CN108950088A

CN108950088A - 一种鉴别葡萄卷叶病毒3和葡萄茎痘病毒的双重pcr引物及方法

Info

Publication number: CN108950088A
Application number: CN201811003716.1A
Authority: CN
Inventors: 李升�; 李玲玉; 龙天文
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2018-12-07

Abstract

本发明涉及一种鉴别葡萄卷叶病毒3(GLRaV‑3)与葡萄茎痘病毒(GRSPaV)的双重PCR引物及方法，步骤如下：(1)提取植株的总RNA；(2)以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA；(3)以cDNA为模板对GLRaV‑3的HSP70蛋白部分编码序列和GRSPaV的衣壳蛋白部分编码序列进行PCR扩增；(4)对步骤(3)制得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明涉及上述PCR引物组合，利用双重PCR方法来进行GLRaV‑3与GRSPaV的鉴定，结果准确、方法快速简便，节约检测成本，大大提高了病毒检测效率，具有良好的应用前景。

Description

一种鉴别葡萄卷叶病毒3和葡萄茎痘病毒的双重PCR引物及方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的双重PCR引物及方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

葡萄卷叶病毒3(Grapevine leafroll associated virus-3，GLRaV-3)与葡萄茎痘病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV)是葡萄上的两种重要病毒，给葡萄生产造成严重威胁。GLRaV-3具有半隐性特征，受感染的葡萄在大部分季节不能表现出明显症状，多数在秋季症状最为明显，表现为叶面翻卷，脉间变红或者变黄，只有主脉保持绿色。GLRaV-3会导致葡萄产量和含糖量降低、成熟期延迟、果实着色不良等。GRSPaV于1998年被确认，是一种发生普遍，危害严重的葡萄病毒，感染该病的葡萄植株会表现出开花延迟、生长衰退、嫁接成活率低等症状。随着GLRaV-3与GRSPaV的发生流行及其给葡萄生产带来的重大经济损失，实现快速灵敏的分析鉴定，是预防与控制病毒病的首要选择。因此，开发快速准确、简便经济的可以同时检测GLRaV-3与GRSPaV两种病毒的方法，是一项有现实意义的工作。

传统的GLRaV-3的检测方法为抽取病株DNA，以DNA模板，利用GLRaV-3的特异引物进行常规PCR检测(董雅凤，张尊平，杨俊玲，何峻，张少瑜.葡萄卷叶病毒3RT-PCR检测技术研究.中国果树，2005(6)：9-12)。传统GRSPaV的检测方法为抽取病毒RNA，将RNA反转录成cDNA，再以cDNA模板，利用GRSPaV的特异引物进行常规PCR检测(李西萍，牛建新，张强，赵英.葡萄茎痘病毒病的RT-PCR检测[J].果树学报，2005(06)：119-120)。利用上述传统方法检测GLRaV-3或GRSPaV侵染的植株，需要分别进行RT-PCR操作，在不同PCR体系中进行检测，操作步骤繁琐且耗时。

多重PCR(multiple PCR)技术又称多重引物PCR或复合PCR技术，是常规PCR技术的基础上改进和发展起来的一种新型的PCR扩增技术，是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个不同的DNA片段。本专利利用多重PCR技术，针对GLRaV-3的HSP70蛋白部分编码区和GRSPaV衣壳蛋白部分编码区的核酸序列设计扩增GLRaV-3和GRSPaV双重PCR特异引物，仅需样品的cDNA作为模板，便可在同一PCR体系中快速鉴别GLRaV-3和GRSPaV两种病毒，尤其对GLRaV-3和GRSPaV混合感染的植株更为实用。这种方法既保留了常规PCR方法的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂用量，大大提高了检测的效率，节省了检测的人力、物力和财力，在田间GLRaV-3或GRSPaV病毒的监测上具有独特的优势和极高的使用价值。

目前利用双重PCR技术构建快速鉴别GLRaV-3和GRSPaV的方法未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的双重PCR引物及方法。

一种鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的双重PCR引物，所述引物为两对，分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核普酸序列与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4与所示的核苷酸序列。

正义引物GLRaV-3-F：5’-TTGCCGCAGATATCTAAAGTCG-3’；SEQ ID NO.1

反义引物GLRaV-3-R：5’-GTTGTCCCGGGTACCAGATAT-3’；SEQ ID NO.2

正义引物GRSPaV-F：5’-AGCAGCCGGAAGGTTCTAATGC-3’；SEQ ID NO.3

反义引物GRSPaV-R：5’-CCAGCCGTTCCACCACTAATCTCT-3’；SEQ ID NO.4

一种鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的方法，步骤如下：

(1)提取待测样品的RNA，制得RNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的RNA为模板，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；

