CN111349679A - 蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法 - Google Patents

蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物能源技术领域，公开了蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法，其包括如下步骤：步骤1）微生物混合培养，步骤2）提取油脂，步骤3）制备生物柴油。本发明方法降低了成本，并且油脂产量提高。本发明制备的生物柴油产率和品质高，可以作为柴油替代品的理想物质。

Description

蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的 方法
技术领域
本发明属于生物新能源技术领域，具体涉及蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法。本案是申请号为2018105111460、申请日为2018年5月25日的发明专利的分案申请。
背景技术
生物柴油是一种长链脂肪酸酯类物质，是通过短链醇类物质(甲醇或者乙醇)与某些脂油类物质反应得到的产物。生物柴油最常用的生产方法是酯交换法，即在植物油脂中加入一定量的甲醇，加热至一定温度。在催化剂(酸或碱)作用下反应生成脂肪酸甲酯，并分离出副产品甘油的过程。作为可替代石化柴油的清洁生物燃料，生物柴油的使用性能与现用石化柴油基本相当，且具有更好的性能，包括：生物降解性高，环保性能好，具备较好的低温发动机启动功能和润滑功能，闪电高，安全性能好，具备可再生性能，有广阔的发展前景。
目前生物柴油的生产方法主要包括物理法和化学法，最为常用的是化学法。化学法是将动植物油脂进行化学转化，改变其分子结构，从根本上改变其流动性和黏度，因而使制得的生物柴油有类似于石化柴油的动力特性和燃烧特性。油脂的来源是目前研究的重点，主要来源包括：植物来源，动物来源以及藻类来源。植物来源是利用油菜籽、大豆、花生以及各种油料作物所提取的油脂为原料；动物来源是利用猪油、牛油以及羊油等动物脂肪或餐饮废弃油脂；藻类来源，微藻在生长过程可合成大量油脂，微藻油脂属于单细胞油脂，其主要组分是甘油和脂肪酸，是由微藻在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在藻体内合成的，主要作为生物膜组分、代谢物和能量来源。由于植物来源，动物来源，原料生命周期长，资源总量不足，经济效益低，以及其对农产品价格、耕地资源、粮食安全的影响，制约了生物柴油的发展。相对于传统的植物来源以及动物来源生物柴油原料，微藻具有分布广泛、生长周期短、生物量大、环境适应能力强、油脂含量高、不与粮争地、不与人争粮等巨大优势，受到科研人员的大力追捧，被认为是解决目前生物柴油原料不足的重要途径之一。目前，藻类来源的油脂是研究的热点。作为新一代生物柴油原料，微藻拥有很多优势。藻类种类繁多，广泛分布于淡水和海水中。全球已经鉴定的微藻有几万种，而且其数量还在不断增加。相对于传统的油料作物，微藻具有生物量大、生长周期短。微藻的生长速率远远高于陆生作物，一般微藻在24h内其生物量就可以加倍，在指数生长期的生物量倍增时间一般为3-5h。微藻油的成分与植物油相似，是植物油的替代品，可直接运用现有技术生产生物柴油。正常培养条件下，一般微藻的含油量都可达20％～50％，部分微藻还能用海水培养，能耐受沙漠、干旱地、半干旱地等极端环境，不占用耕地，因此不会对粮食作物的生产构成威胁。微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量C02和氮化物或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。
微藻的生物化学成分可以通过环境条件的改变加以调节，从而提高含油量。浙江地区藻类品种丰富，具备进行藻类生产生物柴油研究的天然有利条件。目前利用藻类生产柴油产业化最大的问题是，如何降低培养成本以及提高产油率。由于不同种类微藻的油脂含量及生长能力存在差异，在进行微藻培养之前需要对微藻种类进行筛选。选择的微藻菌株必须具有高生产力和高的油脂含量，有较强的抗污能力，并且能够适应环境的变化。最常见的微藻有小球藻、杜氏藻、微拟球藻、紫球藻、栅藻等，因其本身较高的油脂含量和生长率常被用于微藻生物柴油的生产。但是也有许多研究者通过改变微藻的生长环境或利用基因工程来提高微藻的油脂含量和生长率。
