CN114350819A - 鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别引物对及其应用、鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别引物对及其应用、鉴别方法。所述特异性鉴别引物对包含碱基序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物以及碱基序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。采用该特异性鉴别引物对对鳖甲的水提取物制品DNA进行扩增，所得扩增产物不仅能用于鳖甲及其饮片的鉴别，还能用于鳖甲及其饮片的中药标准汤剂及其他水提取物制品的鉴别，使其与伪品的水提取物制品区别开来，解决了水提取物制品在失去形态后难以鉴别的难题。以该特异性鉴别引物对进行鉴别，专属性好，结果准确度高，为鳖甲及其饮片的中药标准汤剂和其他水提取物制品的用药安全与临床疗效提供保障。

Description

鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴 别引物对及其应用、鉴别方法
技术领域
本发明涉及中药质量检测技术领域，特别涉及一种鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别引物对及其应用、鉴别方法。
背景技术
中国药典2020年版规定，鳖甲来源鳖科动物鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲。鳖甲，始载于汉代《神农本草经》，列为中品，历代本草都有记载，具有滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结等功效，常用于阴虚发热、骨蒸劳热、阴虚阳亢、头晕目眩、虚风内动、手足瘈疭等症。现代药理学研究证实，鳖甲具有抗肿瘤、免疫调节、抗肝硬化、保肝等作用。
鳖甲作为常用中药，现市场上以同属和其混伪品做鳖甲药用情况较为普遍，如龟甲(Chinemys reevesii(Gray))、角鳖(Apalone spinifera)甲、佛罗里达鳖(Apaloneferox)甲、山瑞鳖(Trionyx steindachneri)、缘板鳖(Lissemys punctata)甲、宏鳖(Trionyx hurum)甲、平鳖(又称马来鳖，Dogania subplana)甲、鼋(Pelochelys bibroni)甲、巨鳖(Trionyx gangeticus)甲、非洲鳖(Trionyx triunguis)甲等，它们性状接近，形态相似，依靠传统的鉴别方法难度较大，鉴别准确性低，尤其是经过醋制成炮制品、经水提制成中药标准汤剂并进一步加工成中药配方颗粒后，由于失去药材性状，更加难以进行有效的鉴别。为保证鳖甲的临床用药质量和疗效，准确、快速地实现鉴别鳖甲及其饮片的水提取物制品(包括中药标准汤剂和中药配方颗粒)是非常必要的。
发明内容
基于以上技术问题，本发明的目的之一是提供一种特异性鉴别引物对，采用该特异性鉴别引物对对鳖甲的中药标准汤剂或者其他鳖甲水提取物制品DNA进行扩增，所得扩增产物能用于鳖甲及其饮片的水提取物制品如中药标准汤剂和中药配方颗粒的鉴别，使其与伪品的水提取物制品区别开来。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别引物对，所述特异性鉴别引物对包含碱基序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物以及碱基序列如SEQ IDNO:2所示的反向引物。
一种鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别试剂盒，所述试剂盒包含所述的特异性鉴别引物对，以及扩增试剂。
在其中一个实施例中，所述扩增试剂包含扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；所述扩增缓冲液为10×PCR Buffer I，所述DNA聚合酶为Taq酶。
一种鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，所述特异性鉴别方法包括如下步骤：
提取待测样品的DNA；
采用所述的特异性鉴别引物对或者所述的特异性鉴别试剂盒对所述DNA进行扩增，分离所得扩增产物，根据所得分离产物对所述待测样品进行特异性鉴别。