(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述的2对引物对cDNA进行双重PCR扩增，制得双重PCR扩增产物；

(4)对步骤(3)制得的双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当双重PCR产物电泳图谱显示被测样品有343bp和649bp两条条带出现时，则该被检测样品为鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒复合侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有343bp的一条条带时，则该被检测样品为葡萄卷叶病毒3侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有649bp的一条条带时，则该被检测样品为葡萄茎痘病毒侵染的植株。

优选的，所述步骤(3)中20μLPCR扩增的体系(所需部分试剂由北京天根生化科技购得)为：

模板2.0μL；浓度为2.5mM的dNTP 2.0μL；10×Taqbuffer 2.0μL；Taq酶0.3μL；浓度为0.1μM的引物各0.2μL；ddH2O补至20μL。

优选的，所述步骤(3)中PCR扩增的程序如下：

94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。

上述步骤(1)中提取病毒植株总RNA、步骤(2)中RNA反转录为cDNA和步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)。

有益效果

1、本发明所述鉴别GLRaV-3与GRSPaV的双重PCR引物均针对病毒必须的蛋白核酸序列设计，特异性高，在同一个PCR反应体系中，仅需要样品的cDNA模板便可同时扩增模板中GLRaV-3与GRSPaV基因，此方法减少了操作步骤及试剂用量，降低了检测成本，大大提高了两种病毒检测效率；

2、本发明从分子水平探索了快速检测GLRaV-3与GRSPaV两种病毒的方法，探索建立了同时检测GLRaV-3与GRSPaV两种病毒的双重PCR技术，为今后GLRaV-3与GRSPaV的动态鉴定、发生预警及综合防治奠定了基础。

说明书附图

图1是单一检测GLRaV-3的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图中M：2000bp DNALadder；1：感染GLRAV-3病毒的阳性植株；2：阴性对照；

图2是单一检测GRSPaV的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图中M：2000bp DNA Ladder；1：感染GRSPaV病毒的阳性植株；2：阴性对照；

图3是检测GLRaV-3与GRSPaV复合感染阳性植株双重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图中M：2000bp DNALadder；1：GRSPaV与GLRaV-3复合感染植株；2：阴性对照；

图4是实施例中双重PCR检测田间感染的产物琼脂糖凝胶电泳图；图中M：2000bpDNA Ladder；1：GRSPaV与GLRaV-3复合侵染阳性植株；2：健康植株；3，4，5，8，13，16，25：为田间疑似复合感染GRSPaV与GLRaV-3的植株；6、7、9、10、11、12、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24为田间疑似感染GLRaV-3的植株。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述的健康植株和阳性病毒株为贵州大学农业生物工程研究院分离所得植株，疑似植株为贵州凯里大风洞乡葡萄园种植植株；利用本发明所设计的引物及方法对上述植株进行病毒检测，部分植株为GRSPaV和GLRaV-3复合侵染植株。部分为GLRaV-3单独侵染植株。

实施例中所述的RNA提取试剂Trizol采购于invitrogen公司，cDNA的合成试剂Prime script RT reagent Kit采购于TaKaRa公司，其它试剂均为普通市售试剂。

实施例

一种鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的方法，步骤如下：

(1)提取GRSPaV与GLRaV-3侵染病毒植株样品的RNA，制得RNA溶液；按照Trizol(invitrogen，Carlsbad，CA，USA)试剂的步骤抽提RNA，具体操作如下：

取植物组织，置于液氮中迅速研磨，将植株的粉末约200mg迅速转移至lmL Trizol中；

2)室温放置5min；

3)每样品中加0.2mL氯仿，盖紧盖子，剧烈震荡15s，室温放置3min；

4)4℃12，000转离心15min，将上清转移到一新离心管中；

5)加0.5mL异丙醇，混匀，室温放置10min；

6)4℃12，000转离心15min；

7)加lmL75％乙醇，清洗沉淀，4℃12，000转离心smin，移除上清，风干沉淀即为RNA；

8)加适量DEPC水溶解RNA；

9)1.2％的琼脂糖凝胶检测RNA完整性，Nano Drop超微量核酸分析仪检测RNA浓度，-80℃保存备用。

(2)以步骤(1)制得的RNA为模板，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；cDNA的合成按照Prime script RT reagent Kit试剂盒(TaKaRa公司)的步骤进行，具体操作如下：