蛋白核小球藻作为一类可再生能源生物质可以在光自养和异养的培养条件下积累油脂，能有效利用太阳能和有机能进行快速生长和积累油脂，蛋白核小球藻的油脂可以作为再生能源用于制作生物柴油。但目前蛋白核小球藻规模化培养存在着生长缓慢，生物量低，油脂含量低的问题，不利于大规模培养。CN106754383A公开了小球藻和产油酵母共同培养以提高油脂产量的方法，该方法是将二者同时接种到培养基中，混合培养微生物干粉总脂肪含量可达到40.55％，总脂肪酸产率达到175.64mg/l/d，显著大于单独培养的微藻细胞，是单独培养的酵母细胞的两倍以上。但是仍然存在脂肪含量有待提高、发酵成本较高以及周期长的缺陷。“王步江等，天津农学院学报，发酵条件对蛋白核小球藻脂肪含量的影响”，研究了培养基中的碳源、氮源、碳氮比、pH、温度等对其生物量和脂肪含量的影响，采用葡萄糖为主要原料，发酵液中的藻体含量达到5.6g/L，脂肪含量可达到1.46g/L。木薯渣是木薯提取淀粉后的副产物，主要指标包括粗纤维、粗灰分、水分，营养成本较低，一般用作饲料或废弃。在杭州地区有大量的淀粉厂，用木薯来加工生产淀粉时会产生很多的木薯渣，如何对木薯渣进行有效利用也是需要解决的技术问题。申请人之前的专利技术“蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备油脂的方法”通过混合培养，采用木薯渣为主要原料，提高了油脂产量，降低了发酵成本；在此基础上，申请人继续进行研究，将油脂制备成生物柴油。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术藻类产生物柴油效率低以及培养成本高等缺陷，提供了蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法，其包括如下步骤：步骤1）微生物混合培养，步骤2）提取油脂，步骤3）制备生物柴油。
具体地，所述步骤1）微生物混合培养，包括如下步骤：将处于对数生长期的蛋白核小球藻液和里氏木霉种子液接种到含有木薯渣的培养基中，温度为28℃，24小时持续光照，强度为6000-8000Lux，转速为100rpm，发酵时间为2-3天，然后接入黑曲霉种子液，继续培养3-4天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，得到微生物粉末；所述培养基的组成如下：木薯渣50-80g/L，硝酸钠 1-2g/L，磷酸二氢钾 0.5-1g/L，氯化钠 0.1-0.2g/L，七水硫酸镁 100-200mg/L，氯化钙50-70mg/L，柠檬酸铁铵20-30mg/L，七水硫酸锌10-15mg/L。
具体地，所述步骤2）提取油脂，包括如下步骤：将微生物粉末采用脉冲电场处理，然后将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，超声提取，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂。
具体地，所述步骤3）制备生物柴油，包括如下步骤：
将油脂、脂肪酶以及甲醇按照5ml：1g：6ml的体积比添加到反应器中，催化反应12小时，然后添加占油脂两倍体积的甲醇，继续催化反应20h，终止反应，催化反应在控温为45℃的摇床中进行，摇床转速为100rpm；将反应体系的混合物以12000rpm离心10分钟，将上层液相部分移出，静置分层；取出静置分层后的下层液相，即为生物柴油粗品，再次以12000rpm离心10分钟，，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次以12000rpm离心10分钟， 静置分层后得到的上层有机相，分离、取出上层有机相，即得生物柴油。
优选地，所述里氏木霉种子液按照如下工艺制备而得：里氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得里氏木霉种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基均为PDA液体培养基。
优选地，所述蛋白核小球藻液按照如下工艺制备而得：挑取蛋白核小球藻，种到含有生长培养基的容器中，光照强度6000lux，28℃培养，每天摇动容器2-3次，待生长至对数生长期，得到蛋白核小球藻液；所述生长培养基的组分为：葡萄糖10g/L，氯化铵 2g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁 100mg/L，氯化钙30mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L。
优选地，所述黑曲霉种子液按照如下工艺制备而得：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉50g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。
优选地，所述脉冲电场处理为：电场强度20kV/cm，脉冲宽度4us，处理时间200us。
优选地，所述超声提取为：提取温度为60-65℃，超声功率为100-200W，提取时间为60-90min。
优选地，所述氯仿甲醇混合溶液由氯仿与甲醇按照体积比为2:1制得。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：