在其中一个实施例中，根据所得分离产物对所述待测样品进行特异性鉴别包括：
若所述分离产物包含236bp片段，则说明所述待测样品包含鳖甲，
若所述分离产物不包含236bp片段，则说明所述待测样品包含鳖甲伪品或者不含鳖甲。
在其中一个实施例中，所述鳖甲伪品包含龟甲、角鳖甲、佛罗里达鳖甲和山瑞鳖甲中的一种或者多种。
在其中一个实施例中，所述其他鳖甲水提物制品包含鳖甲中药标准汤剂。
在其中一个实施例中，扩增的退火温度为59℃～61℃。
在其中一个实施例中，扩增的反应体系包含：2.5μL含Mg2+的10×PCR Buffer I、2.5mmol/L dNTP、10μmol/L正向引物、10μmol/L反向引物、5U/μL Taq酶、30ng～50ng模板DNA和19.2μL水。
在其中一个实施例中，扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；最后72℃延伸5min。
与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明提供一种特异性鉴别引物对，采用该特异性鉴别引物对对鳖甲的水提取物制品DNA进行扩增，所得扩增产物不仅能用于鳖甲及其饮片的鉴别，还能用于鳖甲及其饮片的水提取物制品(包括中药标准汤剂和中药配方颗粒)的鉴别，使其与伪品的水提取物制品区别开来，解决了水提取物制品在失去形态后难以鉴别的难题。以该特异性鉴别引物对进行鉴别，专属性好，结果准确度高，为鳖甲及其饮片的中药配方颗粒及其他水提取物制品的用药安全与临床疗效提供保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例根据参考文献中的引物对鳖甲及伪品样品进行试验的结果；图1中，M.DNA maker DL 1000，1.鳖甲药材G2003054，2.鳖甲药材G2003056，3.龟甲药材G1810179，4.龟甲药材G1810182，5.佛罗里达鳖药材G2011026，6.佛罗里达鳖药材G2011027，7.山瑞鳖药材G2011028，8.空白(ddH2O)；
图2为本发明一个实施例采用特异性鉴别引物对对不同检测对象进行检测的结果；图2中，M.DNA maker DL 1000，1.鳖甲对照药材，2-16.鳖甲药材，17-18.醋鳖甲饮片，19-25.鳖甲标准汤剂，26-27.醋鳖甲标准汤剂，28-30.鳖甲配方颗粒，31-32.醋鳖甲配方颗粒，33-34.龟甲药材，35-36.角鳖药材，37-38.佛罗里达鳖药材，39.山瑞鳖药材，N.空白(ddH2O)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
出于说明本发明各种实施方式的目的给出如下实施例，并非意图以任何方式限制本发明。本领域技术人员将理解，如权利要求的范围所限定的，其中的变化和其它用途包括在本发明精神范围内。下列实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实施例中所提到的启动子和终止子序列也可以从NCBI下载获得，具体序列起始位置可根据引物表中的引物获悉。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本发明所涉及水提物制品主要是指用鳖甲或者鳖甲饮片的水提物制备的中药制品，该水提物是通过在加热的条件下以水为提取水剂(例如：用水煎煮)对鳖甲或者鳖甲饮片进行提取制备得到的。本发明中的水提物制品包括标准汤剂、中药配方颗粒。
传统的基于PCR鉴别鳖甲的技术方案主要局限于鳖甲药材及鳖甲饮片的鉴别。例如：CN108018362A公开的一组鉴定鳖甲的特异性引物，该组特异性引物针对鳖甲及佛罗里达鳖药材设计，与公开已知的特异性引物相比，能对同一亚目的不同物种进行区分，可以实现对伪品的区分；此外，扩增的目的产物≤120bp，但条件适用于鳖甲基原、药材、饮片及其掺伪品。再例如：CN103074433A公开一种鳖甲DNA检测试剂盒及基于该试剂盒的鉴定方法，该试剂盒主要针对药材，以同时出现1000bp和500bp条带为依据来鉴别正品鳖甲。然而，采用PCR鉴别鳖甲及其饮片的水提物制品还存在技术空白。
相对于将PCR技术用于鳖甲药材及鳖甲饮片的鉴别，采用PCR技术鉴别鳖甲及其饮片的水提物制品和配方颗粒的难度要大得多，因此，目前鳖甲/醋鳖甲的中药标准汤剂和中药配方颗粒的特异性PCR鉴别暂未见报道。在该情况下，参考传统的DNA样本设计引物、扩增的方法往往难以获得理想结果，因此适用于鳖甲/醋鳖甲的药材和饮片的PCR鉴定方法难以适用于相应中药标准汤剂和中药配方颗粒。