1)基因组DNA去除反应：在冰上配制反应液，使用10.0μL的反应体系。包括：

2.0μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNA Eraser，1.0μLTotal RNA，RNaseFree ddH₂O至10.0μL。

反应条件：42℃2min。

反转录的反应：冰上配制反应液，20.0μL的反应体系。

包括Reaction Solution from Step 110.0μL，Mastermix 10.0μL(5×Primescript Buffer 24.0μL，Primescript RT Enzyme Mix 11.0μL，RT Primer Mix 1.0μL，RNase Free ddH₂O 4.0μL)。反应条件：37℃15min，85℃5s，-20℃保存。

PCR扩增体系为：

cDNA溶液2μL；浓度为2.5mM的dNTP 2.0μL；10×Taqbuffer 2.0μL；Taq酶0.3μL；浓度为0.1μM的引物各0.2μL；ddH2O补至20μL。引物序列如下：

正义引物GLRaV-3-F：5’-TTGCCGCAGATATCTAAAGTCG-3’；SEQ ID NO.1；

反义引物GLRaV-3-R：5’-GTTGTCCCGGGTACCAGATAT-3’；SEQ ID NO.2；

正义引物GRSPaV-F：5’-AGCAGCCGGAAGGTTCTAATGC-3’；SEQ ID NO.3；

反义引物GRSPaV-R：5’-CCAGCCGTTCCACCACTAATCTCT-3’；SEQ ID NO.4；

PCR扩增条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30S，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。

(4)用1.2％琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)制得的双重PCR扩增产物进行检测，若是GLRaV-3植株均检测出一长度在343bp条带(如图1所示)，对该条带序列进行单向测序，GLRaV-3病毒植株得到的条带序列如SEQ ID No.5所示；若是GRSPaV植株均检测出一长度在649bp条带(如图2所示)，对该条带序列进行单向测序，GRSPaV病毒植株得到的条带序列如SEQ ID NO.6所示；若是GRSPaV&GLRaV-3共侵染植株均检测出长度在343bp和649bp两条条带(如图4所示)。该检测结果与实际结果完全一致。

GLRaV-3扩增长度为343bp的测序结果SEQ ID No.5：

TTGCCGCAGATATCTAAGGTCGTGTTCGACAGTACCGATTTTAGATGTTCGGTGGCTTGTGGGGCTAAGGTTTACTGCGATATTTTGGCAGGTAATAGCGGACTGAGACTGGTGGACACTTTAACGAATACGCTAACGGACGAGGTAGTGGATTTTCAGCCGGTGGTAATTTTCCCGAAAGGTAGTCCAATACCCTGTTCATATACTCATAGATACACAGTGGGTGGTGGAGATGTGGTATACGGTATATTTGAAGGGGAGAATAACAGAGCTTTTCTAAATGAACCGACGTTCCGGGGCGTATCGAAACGTAGGGGAGACTCAGTAGAGACCGACGTGGC

GRSPaV扩增长度为649bp的测序结果SEQ ID NO.6：

AGCAGCCGGAAGGTTCTAATGCACCACCTACTCTCAGTGGCATTCTTGCCAAACGCAAGAGGGTTATAGAGAATGCACTTTCAAAGACGGTGGACATGAGGGAGGTTTTGAAACACGAAACGGTGGTGATTTCCCCAAATGTCATGGATGAAGGTGCAATAGACGAGCTGATTCGTGCATTTGGTGAATCTGGCATAGCTGAGAGCGTGCAATTTGATGTGGCTATAGATATAGCACGTCACTGCTCTGATGCTGGTAGCTCCCAGAGGTCAACCCTGATAGGCAAGAGTCCATTTTGTGACCTAAACAGATCAGAAATAGCTGGGATTATAAGGGAGGTGACCACATTACGTAGATTTTGCATGTACTATGCAAAAATCGTGTGGAACATCCATCTGGAGACGGGGATACCACCAGCTAACTGGGCCAAGAAAGGATTTAATGAGAATGAAAAGTTTGCAGCCTTTGATTTTTTCTTGGGAGTCACAGATGAGAGTGCGCTTGAGCCAAGGGGTGGAATTAAAAGAGCTCCAACGAAAGCTGAGATGGTTGCTAATATCGCCTCTTTTGAGGTTCGAGTGCTCAGGCAAGCTATGGCTGAAGGCAAGCGGAGTTCCAACCTTGGAGAGATTAGTGGTGGAACGGCTGG