藻类的生长量和油脂产量并不完全成正相关比例，通过调整外界因素使得生长量处于合理的范围内，以及油脂产量最大化，一直以来是技术难点。里氏木霉利用发酵木薯渣产生还原糖，还原糖能够促进藻类的生长速率，增加生物量，待藻类达到一定生长量后，接种黑曲霉，黑曲霉能够较快的利用氮源以及部分还原糖，从而与藻类产生竞争，使得藻类在氮限制和养分剥夺胁迫条件下，通过氮限制或营养限制来获得更高的油脂含量。而且黑曲霉还能够产生大量的二氧化碳无机碳源，从而提升藻类的油脂产量。里氏木霉和黑曲霉也能够产生油脂类物质，并且本发明培养中使用了木薯渣作为主要原料，价格低廉，降低了企业成本。混合培养中微藻光合作用释放的氧气可被菌体细胞利用，因而使得混合培养体系处于一个平衡状态。合适处理时间的强电场能够对细胞内极性分子产生影响，在细胞膜上产生震荡，发生不可恢复的破坏作用，使得细胞膜通透性增强，最终可以加快胞内外油脂的交换效率。当超声波作用于液体反应体系时，由于超声波的空化作用，液体内会有大量微小的气泡形成，而且这些气泡的产生和破灭十分迅速，反应体系会产生局部的高温和高压，可以达到破坏细胞壁的作用，可以增加溶剂与胞内物质的接触机会。本发明利用脉冲电场协同超声波提取油脂是一个高效的方法，结合了二者的优势，不仅缩短了反应的时间，还可降低反应能耗。利用本发明油脂制备的生物柴油产率高，生物柴油成分中C16和C18脂肪酸甲酯的百分含量达到95％以上，可以作为柴油替代品的理想物质。
附图说明
图1：不同脉冲电场时间对油脂产量的影响；
图2：超声功率和超声时间对油脂产量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备油脂的方法，其包括如下步骤：
将里氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得里氏木霉种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基均为PDA液体培养基；
挑取蛋白核小球藻，种到含有生长培养基的容器中，光照强度6000lux，28℃培养，每天摇动容器2-3次，待生长至对数生长期，得到蛋白核小球藻液；所述生长培养基的组分为：葡萄糖10g/L，氯化铵 2g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁100mg/L，氯化钙30mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L；
将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉50g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。
将处于对数生长期的蛋白核小球藻液和里氏木霉种子液接种到含有培养基的反应池中，蛋白核小球藻和里氏木霉的接种密度分别为1×106个/ml和1×107cfu/ml，温度为28℃，24小时持续光照，强度为6000Lux，转速为100rpm，发酵时间为3天，然后接入黑曲霉种子液，接种密度为5×107cfu/ml，继续培养3天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；所述培养基的具体组成如下：木薯渣50g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁 100mg/L，氯化钙50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L。
将粉末采用脉冲电场处理，电场强度20kV/cm，脉冲宽度4us，处理时间200us，然后将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，超声提取，提取温度为60℃，超声功率为200W，提取时间为60min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂；
油脂、脂肪酶（1万U/g）以及甲醇按照5ml：1g：6ml的体积比添加到反应器中，催化反应12小时，然后添加占油脂两倍体积的甲醇，继续催化反应20h，终止反应，催化反应在控温为45℃的摇床中进行，摇床转速为100rpm；将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分移出，静置分层；取出静置分层后的下层液相，即为生物柴油粗品，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm， 静置分层后得到的上层有机相，分离、取出上层有机相，即得生物柴油。
实施例2
蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备油脂的方法，其包括如下步骤：
将里氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得里氏木霉种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基均为PDA液体培养基；
挑取蛋白核小球藻，种到含有生长培养基的容器中，光照强度6000lux，28℃培养，每天摇动容器2-3次，待生长至对数生长期，得到蛋白核小球藻液；所述生长培养基的组分为：葡萄糖10g/L，氯化铵 2g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁100mg/L，氯化钙30mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L；