为此，发明人提供了一种特异性鉴别引物对，用该引物对对待测鳖甲/醋鳖甲水提物制品如中药标准汤剂和中药配方颗粒的DNA进行扩增，所得扩增产物中包含一约236bp的DNA片段，而鳖甲伪品对应的水提物制品则不含该约236bp的DNA片段，据此结果可以鉴别出待测鳖甲/醋鳖甲水提物制品是否为鳖甲/醋鳖甲水提物制品的正品。同时，本申请的特异性鉴别引物也适用于鳖甲/醋鳖甲的原料鉴别。
第一方面，本发明提供一种鳖甲及其饮片和水提物制品的特异性鉴别引物对，所述特异性鉴别引物对包含碱基序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物以及碱基序列如SEQ IDNO:2所示的反向引物。
本发明提供的引物对，其退火温度为59℃～61℃。
采用本发明提供的特异性鉴别引物对对鳖甲的中药标准汤剂及其他水提取物制品DNA进行扩增，所得扩增产物不仅能用于鳖甲及其饮片的鉴别，还能用于鳖甲及其饮片的水提取物制品(包括中药标准汤剂和中药配方颗粒)的鉴别，使其与伪品的水提取物制品区别开来，解决了水提取物制品在失去形态后难以鉴别的难题。以该特异性鉴别引物对进行鉴别，专属性好，结果准确度高，为鳖甲及其饮片的中药标准汤剂或其他水提取物制品的用药安全与临床疗效提供保障。
第二方面，本发明提供一种鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的特异性鉴别引物对，以及扩增试剂。
在其中一个示例中，所述扩增试剂包含扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；所述扩增缓冲液为10×PCR Buffer I，所述DNA聚合酶为Taq酶。可以理解的是，本发明所述扩增试剂中的水为灭菌水。
第三方面，本发明提供一种鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，所述特异性鉴别方法包括如下步骤：
提取待测样品的DNA；
采用所述的特异性鉴别引物对或者所述的特异性鉴别试剂盒对所述DNA进行扩增，分离所得扩增产物，根据所得分离产物对所述待测样品进行特异性鉴别。
本发明提供的特异性鉴别方法中，根据所得分离产物对所述待测样品进行特异性鉴别包括：
若所述分离产物包含236bp片段，则说明所述待测样品包含鳖甲，
若所述分离产物不包含236bp片段，则说明所述待测样品包含鳖甲伪品或者不含鳖甲。
本发明所述的鳖甲伪品，可以为，包括但不限于：龟甲、角鳖甲、佛罗里达鳖甲、山瑞鳖甲。
在其中一个示例中，所述其他鳖甲水提物制品包含鳖甲中药标准汤剂。
在其中一个示例中，扩增的退火温度为59℃～61℃。
在其中一个示例中，扩增的反应体系包含：2.5μL含Mg2+的10×PCR Buffer I、2.5mmol/L dNTP、10μmol/L正向引物、10μmol/L反向引物、5U/μL Taq酶、30ng～50ng模板DNA和19.2μL水。
在其中一个示例中，扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；最后72℃延伸5min。
在其中一个示例中，所述待测样品为鳖甲样待测品或者鳖甲饮片样待测品，提取所述DNA采用SDS-蛋白酶K法。
在其中一个示例中，所述待测样品为水提物制品，提取所述DNA采用CTAB法，所述CTAB法采用的CTAB提取液中添加有蛋白酶K。如上提到的，本发明所述的水提取制品是指鳖甲或鳖甲饮片在水中经煎煮等加热工序炮制而成的产品，可以选自，包括但不限于：鳖甲中药标准汤剂、鳖甲中药配方颗粒、醋鳖甲中药标准汤剂和醋鳖甲中药配方颗粒。这些水提取制品，其在制备过程中，由于加热使其结构破坏，DNA降解程度类似古DNA样品。采用本发明的提取DNA的方法，能够从DNA破坏的待测品中提到所需含量的DNA用于后续扩增。并且，采用所述的CTAB法提取DNA的过程中，能够有效避免中药配方颗粒中所含辅料对DNA提取带来的干扰。
本发明所述的饮片可以为，但不限于醋鳖甲。
本发明所述的水提取制品是指鳖甲或鳖甲饮片在水中经煎煮等加热工序炮制而成的产品，可以选自，包括但不限于：鳖甲中药标准汤剂、鳖甲中药配方颗粒、醋鳖甲中药标准汤剂和醋鳖甲中药配方颗粒。
实施例1
一、样品列表
表1
Figure BDA0003471498560000091
