CN108611379B

CN108611379B - 提高单针藻细胞油脂产率的方法

Info

Publication number: CN108611379B
Application number: CN201810452822.1A
Authority: CN
Inventors: 宋庆恒; 潘宏涛; 陈生红; 洪元明
Original assignee: Hangzhou Fuyang Youxin Technology Co ltd
Current assignee: HANGZHOU FUYANG YOUXIN TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2018-05-13
Filing date: 2018-05-13
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2038-05-13
Also published as: CN108611379A

Abstract

本发明属于藻类技术领域，公开了提高单针藻细胞油脂产率的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备产黄纤维单胞菌种子液，步骤2）制备单针藻液，步骤3）制备黑曲霉种子液，步骤4）混合培养单针藻，步骤5）提取油脂。本发明方法产油脂效率高，培养成本低廉，应用前景广阔。

Description

提高单针藻细胞油脂产率的方法

技术领域

本发明属于藻类技术领域，具体涉及提高单针藻细胞油脂产率的方法。

背景技术

由于大气中二氧化碳的量不断增加，温室效应也在加剧，而化石能源的燃烧加快了这一过程，因此寻找新的可持续的再生能源，可有效减少向大气中排放二氧化碳。生物柴油是一种长链脂肪酸酯类物质，是通过短链醇类物质(甲醇或者乙醇)与某些脂油类物质反应得到的产物。

油脂的来源是目前研究的重点，主要来源包括：植物来源，动物来源以及藻类来源。植物来源是利用油菜籽、大豆、花生以及各种油料作物所提取的油脂为原料；动物来源是利用猪油、牛油以及羊油等动物脂肪或餐饮废弃油脂；藻类来源，微藻在生长过程可合成大量油脂，微藻油脂属于单细胞油脂，其主要组分是甘油和脂肪酸，是由微藻在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在藻体内合成的，主要作为生物膜组分、代谢物和能量来源。由于植物来源，动物来源，原料生命周期长，资源总量不足，经济效益低，以及其对农产品价格、耕地资源、粮食安全的影响，制约了生物柴油的发展。相对于传统的植物来源以及动物来源生物柴油原料，微藻具有分布广泛、生长周期短、生物量大、环境适应能力强、油脂含量高、不与粮争地、不与人争粮等巨大优势，受到科研人员的大力追捧，被认为是解决目前生物柴油原料不足的重要途径之一。目前，藻类来源的油脂是研究的热点。作为新一代生物柴油原料，微藻拥有很多优势。藻类种类繁多，广泛分布于淡水和海水中。全球已经鉴定的微藻有几万种，而且其数量还在不断增加。相对于传统的油料作物，微藻具有生物量大、生长周期短等优点。微藻的生长速率远远高于陆生作物，一般微藻在24h内其生物量就可以加倍，在指数生长期的生物量倍增时间一般为3-5h。微藻油的成分与植物油相似，是植物油的替代品，可直接运用现有技术生产生物柴油。正常培养条件下，一般微藻的含油量都可达20％～50％，微藻能用海水培养，能耐受沙漠、干旱地、半干旱地等极端环境，不占用耕地，因此不会对粮食作物的生产构成威胁。微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量C02和氮化物或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。

微藻的生物化学成分可以通过环境条件的改变加以调节，从而提高含油量。浙江地区藻类品种丰富，具备进行藻类生产生物柴油研究的天然有利条件。目前利用藻类生产柴油产业化最大的问题是，如何降低培养成本以及提高产油率。由于不同种类微藻的油脂含量及生长能力存在差异，在进行微藻培养之前需要对微藻种类进行筛选。选择的微藻菌株必须具有高生产力和高的油脂含量，有较强的抗污能力，并且能够适应环境的变化，可以大规模培养。目前，最常见的可以规模化培养的藻类有小球藻、杜氏藻、金藻等，因其本身较高的油脂含量和生长率常被用于微藻生物柴油的生产。但是也有许多研究者通过改变微藻的生长环境来提高微藻的油脂含量和生长率，例如CN105132404以及CN105132351通过超声波和高温胁迫来刺激藻类细胞产生油脂，在一定程度上提高了油脂含量，具有一定的指导意义；“于海峰等，有机碳源对发状念珠藻单体细胞生长和光合作用的影响. 高校化学工程学报2008年”研究了有机碳源对发状念珠藻细胞生长及光合作用的影响，发现葡萄糖能够极大促进发状念珠藻细胞生长及光合作用。