将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉50g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。
将处于对数生长期的蛋白核小球藻液和里氏木霉种子液接种到含有培养基的反应池中，蛋白核小球藻和里氏木霉的接种密度分别为1×106个/ml和1×107cfu/ml，温度为28℃，24小时持续光照，强度为7000Lux，转速为100rpm，发酵时间为3天，然后接入黑曲霉种子液，接种密度为5×107cfu/ml，继续培养4天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；所述培养基的具体组成如下：木薯渣80g/L，硝酸钠 2g/L，磷酸二氢钾 1g/L，氯化钠 0.2g/L，七水硫酸镁 200mg/L，氯化钙70mg/L，柠檬酸铁铵30mg/L，七水硫酸锌15mg/L。
将粉末采用脉冲电场处理，电场强度20kV/cm，脉冲宽度4us，处理时间200us，然后将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，超声提取，提取温度为65℃，超声功率为100W，提取时间为90min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂；
油脂、脂肪酶（1万U/g）以及甲醇按照5ml：1g：6ml的体积比添加到反应器中，催化反应12小时，然后添加占油脂两倍体积的甲醇，继续催化反应20h，终止反应，催化反应在控温为45℃的摇床中进行，摇床转速为100rpm；将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分移出，静置分层；取出静置分层后的下层液相，即为生物柴油粗品，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm， 静置分层后得到的上层有机相，分离、取出上层有机相，即得生物柴油。
对比例1
不添加里氏木霉和黑曲霉，其余同实施例1。
对比例2
不添加黑曲霉，其余同实施例1。
对比例3
蛋白核小球藻、里氏木霉以及黑曲霉同时添加，其余同实施例1。
实施例3
本发明实施例和对比例中生物质干重含量、总脂肪含量（占生物质干重的百分比）以及油脂产量检测。具体检测结果见表1；
表1
组别 培养时间d 生物质干重含量g/L 总脂含量% 油脂产量g/L
实施例1 6 4.37 44.5 1.94
对比例1 6 3.02 35.2 1.06
对比例2 6 4.19 37.8 1.58
对比例3 6 3.74 41.6 1.56
结论：通过表1验证了菌株类型、添加时机对生物质干重含量、总脂肪含量以及油脂产量的影响，发现，实施例1物质干重含量、总脂肪含量以及油脂产量各指标均高于对比例1-3；对比例1不添加菌株，仅采用藻类培养，各方面指标最低，油脂产量比实施例1降低了40%左右；对比例2仅采用里氏木霉，其中，里氏木霉利用发酵木薯渣产生还原糖，还原糖能够促进藻类的生长速率，增加生物量，但是与实施例1相比，持续充足的营养尽管可以维持较高的微生物质量，但是降低了油脂含量；对比例3同时接种黑曲霉，导致黑曲霉过渡竞争碳源，造成藻类养分不足，导致藻类生长缓慢；实施例1是待藻类基本达到较高生长量后，再接种黑曲霉，黑曲霉能够较快的速度利用氮源以及部分还原糖，从而与藻类产生竞争，使得藻类在氮限制和养分剥夺的胁迫条件下，通过养分限制来获得更高的油脂含量，而且黑曲霉还能够产生大量的二氧化碳无机碳源，从而提升藻类的油脂产量。
实施例4
不同脉冲电场时间对油脂产量的影响，以实施例1为例，分别设置0，100，200，400，600us对油脂产量的影响，如图1所示，随着处理时间的增加，油脂产量增幅明显，200us后，增加处理时间并不会给油脂产量带来明显影响，因此选择200us最为合适。合适处理时间的强电场能够对细胞内极性分子产生影响，在细胞膜上产生震荡，发生不可恢复的破坏作用，使得细胞膜通透性增强，最终可以加快胞内外油脂的交换效率。
实施例5
超声功率和超声时间对油脂产量的影响：
设置超声功率为50w，100w，200w，400w，800w；超声提取时间为15，30，60，90，120min，如图2所示，随着超声功率和超声时间的增加，油脂产量逐步增加，最终超声功率选择100-200W、处理时间为60-90min时，油脂的提取效果最佳。当超声波作用于液体反应体系时，由于超声波的空化作用，液体内会有大量微小的气泡形成，而且这些气泡的产生和破灭十分迅速，反应体系会产生局部的高温和高压，可以达到破坏植物细胞壁的作用，可以增加溶剂与胞内物质的接触机会。本发明利用脉冲电场协同超声波提取油脂是一个高效的方法，结合了二者的优势，不仅缩短了反应的时间，还可降低反应能耗。
实施例6
在实施例4的基础上，本发明还检测了各组别生物柴油的产率（生物柴油产率的计算，产率(Y)＝（生物柴油重量/微藻油脂重量）×100%，通过GC-MS分析了生物柴油的组成，具体见表2。
表2
组别 生物柴油的产率% C16总含量% C18总含量%
实施例1 81.6 39.2 57.7