Figure BDA0003471498560000101
Figure BDA0003471498560000111
Figure BDA0003471498560000121
二、药材、冻干粉及中药配方颗粒的DNA的提取
(1)药材和饮片的DNA的提取
取鳖甲药材、醋鳖甲饮片及常见伪品0.05g，研磨使成粉末，置2mL离心管中，加入1.0mL SDS裂解液(50mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，250mmol/L EDTA，1％SDS)和10μL蛋白酶K，涡旋振荡混匀后于56℃孵育4小时～6小时。
取出，冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，充分混匀呈乳白色，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟，吸取上清液800μL～1000μL于新的2mL离心管中，自“加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)”起重复操作一次。吸取上清液600μL～800μL，自“加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)”起重复操作一次。吸取上清液400μL～600μL于1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，在零下20℃静置60～90分钟。取出，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液，用75％(v/v)乙醇洗涤沉淀3次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，在37℃下孵育30分钟，待乙醇挥发后，加灭菌水50μL使溶解，作为供试品溶液，置4℃保存或置零下20℃长期保存。
(2)中药标准汤剂和中药配方颗粒的DNA的提取
取醋鳖甲冻干粉、配方颗粒样品0.1g，研磨使成粉末，置2mL离心管中，加入1.2mL56℃预热的CTAB沉淀液，混匀，56℃水浴加热60min，冷却至室温后，以12000r/min离心5min，弃上清液，再加入CTAB沉淀液1.2mL同法操作。向该离心管中依次加入900μL CTAB提取液、10μL蛋白酶K、10μLβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴加热120min。取出离心管，待冷却至室温后加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24﹕1)，涡旋混匀，以12000r/min，4℃离心10min，取上清液800μL加入新的2mL离心管中，重复操作一次，再取上清液600μL于1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇或异丙醇-3mol/L乙酸钠，于-20℃静置60min。取出该离心管以12000r/min离心5min，弃上清液，分别用75％乙醇洗涤沉淀3次及无水乙醇洗涤2次，以12000r/min离心5min，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加灭菌水30μL使溶解，置4℃保存或置零下20℃长期保存。
(3)DNA浓度测定
取上述DNA样品，采用BioSpec-nano微量紫外分光光度计测定DNA浓度，同时记录OD260/OD230，OD260/OD280，并调整浓度到50ng/μL～100ng/μL。
三、鉴别
(1)序列分析及引物设计
根据参考文献中的引物对鳖甲及伪品样品进行试验，结果见图1，图1中，M.DNAmaker DL 1000，1.鳖甲药材G2003054，2.鳖甲药材G2003056，3.龟甲药材G1810179，4.龟甲药材G1810182，5.佛罗里达鳖药材G2011026，6.佛罗里达鳖药材G2011027，7.山瑞鳖药材G2011028，8.空白(ddH2O)。
注：文献引物来自[1]程素倩,袁媛,刘富艳,等.特异性PCR方法鉴别鳖甲药材和饮片[J].中国中药杂志,2018,43(23)：4569-4574.
[2]李楠,虞平添,焦兆群,等.特异性扩增技术鉴定龟甲与鳖甲[J].中成药,2018,40(10):2328-2333.
