最大程度的利用，极大的提高生物柴油的产率和生产效率，极大的降低了生物柴油的生产成本。
本发明的微藻选用小球微藻或绿色巴夫藻，可以使微藻内积累油脂的速度更快，积累量更多。
本发明的所述微藻的接种密度为0.4-0.5，所述微藻的培养温度为28℃，所述微藻的培养光照为35001x，可以最大程度的积累油脂和使微藻生长速度最快。
本发明的所述发酵温度为30-32℃，所述发酵时间为2-3天，所述发酵的接种量为5-10％，所述发酵的pH值为5-6，采用所述的发酵条件可以使哈茨木霉菌和根霉菌最大程度的生长，并且是微藻细胞得以发酵生成油脂。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
本发明提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：
(1)小球微藻培养；所述微藻的接种密度为0.4，所述微藻的培养温度为28℃，所述微藻的培养光照为35001x；
(2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为，微藻25g/L，柠檬酸钠4g/L，邻甲苯胺2.0g/L，氯化钠10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁4g/L；所述发酵温度为30-32℃，所述发酵时间为2-3天；所述发酵的接种量为5％，所述发酵的pH值为5-6；所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCC NO.M 2010119，所述根霉菌为根霉Rhizopus，保藏编号为CCTCC NO：M 209007。
(3)将发酵产物进行油脂的提取；步骤是，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是，将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产物∶氯仿∶甲醇的体积比为2∶1∶1，混匀静置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇，使上清液∶氯仿∶甲醇的比例为1∶1∶1，收集下层氯仿层，并于60℃蒸去氯仿，得油脂。
(4)将上述油脂进行酶催化反应，步骤是，将步骤(3)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶，脂肪酶添加量为油脂重量的20％，35-40℃反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪酶的重量配比为1∶1。其中，脂肪酶为假丝酵母脂肪酶。
实施例2
本发明提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：
(1)小球微藻培养；所述微藻的接种密度为0.5，所述微藻的培养温度为28℃，所述微藻的培养光照为35001x；
(2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为，微藻30g/L，柠檬酸钠5g/L，邻甲苯胺1.5g/L，氯化钠12g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁3g/L；所述发酵温度为30-32℃，所述发酵时间为2-3天；所述发酵的接种量为10％，所述发酵的pH值为5-6；所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCC NO.M 2010119，所述根霉菌为根霉Rhizopus，保藏编号为CCTCC NO：M 209007。
(3)将发酵产物进行油脂的提取；步骤是，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是，将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产物∶氯仿∶甲醇的体积比为1∶1∶2，混匀静置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇，使上清液∶氯仿∶甲醇的比例为1∶2∶1，收集下层氯仿层，并于60℃蒸去氯仿，得油脂。
(4)将上述油脂进行酶催化反应，步骤是，将步骤(3)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶，脂肪酶添加量为油脂重量的30％，35-40℃反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪酶的重量配比为2∶1。其中，脂肪酶为铜铝假单胞菌脂肪酶。
实施例3
本发明提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：
(1)小球微藻培养；所述微藻的接种密度为0.45，所述微藻的培养温度为28℃，所述微藻的培养光照为35001x。
(2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为，微藻25g/L，柠檬酸钠4g/L，邻甲苯胺2g/L，氯化钠14g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁4g/L；所述发酵温度为30-32℃，所述发酵时间为2-3天；所述发酵的接种量为8％，所述发酵的pH值为5-6；所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCC NO.M 2010119，所述根霉菌为根霉Rhizopus，保藏编号为CCTCC NO：M 209007。
(3)将发酵产物进行油脂的提取；步骤是，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是，将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产物∶氯仿∶甲醇的体积比为2∶1∶2，混匀静置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇，使上清液∶氯仿∶甲醇的比例为2∶2∶1，收集下层氯仿层，并于60℃蒸去氯仿，得油脂。
(4)将上述油脂进行酶催化反应，步骤是，将步骤(3)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶，脂肪酶添加量为油脂重量的25％，30-35℃反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪酶的重量配比为2∶1。其中，脂肪酶为曲霉脂肪酶。
实施例4