单针藻属于淡水藻，可以自养和异养繁殖，油脂含量一般可达到40％左右，是较为理想的油脂来源。CN104611228A公开了通过对单针藻进行二氧化碳驯化来提高油脂产量的方法，油脂产量可达到40%左右。木薯渣是木薯提取淀粉后的副产物，主要指标包括粗纤维、粗灰分、水分，营养成本较低，一般用作饲料或废弃。在杭州地区有大量的淀粉厂，用木薯来加工生产淀粉时会产生很多的木薯渣，如何对木薯渣进行有效利用也是需要解决的技术问题。申请人之前的专利技术“蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备油脂的方法”采用里氏木霉对木薯渣进行分解处理，然后接种黑曲霉，大大提高了蛋白核小球藻的油脂产量。在此基础上，申请人继续对单针藻进行产油研究。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术藻类产油脂效率低以及培养成本高等缺陷，提供了提高单针藻细胞油脂产率的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

提高单针藻细胞油脂产率的方法，其包括如下步骤：

提高单针藻细胞油脂产率的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备产黄纤维单胞菌种子液，步骤2）制备单针藻液，步骤3）制备黑曲霉种子液，步骤4）混合培养单针藻，步骤5）提取油脂。

进一步地，所述步骤1）制备产黄纤维单胞菌种子液，包括如下步骤：将产黄纤维单胞菌划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得产黄纤维单胞菌种子液。

进一步地，所述步骤2）制备单针藻液，包括如下步骤：挑取单针藻，种到含有生长培养基的容器中，光照强度5000lux，光暗周期为24h，光暗比为14:10，28℃培养，待生长至对数生长期，得到单针藻液。

进一步地，所述步骤3）制备黑曲霉种子液，包括如下步骤：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液。

进一步地，所述步骤4）混合培养单针藻，包括如下步骤：将处于对数生长期的单针藻液和产黄纤维单胞菌种子液接种到含有培养基的反应池中，温度为28℃，光照强度5000lux，光暗周期为24h，光暗比为14:10，转速为100rpm，发酵时间为4天，然后接入黑曲霉种子液，继续培养3-4天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末。

优选地，

所述培养基的组成如下：木薯渣50-70g/L，硝酸钠 2-3g/L，磷酸二氢钾 0.1-0.2g/L，碳酸钠 0.1-0.2g/L，七水硫酸镁50-70mg/L，氯化钙30-50mg/L。

优选地，

所述步骤5）提取油脂，包括如下步骤：将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，微波提取，然后超声提取，再进行离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂。

优选地，

所述微波提取的参数为：微波功率为100W，提取时间为30-60min，提取温度为55-60℃。

优选地，

所述超声提取的参数为：超声功率为200W，提取时间为30-60min，提取温度为55-60℃。

与现有技术相比，本发明的研究的出发点和取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：

本发明采用里氏木霉与单针藻共同培养发现，单针藻增长缓慢，并且出现了少量死亡，可能是因为里氏木霉能够产生拮抗单针藻生长的物质，因此，申请人选用其他可以降解木薯渣的菌株，发现产黄纤维单胞菌和单针藻液可以共生。产黄纤维单胞菌利用发酵木薯渣产生还原糖，还原糖能够促进藻类的生长速率，增加生物量，待藻类达到一定生长量后，接种黑曲霉，黑曲霉能够较快的利用氮源以及部分还原糖，从而与藻类产生竞争，使得藻类在氮限制和养分剥夺的的胁迫条件下，通过氮限制或营养限制来获得更高的油脂含量。而且黑曲霉还能够产生大量的二氧化碳无机碳源，从而提升藻类的油脂产量。本发明培养中使用了木薯渣作为主要原料，价格低廉，降低了企业成本。混合培养中微藻光合作用释放的氧气可被菌体细胞利用，因而使得混合培养体系处于一个平衡状态。微波的高频电磁波穿透待提物质，进入物料内部的微管束和腺胞系统，细胞内部通过吸收微波能，温度会快速上升，受到温度升高产生的压力后，细胞壁开始逐渐膨胀遭到破坏，形成微小的空洞，内部有效成分可轻松被提取液带出细胞组织。当超声波作用于液体反应体系时，由于超声波的空化作用，液体内会有大量微小的气泡形成，而且这些气泡的产生和破灭十分迅速，反应体系会产生局部的高温和高压，可以达到破坏细胞壁的作用，可以增加溶剂与胞内物质的接触机会。利用微波与超声处理生物质结合了二者的优势，油脂提取率提高。