序列表

<110> 贵州大学

<120>一种鉴别葡萄卷叶病毒3和茎痘病毒的双重PCR引物及方法

<160> 6

<210> 1

<211>21

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

TTGCCGCAGATATCTAAAGTCG

<210> 2

<211>21

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

GTTGTCCCGGGTACCAGATAT

<210> 3

<211>22

<212> DNA

<213>人工合成

<400>3

AGCAGCCGGAAGGTTCTAATGC

<210> 4

<211>

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

CCAGCCGTTCCACCACTAATCTCT

<210> 5

<211>341

<212>DNA

<213>GLRaV-3

<400>5

TTGCCGCAGA TATCTAAGGT CGTGTTCGAC AGTACCGATT TTAGATGTTC GGTGGCTTGT 60

GGGGCTAAGG TTTACTGCGA TATTTTGGCA GGTAATAGCG GACTGAGACT GGTGGACACT 120

TTAACGAATA CGCTAACGGA CGAGGTAGTG GATTTTCAGC CGGTGGTAAT TTTCCCGAAA 180

GGTAGTCCAA TACCCTGTTC ATATACTCAT AGATACACAG TGGGTGGTGG AGATGTGGTA 240

TACGGTATAT TTGAAGGGGA GAATAACAGA GCTTTTCTAA ATGAACCGAC GTTCCGGGGC 300

GTATCGAAAC GTAGGGGAGA CTCAGTAGAG ACCGACGTGG C 341

<210> 6

<211>649

<212>DNA

<213>GRSPaV

<400>6

AGCAGCCGGA AGGTTCTAAT GCACCACCTA CTCTCAGTGG CATTCTTGCC AAACGCAAGA 60

GGGTTATAGA GAATGCACTT TCAAAGACGG TGGACATGAG GGAGGTTTTG AAACACGAAA 120

CGGTGGTGAT TTCCCCAAAT GTCATGGATG AAGGTGCAAT AGACGAGCTG ATTCGTGCAT 180

TTGGTGAATC TGGCATAGCT GAGAGCGTGC AATTTGATGT GGCTATAGAT ATAGCACGTC 240

ACTGCTCTGA TGCTGGTAGC TCCCAGAGGT CAACCCTGAT AGGCAAGAGT CCATTTTGTG 300

ACCTAAACAG ATCAGAAATA GCTGGGATTA TAAGGGAGGT GACCACATTA CGTAGATTTT 360

GCATGTACTA TGCAAAAATC GTGTGGAACA TCCATCTGGA GACGGGGATA CCACCAGCTA 420

ACTGGGCCAA GAAAGGATTT AATGAGAATG AAAAGTTTGC AGCCTTTGAT TTTTTCTTGG 480

GAGTCACAGA TGAGAGTGCG CTTGAGCCAA GGGGTGGAAT TAAAAGAGCT CCAACGAAAG 540

CTGAGATGGT TGCTAATATC GCCTCTTTTG AGGTTCGAGT GCTCAGGCAA GCTATGGCTG 600

AAGGCAAGCG GAGTTCCAAC CTTGGAGAGA TTAGTGGTGG AACGGCTGG 649

Claims

1.一种鉴别葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3)与葡萄茎痘病毒(GRSPaV)的双重PCR引物，其特征在于，所述引物为2对，分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

2.一种利用权利要求1所述的引物鉴别葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取待测样品的RNA，制得RNA溶液；

(4)对步骤(3)制得的双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当双重PCR产物电泳图谱显示被测样品有343bp和649bp两条条带出现时，则该被检测样品为葡萄卷叶病毒3与葡萄茎痘病毒复合侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有343bp的一条条带时，则该被检测样品为葡萄卷叶病毒3侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有649bp的一条条带时，则该被检测样品为茎痘病毒侵染的植株。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中20μLPCR扩增的体系为：模板2.0μL；浓度为2.5mM的dNTP 2.0μL；10×Taq buffer 2.0μL；Taq酶0.3μL；浓度为0.1μM的引物各0.2μL；ddH₂O补至20μL。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增的程序如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。