对实施例1-3制备的生物柴油按照GB/T20828-2007标准进行了测试，以中国专利申请号为：201310600827.1的专利申请的实施例1-3制备的生物柴油作为对比例1-3做对比分析，结果如表1所示。
表1实施例1-3制备的生物柴油成品指标测试结果
性能指标 酸值(mgKH/g) 运动粘度(mm2/s) 闪点(℃) 十六烷值
实施例1 0.20 3.1 147 62
实施例2 0.21 3.5 144 61
实施例3 0.22 4.2 146 59
对比例1 0.40 3.1 141 58
对比例2 0.28 3.9 134 53
对比例3 0.52 4.5 130 54
GB/T20828-2007 ≤0.8 1.9-6.0 ≥130 ＞49
从表1可以看出，本发明制备的生物柴油和中国专利申请号为：201310600827.1的专利申请制备的生物柴油相比，在酸值、运动粘度、闪点和十六烷值上要明显优于后者。
实施例5
为了比较本发明制备的生物柴油和中国专利申请号为：201310600827.1的专利申请制备的生物柴油在产出量、产出速度、劳动量等上的区别，设计对比实验，对本发明的实施例1和中国专利申请号为：201310600827.1的专利申请实施例1制备的生物柴油进行对比分析，分析结果如下所示。
中国专利申请号为：201310600827.1的专利申请实施例1的步骤是，
(1)微藻培养：以绿色巴夫藻为原料将其培养至对数生长期，以0.3的接种密度接种至新鲜培养基，培养温度为25℃，培养光照条件为30001x，收集微藻细胞，离心浓缩，进行冷冻干燥，然后将藻粉充分研磨备用；
(2)微藻油脂的提取：称取一定量藻粉，加入氯仿甲醇水混合液进行提取，氯仿∶甲醇∶水的体积比为1∶2∶1.5，其中藻粉加入量与氯仿甲醇水的比例为1g∶100mL，混匀静置4h，收集上清液，加入氯仿水，使氯仿∶甲醇∶水的比例为1∶1∶0.9，收集下层氯仿层，并于60℃蒸去氯仿，得微藻油脂；
(3)微藻生物柴油制备的酶催化反应：将步骤(2)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶，脂肪酶添加量为25％，其中脂肪酶为假丝酵母脂肪酶、铜铝假单胞菌脂肪酶1∶1的比例混合而成，30℃反应52h，得生物柴油。
从表2中可以看出，本发明和中国专利申请号为：201310600827.1的专利申请的主要区别为，本发明在微藻生长之后油脂提取之前，直接对微藻进行发酵处理，而201310600827.1专利申请是对微藻进行离心、冷冻、粉碎处理。在使用的设备上，本发明相比201310600827.1专利申请，多了一个发酵罐，少了离心机、冷冻干燥机、粉碎机，在设备的投入方面要少得多。在生产成本方面，本发明相比201310600827.1，由于发酵步骤替代离心、冷冻、粉碎步骤，成本少了10％左右。在产出量方面，201310600827.1专利申请采用冷冻粉碎来破碎微藻细胞，得到微藻细胞内部的油脂；而本发明采用微生物发酵的方面来破碎微藻细胞得到油脂，并且将微藻细胞本身作为发酵的原料以得到油脂，因此，本发明相比201310600827.1，多产出生物柴油30％。
从上述分析可以看出，本发明相对于201310600827.1专利申请，在产出量、生产成本和投入上具有显著的进步。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)微藻培养；
(2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为，微藻20-30g/L，柠檬酸钠3-5g/L，邻甲苯胺1.5-2.5g/L，氯化钠10-15g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁3-5g/L；
(3)将发酵产物进行油脂的提取；
(4)将上述油脂进行酶催化反应。
2.如权利要求1所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述微藻为小球微藻或绿色巴夫藻。
3.如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述微藻的接种密度为0.4-0.5，所述微藻的培养温度为28℃，所述微藻的培养光照为35001x。
4.如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述发酵温度为30-32℃，所述发酵时间为2-3天。
5.如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述发酵的接种量为5-10％。
6.如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述发酵的pH值为5-6。
7.如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCC NO：M 2010119，所述根霉菌为根霉Rhizopus，保藏编号为CCTCC NO：M 209007。
8.如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述发酵培养基的配方为，微藻25-30g/L，柠檬酸钠4-5g/L，邻甲苯胺1.5-2.0g/L，氯化钠10-12g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁3-4g/L。
9.如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述步骤(3)中，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是，将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产物∶氯仿∶甲醇的体积比为1-2∶1∶1-2，混匀静置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇，使上清液∶氯仿∶甲醇的比例为1-2∶2∶1-2，收集下层氯仿层，并于60℃蒸去氯仿，得油脂。
10.如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述步骤(4)中，将上述油脂进行酶催化反应的步骤是，将步骤(3)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶，脂肪酶添加量为油脂重量的20-30％，35-40℃反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪酶的重量配比为1-2∶1。
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