对比例1 82.1 28.5 60.8
对比例2 81.3 35.6 56.4
对比例3 80.1 31.7 58.1
如表2所示，各组别生物柴油的产率相近，在80%左右。柴油中的C原子在16-18个比较合适，具备较好的流通性，易于氧化，能够保证充分燃烧，实施例1中生物柴油主要成分C16和C18的百分含量占油脂总量的96.9％，没有芳香烃的存在，可以保证充分燃烧，不会产生炭黑；C16和C18的百分含量明显高于对比例1-3，与传统柴油类似，可以作为传统柴油比较合适的替代品。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备生物柴油的方法，其包括如下步骤：步骤1）微生物混合培养，步骤2）提取油脂，步骤3）制备生物柴油。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物包括里氏木霉、蛋白核小球藻、黑曲霉中的任意两种以上组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物包括里氏木霉、蛋白核小球藻和黑曲霉。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）微生物混合培养：将处于对数生长期的蛋白核小球藻液和里氏木霉种子液接种到含有培养基的反应池中，蛋白核小球藻和里氏木霉的接种密度分别为1×106个/ml和1×107cfu/ml，温度为28℃，24小时持续光照，强度为6000Lux，转速为100rpm，发酵时间为3天，然后接入黑曲霉种子液，接种密度为5×107cfu/ml，继续培养3天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；所述培养基的具体组成如下：木薯渣50g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁 100mg/L，氯化钙50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L；
步骤2）提取油脂：将粉末采用脉冲电场处理，电场强度20kV/cm，脉冲宽度4us，处理时间200us，然后将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，超声提取，提取温度为60℃，超声功率为200W，提取时间为60min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂；
步骤3）制备生物柴油：油脂、脂肪酶以及甲醇按照5ml：1g：6ml的体积比添加到反应器中，催化反应12小时，然后添加占油脂两倍体积的甲醇，继续催化反应20h，终止反应，催化反应在控温为45℃的摇床中进行，摇床转速为100rpm；将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分移出，静置分层；取出静置分层后的下层液相，即为生物柴油粗品，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm， 静置分层后得到的上层有机相，分离、取出上层有机相，即得生物柴油。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述里氏木霉种子液按照如下工艺制备而得：里氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后接入二级种子培养基培养，获得里氏木霉种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基均为PDA液体培养基。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白核小球藻液按照如下工艺制备而得：挑取蛋白核小球藻，接种到含有生长培养基的容器中，光照强度6000lux，28℃培养，每天摇动容器2-3次，待生长至对数生长期，得到蛋白核小球藻液；所述生长培养基的组分为：葡萄糖10g/L，氯化铵 2g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁 0.1g/L，氯化钙30mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉种子液按照如下工艺制备而得：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后接入二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉50g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的酶活力为1万U/g。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氯仿甲醇混合溶液由氯仿与甲醇按照体积比为2:1制得。
10.按照权利要求1-9任其一所述的方法制备的生物柴油。
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