附图说明

图1：培养时间对油脂中脂肪酸组分的影响；

图2：培养时间对油脂产量和生物质干重量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

提高单针藻细胞油脂产率的方法，其包括如下步骤：

将产黄纤维单胞菌划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得产黄纤维单胞菌种子液；所述斜面培养基组分为：酵母膏50g/L，葡萄糖30g/L，琼脂20g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉30g/L，葡萄糖20g/L，硝酸铵1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L；

挑取单针藻，种到含有生长培养基的容器中，光照强度5000lux，光暗周期为24h，光暗比为14:10，28℃培养，待生长至对数生长期，得到单针藻液；所述生长培养基的组分为：BG-11培养基+10g/L葡萄糖；

将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉50g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。

将处于对数生长期的单针藻液和产黄纤维单胞菌种子液接种到含有培养基的反应池中，单针藻和产黄纤维单胞菌的接种密度分别为0.5×10⁶个/ml和1×10⁷cfu/ml，温度为28℃，光照强度5000lux，光暗周期为24h，光暗比为14:10，转速为100rpm，发酵时间为4天，然后接入黑曲霉种子液，接种密度为1×10⁸cfu/ml，继续培养3天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；所述培养基的具体组成如下：木薯渣50g/L，硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾 0.1g/L，碳酸钠 0.1g/L，七水硫酸镁50mg/L，氯化钙30mg/L。

将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，微波提取，微波功率为100W，提取时间为30min，提取温度为60℃，然后进行超声提取，提取温度为60℃，超声功率为200W，提取时间为60min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂。

实施例2

提高单针藻细胞油脂产率的方法，其包括如下步骤：

将处于对数生长期的单针藻液和产黄纤维单胞菌种子液接种到含有培养基的反应池中，单针藻和产黄纤维单胞菌的接种密度分别为0.5×10⁶个/ml和1×10⁷cfu/ml，温度为28℃，光照强度5000lux，光暗周期为24h，光暗比为14:10，转速为100rpm，发酵时间为4天，然后接入黑曲霉种子液，接种密度为1×10⁸cfu/ml，继续培养3天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；所述培养基的具体组成如下：木薯渣70g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾 0.2g/L，碳酸钠 0.2g/L，七水硫酸镁70mg/L，氯化钙50mg/L。

将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，微波提取，微波功率为100W，提取时间为40min，提取温度为55℃，然后进行超声提取，提取温度为55℃，超声功率为200W，提取时间为40min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂。

对比例1

不添加产黄纤维单胞菌和黑曲霉，其余同实施例1。

对比例2

不添加黑曲霉，其余同实施例1。

对比例3

单针藻、产黄纤维单胞菌和黑曲霉同时添加，其余同实施例1。

实施例3

本发明检测了培养时间对油脂中脂肪酸组分的影响：

不同藻种的脂肪酸组成存在很大差异，C16和C18的含量是决定油脂性能的重要因素。以实施例1为例，设置时间梯度为1，3，5，7，9（d），通过GC-MS分析油脂的组成，单针藻在异养培养过程中产生的脂肪酸主要为 C16和C18。如图1所示，在培养初期仅有少量C16存在，随着培养时间增加，C16含量随之增加，在第5天时达到顶峰，随后有所降低，但是降幅不大；C18在第3天时才开始产生，随后快速增加，待第7天后增幅并不明显，结合培养成本和时间来综合考虑，选择培养7天左右最合适。