表2
Figure BDA0003471498560000141
根据图1可知，参考文献中的引物并未能实现本研究的鳖甲特异性鉴别，故对鳖甲特异性引物进行重新设计。
以中国药典2020年版鳖的Cytochrome Oxidase I序列分析为基础，利用BioEdit软件对GeneBank数据库中鳖的Cytochrome Oxidase I序列进行同源比对，校对后分析鳖的特异性SNP位点，将包含SNP位点的碱基序列导入到Primer Premier 5软件中，进行引物设计。
经序列对比发现，鳖的特异性位点为C而其他为A或T，确定该SNP位点后，使SNP位点接近正向引物3’端，通过移动上游引物位置，调节引物得分及GC含量，并借助PrimerPremier 5软件，进一步调节反向引物位置，通过最终引物评分、产物条带得分以确定最佳组合。
表3
Figure BDA0003471498560000151
考虑到经高温提取后，对DNA碱基序列的破坏作用，最终得到经特异性PCR扩增后，鳖甲的条带长度约为236bp。
(2)PCR扩增及电泳
PCR扩增的反应体系为25μL，包括：
Figure BDA0003471498560000152
将反应体系振荡混匀，瞬时离心。将反应体系置PCR仪上。
其扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；最后72℃延伸5min。
待PCR扩增反应结束后，向反应体系加5μL 6×loading buffer，混匀，取混合产物8μL点样于1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶上，于150V电压的条件下电泳25min，经GelRed显色，最后于凝胶成像仪观察记录结果。
结果见图2，图2中，M.DNA maker DL 1000，1.鳖甲对照药材，2-16.鳖甲药材，17-18.醋鳖甲饮片，19-25.鳖甲标准汤剂，26-27.醋鳖甲标准汤剂，28-30.鳖甲配方颗粒，31-32.醋鳖甲配方颗粒，33-34.龟甲药材，35-36.角鳖药材，37-38.佛罗里达鳖药材，39.山瑞鳖药材，N.空白(ddH2O)。
根据图2可知：在200bp～300bp处，鳖甲药材、醋鳖甲饮片、鳖甲标准汤剂、醋鳖甲标准汤剂、鳖甲配方颗粒、醋鳖甲配方颗粒在与鳖甲对照药材的相同位置上有单一的条带，而其他伪品和空白均没有条带出现。
综上，本发明提供了特异性鉴别引物对，采用该特异性鉴别引物对对鳖甲的中药配方颗粒剂或其他水提取物制品DNA进行扩增，所得扩增产物不仅能用于鳖甲及其饮片的鉴别，还能用于鳖甲及其饮片的水提取物制品如中药标准汤剂和中药配方颗粒的鉴别，使其与伪品的水提取物制品区别开来，解决了水提取物制品在失去形态后难以鉴别的难题。以该特异性鉴别引物对进行鉴别，专属性好，结果准确度高，为鳖甲及其饮片的水提取物制品的用药安全与临床疗效提供保障。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 广东一方制药有限公司
<120> 鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别引物对及其应用、鉴别方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctacccccct cattactact tctc 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgggagttt ggtattgtga 20

Claims (10)

1.一种鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别引物对，其特征在于，所述特异性鉴别引物对包含碱基序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物以及碱基序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
2.一种鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的特异性鉴别引物对，以及扩增试剂。
3.根据权利要求2所述的鳖甲及其饮片、中药配方颗粒和其他水提物制品的特异性鉴别试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包含扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；所述扩增缓冲液为10×PCR Buffer I，所述DNA聚合酶为Taq酶。
4.一种鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，其特征在于，所述特异性鉴别方法包括如下步骤：
提取待测样品的DNA；
采用权利要求1所述的特异性鉴别引物对或者权利要求2或者3所述的特异性鉴别试剂盒对所述DNA进行扩增，分离所得扩增产物，根据所得分离产物对所述待测样品进行特异性鉴别。
5.根据权利要求4所述的鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，其特征在于，根据所得分离产物对所述待测样品进行特异性鉴别包括：
若所述分离产物包含236bp片段，则说明所述待测样品包含鳖甲；
若所述分离产物不包含236bp片段，则说明所述待测样品包含鳖甲伪品或者不含鳖甲。
6.根据权利要求5所述的鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，其特征在于，所述鳖甲伪品选自龟甲、角鳖甲、佛罗里达鳖甲和山瑞鳖甲中一种或者多种。
7.根据权利要求5所述的鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，其特征在于，所述其他鳖甲水提物制品包含鳖甲中药标准汤剂。
8.根据权利要求4至7任一项所述的鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，其特征在于，扩增的退火温度为59℃～61℃。
9.根据权利要求8所述的鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，其特征在于，扩增的反应体系包含：2.5μL含Mg2+的10×PCR Buffer I、2.5mmol/L dNTP、10μmol/L正向引物、10μmol/L反向引物、5U/μL Taq酶、30ng～50ng模板DNA和19.2μL水。
10.根据权利要求8所述的鳖甲、鳖甲饮片、鳖甲中药配方颗粒或其他鳖甲水提物制品的特异性鉴别方法，其特征在于，扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；最后72℃延伸5min。
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