实施例4

不同培养时间对油脂产量（g/L）和生物质干重量（g/L）的影响，分别设置时间梯度为1，3，5，7，9（d），以实施例1为例进行检测。如图2所示，随着培养时间的增加，油脂产量和生物质干重含量均明显增加；从第5天开始，油脂产量大幅增加，培养到第7天时，油脂含量达到峰值，可能是因为黑曲霉产生了二氧化碳以及其他可以促进藻类产生油脂的物质，使得单针藻油脂产量迅速增加，继续培养，油脂产量并没有增加。培养到第7天时，生物质重量接近峰值，随着培养时间的增加，生物质重量增幅缓慢，第9天时并没有明显的提高，可能是因为接种了黑曲霉后，对藻类营养产生了竞争，使得藻类生长缓慢。

实施例5

本发明实施例1和对比例1-3中生物质干重含量、总脂肪含量（占生物质干重的百分比）以及油脂产量检测。具体检测结果见表1：

表1

组别	培养时间d	生物质干重含量g/L	总脂含量%	油脂产量g/L
					实施例1	7	4.47	48.6	2.17
对比例1	7	3.51	40.7	1.43
					对比例2	7	4.11	42.9	1.76
对比例3	7	3.97	44.1	1.75

结论：通过表1验证了菌株类型、添加时机对生物质干重含量、总脂肪含量以及油脂产量的影响，发现，实施例1物质干重含量、总脂肪含量以及油脂产量各指标均高于对比例1-3；对比例1不添加菌株，仅采用藻类培养，各方面指标最低；对比例2仅采用产黄纤维单胞菌，其中，产黄纤维单胞菌利用发酵木薯渣产生还原糖，还原糖能够促进藻类的生长速率，增加生物量，但是与实施例1相比，持续充足的营养尽管可以维持较高的微生物质量，但是降低了油脂含量；对比例3同时接种黑曲霉，导致黑曲霉过渡竞争碳源，造成藻类养分不足，导致藻类生长缓慢；实施例1是待藻类基本达到较高生长量后，再接种黑曲霉，黑曲霉能够较快的利用氮源以及部分还原糖，从而与藻类产生竞争，使得藻类在氮限制和养分剥夺的胁迫条件下，通过养分限制来获得更高的油脂含量，而且黑曲霉还能够产生大量的二氧化碳无机碳源，从而提升藻类的油脂产量。

实施例6

微波和超声波对油脂提取的影响：

设置对照组，对照组1为仅采用微波处理，处理时间为90min，其余同实施例1；对照组2仅采用超声处理，处理时间为90min，其余同实施例1。具体见表2：

表2

组别	实施例1	对照组1	对照组2
				油脂产量g/L	2.17	1.98	2.05
降幅%	-----	9.6	5.9

结论：如表2所示，对照组的油脂产量相对于实施例1均有所降低，分别降低了9.6%和5.9。说明，先后利用微波与超声进行处理生物质，充分结合了二者的优势，提高了油脂提取效率。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.提高单针藻细胞油脂产率的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备产黄纤维单胞菌种子液，步骤2）制备单针藻液，步骤3）制备黑曲霉种子液，步骤4）混合培养单针藻，步骤5）提取油脂；

所述步骤1）制备产黄纤维单胞菌种子液，包括如下步骤：将产黄纤维单胞菌划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后接入二级种子培养基培养，获得产黄纤维单胞菌种子液；

所述步骤2）制备单针藻液，包括如下步骤：挑取单针藻，接种到含有生长培养基的容器中，光照强度5000lux，光暗周期为24h，光暗比为14:10，28℃培养，待生长至对数生长期，得到单针藻液；

所述步骤3）制备黑曲霉种子液，包括如下步骤：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后接入二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；

所述步骤4）混合培养单针藻，包括如下步骤：将处于对数生长期的单针藻液和产黄纤维单胞菌种子液接种到含有培养基的反应池中，温度为28℃，光照强度5000lux，光暗周期为24h，光暗比为14:10，转速为100rpm，发酵时间为4天，然后接入黑曲霉种子液，继续培养3-4天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基的组成如下：木薯渣50-70g/L，硝酸钠 2-3g/L，磷酸二氢钾 0.1-0.2g/L，碳酸钠 0.1-0.2g/L，七水硫酸镁50-70mg/L，氯化钙30-50mg/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微波提取的参数为：微波功率为100W，提取时间为30-60min，提取温度为55-60℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声提取的参数为：超声功率为200W，提取时间为30-60min，提取温度为55-60℃。